專利名稱：一株用于堿性果膠酶生產(chǎn)的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株用于堿性果膠酶生產(chǎn)的工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，包括原果膠，果膠酸和果膠酯酸。果膠物質(zhì)的存在可以增加植物細(xì)胞壁的堅(jiān)硬度，有利于維持植物的特定外形結(jié)構(gòu)，但增加了對(duì)植物進(jìn)行深加工的工業(yè)操作的難度。果膠酶是指能夠分解果膠質(zhì)的一類酶，普遍存在于自然界的高等植物和微生物中，是重要的工業(yè)酶制劑。堿性果膠酶(EC :4. 2. 2. 2)是一類在堿性條件下，以反式消去作用斷開果膠質(zhì)主鏈，產(chǎn)生不飽和的寡聚半乳糖醛酸的酶，在紡織工業(yè)的麻類脫膠、棉織品精煉等領(lǐng)域內(nèi)有著廣泛的應(yīng)用。相比于傳統(tǒng)的高堿、高溫處理手段，使用堿性果膠酶不僅對(duì)果膠質(zhì)有較好的去除作用，對(duì)天然纖維素纖維損傷較小，而且可以減少材料消耗和環(huán)境負(fù)擔(dān)，為紡織工業(yè)開辟了 一條綠色清潔之路。國內(nèi)對(duì)于堿性果膠酶的的研究大多集中在野生產(chǎn)酶菌株的篩選以及發(fā)酵條件優(yōu)化等方面，但野生菌的生產(chǎn)能力與工業(yè)應(yīng)用的需求尚有一定的距離。利用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶可以很好的填補(bǔ)這一空白。近年來，出現(xiàn)了用重組畢赤酵母表達(dá)堿性果膠酶的報(bào)道， 但這種技術(shù)發(fā)酵周期長、能耗大。因此構(gòu)建發(fā)酵周期短、操作簡(jiǎn)單的工程菌株成為堿性果膠酶工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株用于堿性果膠酶的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，命名為BL21 (DE3) PGL04,已于2012年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 5697。大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)PGL04 CGMCC No. 5697簡(jiǎn)稱大腸埃希氏菌BL21 (DE3) PGL04。所述大腸埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04可用于生產(chǎn)堿性果膠酶。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，包括如下步驟(I)將大腸埃希氏菌BL21 (DE3) PGL04接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，得到OD6tltol = O. 1-0. 2 (如O. 1-0. 15或O. 15-0. 2)的發(fā)酵初始體系；(2)將發(fā)酵初始體系進(jìn)行如下發(fā)酵先35-37°C (如35_36°C或36_37°C )振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)(如3-4小時(shí)或4-5小時(shí))，然后加入IPTG至終濃度為50-100 μ M(如50-75 μ M 或 75-100 μ Μ)，25-30°C (如 25-28。?；?28-30°C )繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 40-48 小時(shí)(如 40-45 小時(shí)或45-48小時(shí))，得到堿性果膠酶。所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下取10_15g(如10_12g或12_15g)胰蛋白胨、15-23g(如 15-19g 或 19-23g)酵母提取物、5_10g(如 5_7g 或 7-10g)氯化鈉、10_15g(如
10-12g 或 12-15g)甘油、10-17mM(如 10_14mM 或 14_17mM)磷酸二氫鉀和 65_75mM(如 65-70mM或70-75mM)磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至1L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH可為7. 0-7. 2 (如7. 0-7. I或7. 1-7. 2)。所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04可以以種子液的方式接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。所述種子液的制備方法如下將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養(yǎng)基，35-370C (如 35-36。?；?36-37°C )振蕩培養(yǎng)至 OD600nm = 3-6 (如 3-4. 5 或 4. 5-6)，即為種子液。所述種子培養(yǎng)基的制備方法如下取10_15g(如10_13g或13_15g)胰蛋白胨、 5-8g (如5-7g或7-8g)酵母提取物和5-10g (如5_7g或7_10g)氯化鈉，用水溶解并定容至 1L。所述種子培養(yǎng)基的pH可為7. 0-7. 2 (如7. 0-7. I或7. 1-7. 2)。以上任一所述振蕩培養(yǎng)可為100-200r/min(如 100_150r/min 或 150_200r/min)
的振蕩培養(yǎng)。以上任一所述方法生產(chǎn)得到的堿性果膠酶均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述堿性果膠酶可用于降解多聚半乳糖醛酸。所述堿性果膠酶可用于以多聚半乳糖醛酸為底物生產(chǎn)不飽和多聚半乳糖醛酸。所述堿性果膠酶為具有如下功能的物質(zhì)在堿性環(huán)境(如pH9. 4)中，將多聚半乳糖醛酸轉(zhuǎn)化為不飽和多聚半乳糖醛酸。本發(fā)明提供工程菌和方法可用于生產(chǎn)堿性果膠酶，具備潛在工業(yè)化價(jià)值(如麻類脫膠、生物制漿、環(huán)境保護(hù)等行業(yè))，為后續(xù)的工業(yè)化研究奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例I、工程菌的獲得和保藏一、工程菌的獲得I、提取土壤的全基因組DNA。2、根據(jù)堿性果膠酶相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。3、以全基因組DNA為模板，用步驟2設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4、將步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新基因。5、將新基因插入載體pET28b的NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。6、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到一株重組菌(工程菌)，命名為 BL2UDE3)PGL04。二、工程菌的保藏
