專利名稱：一種誘導(dǎo)人臍血cd34+細(xì)胞分化為朗格罕斯細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過含有粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，腫瘤壞死因子α(TNF-α )，干細(xì)胞因子(SCF)和FMS樣酪氨酸酶3配體(Flt3L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)臍血CD34+細(xì)胞，使它們分化朗格罕斯細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方法，并且由此產(chǎn)生的朗格罕斯細(xì)胞具有純度高、產(chǎn)量大的特點(diǎn)，并具有識別、攝取、加工和處理抗原的能力，啟動免疫應(yīng)答的功能。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞具有在培養(yǎng)基中無限分裂的能力，并且在特異性的分化刺激的刺激下產(chǎn)生構(gòu)成組織的特化細(xì)胞。根據(jù)它們的分化潛能，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和組織特異性干細(xì)胞。ES細(xì)胞是在胚泡期從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)分離而來，并且是多潛能的，即它們實(shí)際上能夠分化為在生物體中發(fā)現(xiàn)的全部類型的細(xì)胞。相反，組織特異性干細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中器官形成的階段出現(xiàn)，并且它們是器官特異性的和多功能的，即它們通常定向產(chǎn)生構(gòu)成特定器官的細(xì)胞。這些組織特異性干細(xì)胞在大多數(shù)成年人器官中保留并履行不斷補(bǔ)充正常或病理性發(fā)生的細(xì)胞損失的關(guān)鍵任務(wù)。代表性的組織特異性干細(xì)胞包括在骨髓中存在的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。造血干細(xì)胞產(chǎn)生各種血細(xì)胞如紅細(xì)胞和白細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)締組織細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞。幾年來，由于人胚胎干細(xì)胞的成功分離，干細(xì)胞的臨床應(yīng)用已經(jīng)吸引越來越多的興趣。干細(xì)胞最值得注意的潛在應(yīng)用是它們作為細(xì)胞替代治療的細(xì)胞供應(yīng)的理想來源。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)能夠使臍血CD34+細(xì)胞分化成高純度及高產(chǎn)量的朗格罕斯細(xì)胞的物質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)GM-CSF、TNE- a、SCF和Flt3L聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)臍血單核細(xì)胞成為具有識別、攝取、加工和處理抗原的能力，啟動機(jī)體免疫應(yīng)答的朗格罕斯細(xì)胞。目前尚未報道通過在含有GM-CSF、TNE- a、SCF和Flt3L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，能夠使臍血CD34+細(xì)胞分化為高純度、高產(chǎn)量及具有識別、攝取、加工和處理抗原的能力，啟動免疫應(yīng)答功能的朗格罕斯細(xì)胞。具體應(yīng)用于在制備具有識別、攝取、加工和處理抗原及啟動免疫應(yīng)答功能的生物材料；所制備的生物材料將作為人造皮膚或皮膚移植中的輔助材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使臍血CD34+細(xì)胞分化為高純度、高產(chǎn)量及具有識別、攝取、加工和處理抗原的能力，啟動機(jī)體免疫應(yīng)答功能的朗格罕斯細(xì)胞的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種誘導(dǎo)人臍血CD34+細(xì)胞分化為朗格罕斯細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其步驟如下
O首先從人的臍血中分離出人臍血單個核細(xì)胞，然后對單個核細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選，得到⑶34+細(xì)胞。
2)在添加粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α、干細(xì)胞因子和FMS樣酪氨酸激酶3配體的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述⑶34+細(xì)胞。3)將所述培養(yǎng)基在37°C，5%C02條件下，培養(yǎng)至少6天，每2 3天更換一次培養(yǎng)液，獲得朗格罕斯細(xì)胞。
