專利名稱：云南紅梨ΔPyTTG1基因及其原核表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種云南紅梨色素調(diào)控和毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白基因Λ PyTTGl及其原核表達(dá)載體，以及原核表達(dá)載體在制備APyTTGl蛋白和特異性抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅色表皮是梨分子育種的重要性狀指標(biāo)。云南省因其獨特的地理和氣候條件而擁有較多的紅皮梨種質(zhì)資源，1986年以來先后已選育出早白蜜、美人酥、滿天紅和云紅梨I號四個栽培品種。但生產(chǎn)中除云紅梨I號外，其它3個品種都會因氣候變化而導(dǎo)致著色較差甚至不著色，因此需要研究紅梨果皮的著色機理。已有研究表明植物花青素的合成是由轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB/bHLH/ WD40調(diào)控的。前人對MYB和bHLH研究較多，而對植物中的WD40蛋白研究較少。WD40蛋白含WD40基序(約40氨基酸的保守序列，以甘氨酸-組氨酸(GH)開始， 以色氨酸-天冬氨酸(WD)結(jié)尾)。WD40蛋白含1-10個串聯(lián)的WD40基序，一般認(rèn)為至少4 個以上的WD40基序才能形成高級和有功能的結(jié)構(gòu)。研究表明WD40蛋白是一個結(jié)構(gòu)多樣、 功能各異的蛋白家族，通常它們具有兩個共同特征一是結(jié)構(gòu)域折疊成β_螺旋槳結(jié)構(gòu)，一是形成多蛋白可逆組裝但不具任何催化活性的平臺，它們主要是在真核生物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成中起作用。許多研究表明WD40蛋白在蛋白質(zhì)復(fù)合物形成過程中具有支架作用。在植物中，WD40蛋白的作用主要是作為植物特異性發(fā)育事件如開花、花發(fā)育、分生組織形成、花粉發(fā)育和配子形成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。WD40蛋白主要通過其WD結(jié)構(gòu)域與其它蛋白互作，參與植物體內(nèi)眾多代謝反應(yīng)的調(diào)控。Morita等人在牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)具有隱性基因m (編碼Jz7WDRl蛋白)的突變體中，除CHS外，花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都協(xié)同地減少。 Wallker等人首次通過定位克隆和互補試驗發(fā)現(xiàn)TTGl蛋白調(diào)控花青素的合成和毛狀體分化。擬南芥TTGl蛋白含4個WD40基序，其(反7突變體的特點是缺乏表皮毛、種皮透明、種子不經(jīng)休眠就直接萌發(fā)、植株完全缺乏花青素、具有異常的根發(fā)育模式等突變表型，這表明 TTGl的功能是多效的。棉花GhTTGl和GhTTG3具有擬南芥AtTTGl的類似功能不僅能夠恢復(fù)擬南芥ttgl突變體形成毛狀體和花青素，而且還能互補紫羅蘭Ugl突變體在花瓣產(chǎn)生紫色斑點。De等人在矮牽牛中首次發(fā)現(xiàn)WD40蛋白PhANlI，其定位于細(xì)胞質(zhì)，能夠連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活，能夠調(diào)控PhAN2 (MYB)的功能。玉米中PACl與矮牽牛和擬南芥中花青素調(diào)控蛋白ANlI、TTGl極為類似，且35S-PAC1能夠互補ttgl突變體。Dressel等人發(fā)現(xiàn)WD 基序中單個氨基酸的突變(W158R)就可抑制DFR基因的表達(dá)，進而導(dǎo)致白花表型，且MiTTGl 的54. 1%高GC含量是進化的信號。Matus等人在擬南芥中異位表達(dá)葡萄WDRl導(dǎo)致擬南芥地上部分和蓮座葉中花青素的合成，并通過GFP融合蛋白技術(shù)證明WDRl定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。Zhang等人通過酵母雙雜交和植物過表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGL3、GL3能夠與TTGl (WD40)和 MYB蛋白(GL1，PAP1、PAP2、CPC、TRY)組合，形成MYB/bHLH/WD40復(fù)合物進行包括花青素生物合成和毛狀體形成的多功能的調(diào)控。Brueggemann等人通過互補試驗證實了蘋果MdTTGl 具有類似擬南芥AtTTGl的功能。Baudry等人通過遺傳和分子的方法發(fā)現(xiàn)TT2 (MYB)、TT8(bHLH)和TTGl (WDR)能夠形成四元復(fù)合物直接調(diào)控BAN在植物中的表達(dá)。Payne等通過酵母雙雜交證實了在擬南芥中GL3/GL1/TTG1復(fù)合物調(diào)控毛狀體的發(fā)育。Bouyer通過克隆分析、異位表達(dá)和微注射試驗提出了毛狀體形成的捕獲-耗盡機制在高濃度的毛狀體促進蛋白GL3細(xì)胞中，GL3通過結(jié)合毛狀體形成蛋白TTGl來耗盡臨近細(xì)胞中的TTGl，從而導(dǎo)致毛狀體形成，而周圍的細(xì)胞因TTGl的減少而不能形成毛狀體。