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云南紅梨ΔPybHLH基因及其原核表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法

文檔序號:408955閱讀:444來源:國知局
專利名稱:云南紅梨ΔPybHLH基因及其原核表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,具體涉及一種云南紅梨花青素生物合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白基因的特異性片段及其原核表達(dá)載體,和原核表達(dá)載體在制備APybHLH蛋白和特異性抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
紅色果皮是梨分子育種的重要性狀指標(biāo)。云南省因其獨(dú)特的地理和氣候條件而擁有較多的紅皮梨種質(zhì)資源,1986年以來先后已選育出早白蜜、美人酥、滿天紅和云紅梨I號四個(gè)栽培品種。但生產(chǎn)中除云紅梨I號外,其它3個(gè)品種都會因氣候變化而導(dǎo)致著色較差甚至不著色,因此需要研究紅梨果皮的著色機(jī)理。已有研究表明植物花青素的合成是由轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB/bHLH/ WD40調(diào)控的。前人對MYB研究較多,而對植物中的bHLH和WD40蛋白研究較少。在擬南芥中LDOX基因啟動子直接包括EGL3和TT8在內(nèi)的不同的MYB-BHLH-TTG1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的調(diào)控,egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突變體試驗(yàn)也表明了 egl3和tt8是擬南芥幼苗花青素累積的必要條件。在擬南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白與WD-repeat/bHLH/MYB 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子(MYB75和Glabral)互作,抑制了 JA調(diào)控的花青素的累積和毛狀體的發(fā)生,而JA誘導(dǎo)的JAZ蛋白的降解能夠解除這種抑制。在大麗花(DahI iavariabilis)中,bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 DvIVS 通過調(diào)控 DvCHSl,DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的轉(zhuǎn)錄來參與其花青素的生物合成。在葡萄中,bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYCAl可能通過調(diào)控ANR和UFGT基因的表達(dá)來調(diào)控其花青素的生物合成。在龍膽花(G.中,GtMYB3和GtbHLH參與花青素的生物合成。Zhang等人通過酵母雙雜交和植物過表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGL3、GL3能夠與TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl,PAPl、PAP2、CPC、TRY)組合,形成 MYB/bHLH/WD40 復(fù)合物進(jìn)行包括花青素生物合成和毛狀體形成的多功能的調(diào)控。Baudry等人通過遺傳和分子的方法發(fā)現(xiàn)TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能夠形成四元復(fù)合物直接調(diào)控BAN在植物中的表達(dá)。Payne等通過酵母雙雜交證實(shí)了在擬南芥中GL3/GL1/TTG1復(fù)合物調(diào)控毛狀體的發(fā)育。Bouyer通過克隆分析、誤表達(dá)和微注射試驗(yàn)提出了毛狀體形成的捕獲_耗盡機(jī)制在高濃度的毛狀體促進(jìn)蛋白GL3細(xì)胞中,GL3通過結(jié)合毛狀體形成蛋白TTGl來耗盡臨近細(xì)胞中的TTGl,從而導(dǎo)致毛狀體形成,而周圍的細(xì)胞因TTGl的減少而不能形成毛狀體。而Zhao等人通過離子轟擊試驗(yàn)證明了 TTGl,GL3,GLl和GL2并不在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移,而R3-MYB,CPC則可在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移,提出TTGl復(fù)合物直接調(diào)節(jié)激活子和抑制子,而抑制子的運(yùn)動影響擬南芥葉上毛狀體的類型。在云南紅梨著色機(jī)理研究方面,本實(shí)驗(yàn)室研究了光照對云南紅梨著色的影響、構(gòu)建了光誘導(dǎo)果皮差異表達(dá)基因的SSH文庫,進(jìn)行了著色相關(guān)基因的分離和表達(dá)分析。前期研究結(jié)果表明云南紅梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40調(diào)控的。在前人研究基礎(chǔ)上,針對云南紅梨栽培品種早白蜜、滿天紅、美人酥著色不穩(wěn)定、在國內(nèi)外尚未見有關(guān)云南紅梨果皮紅色著色機(jī)理方面研究報(bào)道。在云南紅梨著色機(jī)理研究中,還沒有人克隆轉(zhuǎn)錄、因子bHLH,研究中PybHLH蛋白無法進(jìn)行特異性檢測和分析。目前世界紅梨極其稀少,世界市場缺口較大;此外,云南紅梨外觀和內(nèi)在品質(zhì)好,商品價(jià)值高,紅梨將成為梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新的增長點(diǎn),紅梨育種成為梨樹育種的重要方向。