BL21(DE3)PGL04 屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。BL21 (DE3)PGL04 已于2012年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 5697。大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)PGL04 CGMCC No. 5697簡(jiǎn)稱大腸埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04。實(shí)施例2、應(yīng)用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶一、培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基(pH7. O) -M IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化鈉，用水溶解并定容至 IL ;121°C滅菌 30min。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7. O):取IOg胰蛋白胨、15g酵母提取物、5g氯化鈉、IOg甘油、IOmM 磷酸二氫鉀和65mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。二、應(yīng)用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶I、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養(yǎng)基，35°C振蕩培養(yǎng)(IOOr/ min)至OD6citlnm = 3,即為種子液。 2、將步驟I的種子液接種至40mL發(fā)酵培養(yǎng)基(采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm =
O.I的發(fā)酵初始體系；發(fā)酵過程如下(共43小時(shí))先35°C振蕩培養(yǎng)(100r/min)3小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為50 μ M繼續(xù)25°C振蕩培養(yǎng)(100r/min)40小時(shí)。3、將完成步驟2的發(fā)酵體系離心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活測(cè)定將步驟二得到的上清液用甘氨酸-NaOH緩沖液(O. 2mol/L, pH9. 4)稀釋后進(jìn)行酶活測(cè)定，具體方法如下實(shí)驗(yàn)組在2ml溶液甲中加入20 μ L待測(cè)溶液，45°C反應(yīng)15min，加入3mL0. 03mol/ L H3PO4水溶液(終止液)，測(cè)定235nm的吸光度值；對(duì)照組在2ml溶液甲中依次加入3mL O. 03mol/L H3PO4水溶液和20 μ L待測(cè)溶液，測(cè)定235nm的吸光度值。溶液甲的配方含O. 2g/100ml多聚半乳糖醒酸(購自Sigma-Aldrich公司，貨號(hào) 81325-50G)和 O. 44mmol/L CaCl2 的甘氨酸-NaOH 緩沖液(O. 2mol/L, ρΗ9· 4)。堿性果膠酶一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位(IU)定義為在上述條件下，Imin反應(yīng)時(shí)間內(nèi)使 PGA產(chǎn)生I μ mo I的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。堿性果膠酶酶活(U/mL)計(jì)算公式如下
PGL咖+_ =獅ΥΙΟ、稀釋倍數(shù)X'
IO3 χ χ4600χ χ V1 Δ OD235 =實(shí)驗(yàn)組235nm的吸光度值-對(duì)照組235nm的吸光度值；4600為不飽和聚半乳糖醒酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù),單位為L · moF1 · cnT1 ；t為酶促反應(yīng)時(shí)間(在酶反應(yīng)的線性范圍內(nèi))，單位為min，本實(shí)驗(yàn)中為15min ；b為比色杯厚度，單位為cm，本實(shí)驗(yàn)中為Icm ；V0為體系總體積數(shù)，單位為mL，本實(shí)驗(yàn)中為5. 02mL ；V1為酶液體積數(shù)，單位為mL，本實(shí)驗(yàn)中為0. 02mL。步驟二得到的上清液的堿性果膠酶酶活力為600U/mL。
5
實(shí)施例3、應(yīng)用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶一、培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基(pH7. 2) -M 15g胰蛋白胨、8g酵母提取物和IOg氯化鈉，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7. 2):取15g胰蛋白胨、23g酵母提取物、IOg氯化鈉、15g甘油、 17mM磷酸二氫鉀和75mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。二、應(yīng)用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶I、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)(200r/ min)至OD6citlnm = 6,即為種子液。2、將步驟I的種子液接種至20mL發(fā)酵培養(yǎng)基(采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm =
O.2的發(fā)酵初始體系；發(fā)酵過程如下(共53小時(shí))先37°C振蕩培養(yǎng)(200r/min)5小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為100 μ M繼續(xù)30°C振蕩培養(yǎng)(200r/min)48小時(shí)。3、將完成步驟2的發(fā)酵體系離心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活測(cè)定同實(shí)施例2的步驟三。步驟二得到的上清液的堿性果膠酶酶活力為800U/mL。實(shí)施例4、應(yīng)用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶一、培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基(pH7. I):取13g胰蛋白胨、7g酵母提取物和7g氯化鈉，用水溶解并定容至 IL ;121°C滅菌 30min。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7. I):取12g胰蛋白胨、19g酵母提取物、7g氯化鈉、12g甘油、14mM 磷酸二氫鉀和70mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。二、應(yīng)用工程菌生產(chǎn)堿性果膠酶I、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養(yǎng)基，36°C振蕩培養(yǎng)(150r/ min)至 OD6citlnm = 4. 5,即為種子液。2、將步驟I的種子液接種至30mL發(fā)酵培養(yǎng)基(采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm =
O.15的發(fā)酵初始體系；發(fā)酵過程如下(共49小時(shí))先36°C振蕩培養(yǎng)(150r/min)4小時(shí)， 然后加入IPTG至終濃度為75 μ M繼續(xù)28°C振蕩培養(yǎng)(150r/min)45小時(shí)。3、將完成步驟2的發(fā)酵體系離心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活測(cè)定同實(shí)施例2的步驟三。步驟二得到的上清液的堿性果膠酶酶活力為700U/mL。
權(quán)利要求
1.大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)PGL04，它的保藏編號(hào)為CGMCC No.5697。
2.權(quán)利要求I所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04在生產(chǎn)堿性果膠酶中的應(yīng)用。
3.—種生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，包括如下步驟(1)將權(quán)利要求I所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，得到OD6tltol =O. 1-0. 2的發(fā)酵初始體系；(2)將發(fā)酵初始體系進(jìn)行如下發(fā)酵先35-37°C振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為50-100 μ M，25-30°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)40-48小時(shí)，得到堿性果膠酶。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下取10-15g 胰蛋白胨、15_23g酵母提取物、5-10g氯化鈉、10-15g甘油、10-17mM磷酸二氫鉀和65_75mM 磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至1L。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04以種子液的方式接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述種子液的制備方法如下將所述大腸埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04接種至種子培養(yǎng)基，35-37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltol = 3-6,即為種子液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的制備方法如下取 10_15g胰蛋白胨、5-8g酵母提取物和5-10g氯化鈉，用水溶解并定容至 >1L。
8.權(quán)利要求3至7中任一所述方法生產(chǎn)得到的堿性果膠酶。
9.權(quán)利要求8所述堿性果膠酶在降解多聚半乳糖醛酸中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述堿性果膠酶在以多聚半乳糖醛酸為底物生產(chǎn)不飽和多聚半乳糖醛酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株用于堿性果膠酶的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，命名為BL21(DE3)PGL04，保藏號(hào)為CGMCC No.5697。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，包括如下步驟(1)將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，得到OD600nm＝0.1-0.2的發(fā)酵初始體系；(2)將發(fā)酵初始體系進(jìn)行如下發(fā)酵先35-37℃振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為50-100μM，25-30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)40-48小時(shí)，得到堿性果膠酶。本發(fā)明提供工程菌可用于生產(chǎn)堿性果膠酶，進(jìn)一步可用于麻類脫膠產(chǎn)業(yè)。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102586158SQ201210064448
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者宋江寧, 李小曼, 王輝林, 馬延和 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所