而Zhao等人通過離子轟擊試驗證明了 1761，61^，61^和61^并不在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，而1 3-1^8，CPC則可在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，提出TTGl復(fù)合物直接調(diào)節(jié)激活子和抑制子，而抑制子的運動影響擬南芥葉上毛狀體的類型。TTGl是多功效基因，Gonzalez等人還發(fā)現(xiàn)TTGl能夠與MYB5和TT2 (MYB)形成復(fù)合物控制外種皮的分化。云南紅梨果皮花青素的生物合成可能是由MYB/bHLH/WD40調(diào)控的。目前云南紅梨和蘋果中的PyTTGl基因已被克隆和轉(zhuǎn)基因，但是還沒有專門用于準(zhǔn)確檢測PyTTGl蛋白的亞細(xì)胞定位、高效的進行PyTTGl蛋白的純化、高效分離PyTTGl蛋白所結(jié)合的蛋白和DNA片段及檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況的抗體。本發(fā)明選擇著色最好且穩(wěn)定的‘云紅梨I 號’作為試驗材料，開展云南紅梨‘云紅梨I號’PyTTGl轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆、序列分析和原核表達(dá)、蛋白純化抗體制備的工作，將彌補這方面的空白，也將為研究云南紅梨及蘋果WD40 轉(zhuǎn)錄因子TTGl在云南紅梨果皮紅色著色機理及其在植物毛狀體發(fā)生發(fā)育機制中作用提供工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種云南紅梨APyTTGl基因，該基因是云南紅梨色素合成和毛狀體發(fā)育調(diào)控蛋白/yrTGl基因的特異性片段，具有如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；該基因來源于云南紅梨。本發(fā)明另一目的是提供云南紅梨APyTTGl基因的原核表達(dá)載體 pET32a-Z PyTTGl，該載體含有SPyTTGl基因，SPyTTGl基因的上游有T7啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，基因的N端和 C端均帶有6 XHis標(biāo)簽。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備云南紅梨色素合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控特異性蛋白APyTTGl中。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備PyTTGl特異性抗體中，PyTTGl特異性抗體應(yīng)用在PyTTGl和MdTTGl蛋白的亞細(xì)胞定位檢測、PyTTGl蛋白的純化、PyTTGl蛋白所結(jié)合的蛋白和DNA片段的高效分離、檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)中。本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的
I、原核表達(dá)載體的構(gòu)建
(I)根據(jù)云南紅梨Z1TiW基因(GenBank登錄號為HQ641374)編碼框及蘋果、擬南芥、 玉米、紫蘇、矮牽牛中/ 域 基因和原核表達(dá)載體pET-32a多克隆酶切位點，設(shè)計I對特異引物-F :5, -07gCCATGGAGAACTCTACGCAAGAATCG-3/ ,APyTTGl-R 5/ KgCTCGAG GTTCGGCTTTATTGAAAGGGTATCC-3;，在上下游引物的5'端分別加入NcoI和XhoI酶切位點及保護堿基(下劃線部分為酶切位點，斜體部分為保護堿基)。以云南紅梨總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用APyTTGl-Y和進行擴增，得到特異性片段；
(2)回收zl/yr/iW全長片段；
(3)使用AfcoI和沿ol對APyTTGl片段和載體pET32a進行雙酶切，分別回收、連接，獲得原核表達(dá)載體pET32a-zl/y/7i 7。2、APyTTGl基因的原核表達(dá)
使用熱刺激法將pET32a-zl/y/7i 7轉(zhuǎn)入大腸桿菌TfoMiia (DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下篩選最佳表達(dá)條件，在最適條件下進行大量表達(dá)。3、APyTTGl蛋白的純化
收集菌體，進行超聲破碎，過鎳柱進行純化，收集純化后的蛋白。4、使用Λ PyTTGl純化蛋白制備PyTTGl抗體，使用Λ PyTTGl抗體可以檢測PyTTGl 蛋白。本發(fā)明的重組載體pET32a-」/y/7^7可以表達(dá)獲得純化蛋白，制備的抗體可用于檢測PyTTGl蛋白，本發(fā)明制備的APyTTGl抗體，可以彌補目前沒有專門檢測PyTTGl和 MdTTGl、分離PyTTGl所結(jié)合的蛋白質(zhì)、PyTTGl蛋白的亞細(xì)胞定位的抗體，本發(fā)明的成果將為果樹及花卉的分子育種奠定基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明中提取的總RNA電泳示意圖。圖2為本發(fā)明基因擴增后的擴增產(chǎn)物電泳示意圖。圖3為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a_APyTTGl電泳示意圖，圖中I是對照質(zhì)粒 pET32a-PyMT ；2 是 pET32a_ ΔPyTTGl。圖4為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a_APyTTGl在16 °〇和37 °C、IPTG終濃度為