但是,指導(dǎo)育種的紅梨著色的科學(xué)理論匱乏,本發(fā)明的成果將為果樹及花卉的分子育種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明選擇著色最好且穩(wěn)定的‘云紅梨I號’作為試驗(yàn)材料,開展云南紅梨‘云紅梨I號’ PybHLH轉(zhuǎn)錄因子基因特異性片段的克隆、序列分析和原核表達(dá)、蛋白純化和抗體制備的研究,制備的抗體可用于云南紅梨PybHLH蛋白的純化、定位檢測、表達(dá)分析以及PybHLH所結(jié)合蛋白和DNA片段的高效分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)基因的特異性片段仏該基因是云南紅梨花青素生物合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白基因的特異性片段,具有如SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一目的是提供云南紅梨基因的原核表達(dá)載體pET32a-z^j^K仏該載體含有基因,基因的上游有T7啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS,T7啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列,基因的N端和C端均帶有6 XHis標(biāo)簽。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備云南紅梨花青素合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白特異性片段APybHLH蛋白中。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備PybHLH蛋白特異性抗體中,特異性抗體能應(yīng)用在PybHLH蛋白亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)檢測、PybHLH蛋白純化、免疫沉淀(IP)及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)中。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的,本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
云南紅梨PybHLH基因、Λ PybHLH純化蛋白,由下述方法制備而得
(I)根據(jù)蘋果履/從基因(GenBank登錄號為DQ266451. I)編碼框,設(shè)計(jì)I對特異引吻\ PybHLH-F 辦’ -GTCGACATGGCTCAGAATCATGAGAGGGTG-3,取 PybHLH-R ·)’ CTCGAGGCACTTACCAGCAATTTTCCAAAGC,在上下游引物的5'端分別加入fe7I和通ol酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。以云南紅梨總RNA為模板,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用PybHLH-F 和 PybHLH-R 進(jìn)行擴(kuò)增;
全長片段的回收;
基因的T/A克隆和測序;
(4)/>從^7基因的生物信息學(xué)分析及GenBank登錄號的獲得;
(5)APybHLH片段的克隆將云南紅梨果皮中的PybHLH蛋白序列與蘋果、矮牽牛、擬南芥和玉米等調(diào)控花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對,根據(jù)比對結(jié)果和pET32a載體,設(shè)計(jì)了一對引物-APvbHLH-F: CCATGGATTGCTGTGAGAAATCTTCCTCTG 和 APybHLH-R CTCGAGACCTTGCAAATTTGGGAGCAAATC,在上下游引物的5'端分別加入AfcoI和沿ol酶切位點(diǎn)(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒pMDlST-/^^^^為模板,使用APybHLH-F取APybHLH-R進(jìn)行擴(kuò)增;
全長片段的回收、T/A克隆和測序;(7)構(gòu)建原核表達(dá)載體使用AfcoI和沿ol對片段和pET32a進(jìn)行雙酶切,分別獲得5'和3'末端帶有分別帶有AfcoI和通ol酶切位點(diǎn)的基因片段和pET32a載體,瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收,然后在16°C連接16 h,獲得原核表達(dá)載體^1 ,2a-APybHLH ;
APybHLH的原核表達(dá)載體的構(gòu)建和原核表達(dá)使用熱刺激法將mUybHLH鑄入大腸桿菌辦(DE3)中,在IPTG誘導(dǎo)下摸索最佳表達(dá)條件,在最適條件下進(jìn)行大量表達(dá);
(9)APybHLH蛋白純化收集菌體,進(jìn)行超聲破碎,過鎳柱進(jìn)行純化,收集純化后的蛋白,純化后的蛋白用于制備PybHLH蛋 白特異性抗體和用于PybHLH蛋白表達(dá)檢測等。如果鎳柱純化后,蛋白仍有雜帶,可以使用割膠回收的方法進(jìn)行二次純化。相對于目前使用融合GST、HA、FLAG標(biāo)簽的蛋白表達(dá)方法,本發(fā)明所制備的抗體具有特異性高、專一性強(qiáng)的特點(diǎn),能夠準(zhǔn)確的檢測PybHLH蛋白的亞細(xì)胞定位、高效的進(jìn)行PybHLH蛋白的純化、高效分離PybHLH蛋白所結(jié)合的蛋白和DNA片段及檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況。