上述的朗格罕斯細(xì)胞能夠在制備具有識別、攝取、加工和處理抗原及啟動免疫應(yīng)答功能的生物材料中的應(yīng)用。所述生物材料可以為人造皮膚或皮膚移植中的輔助材料
在本發(fā)明中，GM-CSF是維持朗格罕斯細(xì)胞發(fā)育及分化的最根本的細(xì)胞因子；TNF-a則抑制培養(yǎng)細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，并維持朗格罕斯細(xì)胞于未成熟狀態(tài)，使其具有強(qiáng)的抗原提呈作用；實(shí)驗(yàn)證明=GM-CSF和TNF-α聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)臍血單個核細(xì)胞成為具有未成熟表型的朗格罕斯細(xì)胞。如果在相同但缺少GM-CSF和TNF-α情況下，細(xì)胞不能分化為朗格罕斯細(xì)胞。另外如果只用GM-CSF和TNF-α處理它們，則其增殖受到抑制。SCF和Flt3L加入含有GM-CSF和TNF- α的培養(yǎng)基中，則可見顯著地增加朗格罕斯細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量和增大朗格罕斯細(xì)胞的集落。該結(jié)果提示在培養(yǎng)臍血CD34+細(xì)胞以獲得朗格罕斯細(xì)胞的本發(fā)明的方法中，GM-CSF和TNF- α刺激干細(xì)胞分化為朗格罕斯細(xì)胞，SCF和Flt3L刺激細(xì)胞增殖。另夕卜，當(dāng)只使用所述因子的一種時不能獲得充足的朗格罕斯細(xì)胞。


圖 I 為在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天的朗格罕斯細(xì)胞的貼壁細(xì)胞的顯微照片(X100)；
圖 2 為在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天的朗格罕斯細(xì)胞的貼壁細(xì)胞的顯微照片(X100)；
圖3為4種方案培養(yǎng)6天、12天后的⑶Ia+的細(xì)胞百分比；
圖4為4種方案培養(yǎng)12天后的HLA-DR+的細(xì)胞百分比；
圖5為4種方案培養(yǎng)12天后的CD80+的細(xì)胞百分比；
圖6為4種方案培養(yǎng)12天后的⑶40+的細(xì)胞百分比；
圖 7 為在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天的朗格罕斯細(xì)胞表型(⑶la)、抗原提呈分子(HLA-DR)和共刺激分子(⑶80、⑶40)的流式細(xì)胞檢測結(jié)果；
圖 8 為在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天的朗格罕斯細(xì)胞掃描電鏡結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I分離臍血中的⑶34+細(xì)胞 I.人臍血單個核細(xì)胞的分離
①避光情況下，15mL離心管中加入IOmL人淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077)，將51^臍血小心加在淋巴細(xì)胞分離液上，并形成清楚的界面。②室溫,水平離心400g (2500rmp , r=14. 5 cm) , 25min。③此時可見離心管中形成5層最上面是血漿，血漿層和淋巴細(xì)胞分離液之間的白色霧狀層是單個核細(xì)胞層，淋巴細(xì)胞分離液層和最下層紅細(xì)胞之間的白膜層是粒細(xì)胞層。④吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個核細(xì)胞，盡量全部吸出單核細(xì)胞到新的15mL離心管中。⑤加入IOmL冰PBS緩沖液洗漆單個核細(xì)胞,室溫離心200 g (IOOOrmp, r=14. 5cm) , IOmin0棄上清,并盡量去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液。⑥用冰的無血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，室溫離心 200 g (lOOOrmp, r=14. 5 cm)，IOmin,棄上清,得到單個核細(xì)胞沉淀。2.磁珠分選⑶34+細(xì)胞