O.5 mM條件誘導(dǎo)下的表達(dá)情況示意圖,其中I是轉(zhuǎn)化pET-32a空載體Rosetta (DE3)菌體的總蛋白；2是IPTG誘導(dǎo)前原核表達(dá)載體的總蛋白；3-5是原核表達(dá)載體在16 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM條件下誘導(dǎo)2、4、6 h后的表達(dá)情況；6_8是原核表達(dá)載體在37 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM條件下誘導(dǎo)2、4、6 h后的表達(dá)情況；9是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)SM0431。圖5為本發(fā)明中APyTTGl蛋白純化條件的優(yōu)化電泳示意圖，其中I是表達(dá) APyTTGl的Rosetta(DE3)細(xì)菌總蛋白；2是掛柱后的流穿液;3_5分別為30,150,500 mM 咪唑洗脫后的結(jié)果；6是500 mM洗脫后第二管的結(jié)果；7是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker0431。圖6為本發(fā)明中APyTTGl蛋白純化條件的優(yōu)化電泳示意圖，其中I是表達(dá)蛋白APyTTGl的Rosetta(DE3)細(xì)菌O. 5 mM IPTG誘導(dǎo)16 h的總蛋白；2是IPTG誘導(dǎo)前的 Rosetta(DE3)細(xì)菌總蛋白；3是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker0431 ;4_7是分別為150、200、300和 500 mM咪唑洗脫后的結(jié)果。圖7為本發(fā)明中APyTTGl蛋白的純化示意圖，其中I是10 μ I的O. 1% BSA ;2是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker0441 ;3_10是APyTTGl蛋白在300 mM咪唑洗脫下的結(jié)果。圖8為本發(fā)明中使用APyTTGl抗體檢測35S:: PyTTGl轉(zhuǎn)基因煙草葉片PyTTGl 蛋白表達(dá)示意圖，其中1，2，3，5和6是轉(zhuǎn)基因株系，5是野生型對照。圖9為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a_APyTTGl的構(gòu)建策略示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護范圍并不局限于所述內(nèi)容。實施例中使用的試劑主要為分子生物學(xué)試驗試劑，各種限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶為Promaga公司的， PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司，Rosetta (DE3)菌株和感受態(tài)細(xì)胞為北京Transgene公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。His Trap柱子(GE Health)，其它儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實驗室常用儀器設(shè)備。所有引物序列合成和基因測序均在上海生工生物技術(shù)公司進行。本發(fā)明中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I :原核表達(dá)載體pET32a_zl/y/7i 7的構(gòu)建
(I)引物設(shè)計
根據(jù)云南紅梨r/i 7基因(GenBank登錄號為HQ641374)編碼框及蘋果、擬南芥、玉米、紫蘇、矮牽牛中/ 域 基因和原核表達(dá)載體pET-32a多克隆酶切位點，設(shè)計I對特異引物 APyTTGl-F 5/ -07gCCATGGAGAACTCTACGCAAGAATCG-3'，APyTTGl-R 5/ KgCTCGAGGTTC GGCTTTATTGAAAGGGTATCC-3'，在上下游引物的5'端分別加入AfcoI和通ol酶切位點及保護堿基(下劃線部分為酶切位點，斜體部分為保護堿基)。(2)總RNA的提取
使用異硫氰酸胍法提取紅梨果皮的總RNA，電泳檢測結(jié)果如圖I。(3) RT-PCR
以云南紅梨總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用APyTTGl-Y和 APyTTGl-R進行擴增，獲得片段。(4)APyTTGl 片段的回收
對PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳后(見圖2)，切下目的片段；使用膠回收試劑盒， 按照試劑盒說明書對目的片段進行回收。(5)原核表達(dá)載體的構(gòu)建