圖I為本發(fā)明云南紅梨的總RNA電泳示意圖。圖2為本發(fā)明PybHLH基因的PCR產(chǎn)物電泳示意圖,其中I是DNA Marker III ;2是PybHLH基因PCR產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明pMD18T-PybHLH的酶切檢測示意圖;其中I是DNA Marker III ;2、4、6 是 pMD18T-PybHLH 質(zhì)粒;3、5、7 是 pMD18T_PybHLH 質(zhì)粒 2、4、6 的 SalI 和 XhoI 雙酶切結(jié)
果O圖4為本發(fā)明PybHLH蛋白與其它植物中花青素生物合成和毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白bHLH的分子發(fā)育樹;使用ClustalX2比對,使用Mega4. O中的N-J method構(gòu)建,Booststrap=IOOOo圖5為本發(fā)明APybHLH蛋白在16 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM條件誘導(dǎo)下的表達(dá)情況電泳示意圖,其中I是轉(zhuǎn)化pET_32a空載體的Rosetta菌體總蛋白;2_6是原核表達(dá)載體pET32a-APybHLH在16 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM條件下誘導(dǎo)0、2、4、6和16 h后的表達(dá)情況;7_8是原核表達(dá)載體pET32a- Δ PybHLH在16 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM條件下誘導(dǎo)16 h,總蛋白破碎后目的蛋白在沉淀和上清中的表達(dá)情況;9是Ni柱小量純化的蛋白;10是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0431 ;11是10 μ I的O. 1% BSA。圖6為本發(fā)明APybHLH蛋白的鎳柱純化電泳示意圖,其中I是原核表達(dá)載體pET32a-Λ PybHLH在16 °C、0. 5 mM IPTG誘導(dǎo)16 h后的總蛋白;2是掛柱后的流穿液;3-5分別為30、150和500 mM咪唑洗脫后的結(jié)果;6_7是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0441和M0431。圖7為本發(fā)明鎳柱純化后的蛋白的二次純化電泳示意圖,其中I和3是純割膠回收后的APybHLH蛋白樣品;2是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0441 ;4是10 μ 11 O. 1%的BSA。圖8為本發(fā)明Λ PybHLH抗體檢測APybHLH蛋白的Western Blot檢測結(jié)果示意圖。
圖9為本發(fā)明APybHLH抗體檢測35S: :PybHLH轉(zhuǎn)基因煙草的Western Blot檢測結(jié)果示意圖。圖10為本發(fā)明使用Δ PybHLH檢測PyMYB-PybHLH互作的Western Blot檢測結(jié)果示意圖。圖1-4為光照0、3、5、7天后、使用APyMYB特異性抗體免疫沉淀、使用APybHLH檢測的云紅梨I號總蛋白。圖11為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a_APybHLH的構(gòu)建策略示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例廢本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例中使用的試劑主要為分子生物學(xué)試驗(yàn)試劑;各種限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品,反轉(zhuǎn)錄酶為Promaga公司的,PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司,Rosetta (DE3)菌株和感受態(tài)細(xì)胞為北京Transgene公司產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。使用的儀器為GE Health公司的His Trap (I ml)柱子,其它儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。所有引物序列合成和基因測序均在上海生工生物工程公司進(jìn)行。本發(fā)明中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例I :本發(fā)明基因及其特異性片段的克隆,具體步驟如下
(I)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)蘋果履&現(xiàn)"幻基因(GenBank登錄號為DQ266451. I)編碼框,設(shè)計(jì)I對特異引物PybHLH-F :5,-GTCGACATGGCTCAGAATCATGAGAGGGTG-3,和 PvbHLH-R :3’ : CTCGAGGCACTTACCAGCAATTTTCCAAAGC,在上下游引物的5'端分別加入fe7I和沿ol酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。(2)總RNA的提取
a、用液氮將O.I g云紅梨紅色果皮充分研磨成粉末以后,加入I ml RNA提取緩沖液(4M異硫氰酸胍,25 mM檸檬酸鈉,O. 5 % (w/v)十二烷基肌氨酸鈉,2 %(w/v) PVP, β -巰基乙醇),轉(zhuǎn)入2 ml離心管中,再研磨均勻后,再加入1/10體積2 M醋酸鈉(pH 4.2);