①加100 μ L冰的無血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸從臍血中分離出的單個核細(xì)胞沉淀，再先加入適量的FCR Blocking Reagent (I X IO7細(xì)胞/10 μ L)混勻細(xì)胞，再加入CD34MicroBeads (I X IO7 細(xì)胞/10 μ L)混勻細(xì)胞，置于 4°C，避光，30min。②加入IOmL冰的無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，室溫避光離心200g, IOmin (lOOOrmp, r=14. 5 cm),棄上清。③加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液(500 μ L/108細(xì)胞)重懸細(xì)胞沉淀(如果細(xì)胞量不足IO8則按IO8算)。④將MS分選柱固定于MiniMACS分選架上，調(diào)整好位置，以500 μ L無血清濕潤分選柱。⑤在分選柱下放一塑料離心管，將細(xì)胞懸液加入分選柱內(nèi)，讓其自然流下。⑥收集直接通過分選柱的液體，再連續(xù)3次以500 μ L無血清RPMI1640培養(yǎng)液沖洗分選柱，一并收集流過分選柱的液體，此即為CD34-細(xì)胞。⑦將分選柱與分選架分開，分選柱下重新放一塑料離心管。⑧吸取500 μ L的無血清RPMI1640培養(yǎng)液于分選柱內(nèi)，以配套的注射內(nèi)芯加壓沖洗，收集流過的液體，此即為Anti-human⑶34+磁珠標(biāo)記的細(xì)胞(⑶34+細(xì)胞)。結(jié)果
I.上述人臍血單個核細(xì)胞的密度梯度離心分離法密度梯度離心分離法可從每mL人臍血中分離單個核細(xì)胞量約為(I. I ±0. 24) X IO6, n=6其中η表示實(shí)驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)。2.人臍血單個核細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞磁珠分選法采用CD34+直接磁珠分選法可從人臍血單個核細(xì)胞中分離純化出約占單個核細(xì)胞總數(shù)I. O I. 5%的⑶34+細(xì)胞，即IO4個CD34+細(xì)胞/mL臍血。實(shí)施例2朗格罕斯細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及產(chǎn)量 步驟
I.將磁珠分選所得的CD34+細(xì)胞行細(xì)胞計數(shù)，按I X IO4個細(xì)胞/cm2接種于24孔板中，以RPMI1640完全培養(yǎng)基加下列四個方案的細(xì)胞因子培養(yǎng)，見表I。表中各因子的濃度為各因子在每mL的RPMI1640培養(yǎng)基中的終濃度。表I細(xì)胞因子組合體外誘導(dǎo)朗格罕斯細(xì)胞的方案
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)人臍血CD34+細(xì)胞分化為朗格罕斯細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其步驟如下O首先從人的臍血中分離出人臍血單個核細(xì)胞，然后對單個核細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選，得到⑶34+細(xì)胞；2)在添加粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α、干細(xì)胞因子和FMS樣酪氨酸激酶3配體的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述⑶34+細(xì)胞；3)將所述培養(yǎng)基在37°C，5%C02條件下，培養(yǎng)至少6天，每2 3天更換一次培養(yǎng)液，獲得朗格罕斯細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種誘導(dǎo)人臍血CD34+細(xì)胞分化為朗格罕斯細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為200U/mL，腫瘤壞死因子α的濃度為50U/mL，干細(xì)胞因子的濃度為lU/mL，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3配體的濃度為5U/mL。
3.權(quán)利要求I所述的朗格罕斯細(xì)胞在制備具有識別、攝取、加工和處理抗原及啟動免疫應(yīng)答功能的生物材料中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的生物材料為人造皮膚或皮膚移植中的輔助材料。
全文摘要
一種使臍血CD34+細(xì)胞分化為朗格罕斯細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其包括在含有粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，干細(xì)胞因子(SCF)和FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人臍血CD34+細(xì)胞，使之分化為朗格罕斯細(xì)胞。并且由此產(chǎn)生的朗格罕斯細(xì)胞具有純度高、產(chǎn)量大的特點(diǎn)，并具有識別、攝取、加工和處理抗原的能力，啟動免疫應(yīng)答的功能。
文檔編號C12N5/071GK102634483SQ201210064959
公開日2012年8月15日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者周靈, 彭代智, 王麗華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院