使用AfcoI和通ο I對PCR純化產(chǎn)物^PyTTGl和載體pET32a按照說明書進行雙酶切，分別獲得5’端帶有AfcoI和3’端帶有ZAoI的片段和pET32a載體，跑電泳后分別進行膠回收，按照摩爾比目的基因載體=3:1加樣，然后加入連接液I，16 °C連接16 h(見圖 3)。將100 μ I感受態(tài)大腸桿菌疋coli DH5 α加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30 min, 42 °C熱刺激45 s后，冰浴2 min ;加入900 μ I液體培養(yǎng)基S0C，37 °C >200 rpm搖床培養(yǎng)60 min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫8000 rpm離心I min收集菌體；在超凈臺上吸去上清，剩余約O. I ml時,使用移液槍混勻,接入帶有Amp抗性的LB固體平板上,用無菌三角棒涂布均勻；37 °C過夜培養(yǎng)；挑取白色菌落，接種于LB液體+ Amp的培養(yǎng)基，37 °C ,180 rpm培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒；進行酶切驗證后，再送至上海生工生物工程公司測序進行測序驗證插入基因的正確性，最后獲得原核表達(dá)載體pET32a-zl/yr7i 7。實施例2 :原核表達(dá)載體pET32a_zl/yr7i 7的原核表達(dá)使用熱刺激法將重組質(zhì)粒pET32a-A/y/Ti 7轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TfoMiia (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB + Amp固體平板上，挑取pET32a-A/y/7i 7的重組菌落于LB + Amp液體培養(yǎng)基中，37 0C >200 rpm搖床培養(yǎng)過夜，按I : 100的比例接種于相同的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD6tltl為O. 6-0. 8，加IPTG至終濃度為O. 5 mM，分別在16。。和37 °C下培養(yǎng)0、2、4、6 h后收集菌液用于分析總蛋白；收集后的菌液4 0C >12 000 rpm離心I min,棄上清液,沉淀用 100 μ I SDS 凝膠加樣緩沖液(Tris-HCl 50 mM, pH 6. 8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚藍(lán) O. I %;甘油10 %)重懸，煮沸5 min后，12 000 rpm離心I min，取20 μ I上清液進行SDS-PAGE 檢測；用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(O. I %考馬斯亮藍(lán)R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脫色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)進行脫色后，使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。結(jié)果顯示插入有外源片段的重組質(zhì)粒pET32a-A/y/7i 7經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)期的蛋白分子量約29 kD (包括載體上TRX蛋白)左右有I條蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和pET-32a對照質(zhì)粒未出現(xiàn)這條蛋白帶(見圖4)。表明在16 1和37 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM下重組質(zhì)粒 pET32a-A/>TTiW在大腸桿菌Tfo1Seiia (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)了 APyTTGl蛋白。因為低溫誘導(dǎo)更有利于可溶性蛋白的形成，因此后續(xù)試驗選用16 °C、IPTG終濃度為0.5 mM下進行誘導(dǎo)表達(dá)。實施例3 Δ PyTTGl蛋白的純化，具體步驟如下
a、菌體破碎將在16°C、0. 5 mM IPTG下大量誘導(dǎo)表達(dá)I L后的菌體，經(jīng)超聲破碎菌體 (工作3 s,休息6 s) 5 min ；
b、收集上清和沉淀將菌體破碎液40C >12 000 rpm離心20 min，分別保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用O. 22 μ m濾器進行過濾，除去雜質(zhì)；
d、His-TrapHP柱的預(yù)處理使用5倍柱體積純水洗柱；5倍柱體積結(jié)合緩沖液(磷酸鈉緩沖液(PH7. 4) 20 mM, NaCl O. 5M，咪唑30 mM)平衡柱子，流速為I ml/min;
e、蛋白樣品上柱流速為Iml/min,收集流出液；
f、洗柱使用5倍柱體積結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4，NaCl O. 5M，咪唑30 mM)洗脫；
g、洗脫分別使用5倍柱體積洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4，NaCl O. 5M，咪唑30、150、500mM)依次洗脫，收集洗脫液；
h、His-TrapHP柱的后處理5柱體積洗脫緩沖液(20 mM磷酸鈉緩沖液ρΗ7· 4，NaCl
0.5 Μ，咪唑500 mM)洗去所有蛋白；5倍柱體積純水洗柱；5倍柱體積20 %乙醇洗柱；柱子前后封口，于4 °C、20 %的乙醇中保存；
i、SDS-PAGE檢測分別取50μ I各咪唑梯度流出液，加入5 μ I的5Χ蛋白上樣緩沖液，混勻后，煮沸5 min,4 °C>13 000 rpm離心5 min后，各取20 μ I上樣，進行SDS-PAGE 分析。結(jié)果如圖5，經(jīng)150 mM咪唑洗脫后，500 mM咪唑獲得純化蛋白。為進一步優(yōu)化咪唑洗脫濃度，采用150，200，300和500 mM的咪唑梯度洗脫，結(jié)果如圖6，表明300 mM咪唑是最佳的蛋白洗脫濃度。隨后，采用300 mM咪唑進行大量純化，結(jié)果如圖7，獲得了高純度蛋白，使用IX磷酸緩沖液(PH7. 4)透析后，將第7泳道純化的蛋白送云大生物制備兔的多克隆抗體。實施例4 PyTTGl蛋白特異性抗體的Western檢測為檢測PyTTGl蛋白特異性抗體的有效性，使用Λ PyTTGl蛋白抗體對35S: : PyTTGl轉(zhuǎn)基因煙草進行了檢測。具體過程如下
實驗中使用的試劑與儀器如下
垂直蛋白電泳儀、PVDF 膜(millipore), Semi-Dry Transfer Cell (BIO-RAD)轉(zhuǎn)膜
系統(tǒng)；
丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED,1X甘氨酸緩沖液，IX磷酸緩沖液， 1*PBT，脫脂奶粉，Whitman 3MM 濾紙等 SDS-PAGE 和 Western 試劑。蛋白樣品制備蛋白樣品和1/5體積5X蛋白上樣緩沖液(Tris-HCl (pH6. 8)250 mM, SDS 10%, BPB 0.5%，甘油 50%，β -巰基乙醇5%)，95°C加熱 5 min 后置于冰上 5 min。 常溫 13 000 rpm、離心 Imin0I、SDS-PAGE 檢測 Cl)配制SDS-PAGE凝膠；
(2)電泳需要恒流濃縮膠30 mA，分離膠40 mA。2、Western 操作
(1)轉(zhuǎn)膜設(shè)定電流為2.O mA/cm2,轉(zhuǎn)膜40 min ；
(2)封閉(5%的脫脂牛奶)；
(3)添加一抗(APyTTGl抗體)；
(4)添加二抗(羊抗兔的商業(yè)化抗體)；
(5)結(jié)果觀察
棄二抗，洗滌后，加I ml工作液，浸潤整個PVDF膜，使用成像系統(tǒng)Chemidoc XRS(BIO-RAD)進行成像觀察，結(jié)果如圖8，泳道1、2、3、5、6為轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白，4為野生型煙草的總蛋白，在轉(zhuǎn)基因煙草中檢測到PyTTGl蛋白的表達(dá)，而在野生型對照中未檢測到 PyTTG蛋白，這表明本發(fā)明制備的多克隆抗體專一性強，適合進行PyTTGl蛋白的表達(dá)檢測、 定位檢測等。
權(quán)利要求
1.云南紅梨SPyTTGl基因，其特征在于..MYTTGl基因具有如SEQID NO. 3所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的云南紅梨Δ/>77^7基因，其特征在于基因來源于云南紅梨。
3.權(quán)利要求I所述云南紅梨WyTTGl基因的原核表達(dá)載體pET32a-』其特征在于該載體含有WyTTGl基因，IsPyTTGl基因的上游有T7啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點 RBS, T7啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均帶有6 XHis標(biāo)簽。
4.權(quán)利要求3的所述的原核表達(dá)載體在制備云南紅梨色素合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白APyTTGl中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3的所述的原核表達(dá)載體在制備PyTTGl特異性抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種云南紅梨色素合成和毛狀體發(fā)育調(diào)控蛋白PyTTG1基因ΔPyTTG1及其原核表達(dá)載體，本發(fā)明利用RT-PCR從云南紅梨中克隆PyTTG1基因特異性片段ΔPyTTG1，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，然后在大腸桿菌中進行表達(dá)，獲得云南紅梨ΔPyTTG1純化蛋白，云南紅梨ΔPyTTG1純化蛋白應(yīng)用在制備PyTTG1特異性抗體中、在PyTTG1蛋白表達(dá)檢測中及免疫沉淀和染色質(zhì)免疫共沉淀中；本發(fā)明中所制備的抗體特異性強，能夠準(zhǔn)確的檢測PyTTG1蛋白的亞細(xì)胞定位、高效的進行PyTTG1蛋白的純化、高效分離PyTTG1蛋白所結(jié)合的蛋白和DNA片段及檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況。
文檔編號C12N15/29GK102586280SQ20121006499
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者崔道磊, 張曉東, 李昆志, 樊磊, 舒群, 蘇俊, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)