b、顛倒離心管數(shù)次,混勻之后,接著加入等體積的氯仿異戊醇(24:1),蓋緊離心管蓋,劇烈搖動5 min,冰上靜置15 min后,4 °C離心15 min (12000 g/min);
C、離心結(jié)束后取上清于新離心管中,加入等體積的氯仿,蓋緊離心管蓋,劇烈搖動5min,冰上靜置 15 min 后,4 °C離心 15 min (12000 g/min);
d、取上清,加入等體積異丙醇,在-20°C沉淀RNA30 min,再次4 °C離心15 min (12
000g/min),讓RNA沉淀在管壁;
e、RNA沉淀經(jīng)75%乙醇清洗兩次后抽真空干燥,然后加入20 μ I無RNase的DEPC處理水徹底溶解RNA ;
f、使用I.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA (見圖I)。(3) RT-PCR
以云南紅梨總RNA為模板,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用PybHLH-Y和PybHLH-認(rèn)進(jìn)行擴(kuò)增,得到PCR產(chǎn)物基因片段(見圖2)片段的回收對PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳后,切下目的片段;使用膠回收試劑盒,按照試劑盒說明書對目的片段進(jìn)行回收?;虻腡/A克隆和測序;將回收的PCR產(chǎn)物,按照pMD18T說明書,進(jìn)行T/A克?。晦D(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α后,涂固體LB + Amp平板,挑取白色菌落,接種到液體LB + Amp培養(yǎng)基中,37 °C >200 rpm搖床過夜,提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切檢測(見圖3),然后送上海杰瑞生物公司進(jìn)行測序。(6)/>從^7基因測序和生物信息學(xué)分析及GenBank登錄號的獲得:/>6現(xiàn)"基因的讀碼框?yàn)?947 bp,該基因編碼648個(gè)氨基酸,分子量為72925. 8 Da,等電點(diǎn)為5. 5LDNAMAN比對結(jié)果表明,與蘋果、矮牽牛、擬南芥和玉米等調(diào)控花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有很高的同源性,尤其是與蘋果中的MdbHLH33的同源性為95.22 % (圖4),故將該序列命名為/基因。將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫,獲得其登錄號為HM622265。稀有密碼子分析結(jié)果表明/基因含有大約9 %的稀有密碼子,其中二連體稀有密碼子共7個(gè),因此原核表達(dá)時(shí)需要使用能夠補(bǔ)充稀有密碼子的大腸桿菌/菌株進(jìn)行原核表達(dá)。(.DAPybHLH片段的克隆將云南紅梨果皮中的PybHLH蛋白序列與蘋果、矮牽牛、擬南芥和玉米等調(diào)控花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對,根據(jù)比對結(jié)果選取的PybHLH中特異性的區(qū)段和pET32a載體,設(shè)計(jì)了一對引物-APybHLH-F CCATGGATTGCTGTGAGAAATCTTCCTCTG 和 APybHLH-R CTCGAGACCTTGCAAATTTGGGAGCAAATC,在上下游引物的5'端分別加入Afc0I和ZAoI酶切位點(diǎn)(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒VWim-PybHLH 為模板,使用 APybHLH-Y 和 APybHLH-R 進(jìn)行擴(kuò)增。(8)ζ1/^ΜΖ"全長片段的回收、T/A克隆和測序?qū)⒒虻腜CR產(chǎn)物,按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收,然后使用PMD18T進(jìn)行T/A克??;轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)、涂平板、提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后,送上海杰瑞生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明與/>況£//相比,沒有發(fā)生突變。稀有密碼子分析結(jié)果表明基因含有大約7 %的稀有密碼子,其中二連體稀有密碼子共3個(gè),因此原核表達(dá)時(shí)需要使用能夠補(bǔ)充稀有密碼子的大腸桿菌沿菌株進(jìn)行原核表達(dá)。實(shí)施例2 :原核表達(dá)載體V^mybHLH的構(gòu)建(圖11)
使用AfcoI和沿ol對ρΜ 18Τ-ζ1/^^Κ#和載體pET32a按照說明書進(jìn)行雙酶切,分別獲得5’端帶有AfcoI和3’端帶有通ol的片段和pET32a載體,跑電泳后分別進(jìn)行膠回收,按照摩爾比目的基因載體=3 :1加樣,然后加入Ligation Solution 1,16 °〇連接16 h。將感受態(tài)大腸桿菌疋coli DH5 α 100 μ I加入6 μ I連接體系中混勻;混合液冰浴30 min, 42 °C熱刺激45 s后,冰浴2 min ;加入900 μ I液體培養(yǎng)基S0C,37 °C搖床200rpm 60min使菌體復(fù)蘇;培養(yǎng)結(jié)束后,常溫8000 rpm離心I min收集菌體;在超凈臺上吸去上清,剩余約O. I ml時(shí),使用移液槍混勻,接入帶有Amp抗性的LB固體平板上,用無菌三角棒涂布均勻;37 °C過夜培養(yǎng);挑取白色菌落,接種于LB液體+ Amp的培養(yǎng)基,37 °C ,180rpm培養(yǎng)12 h后,提取質(zhì)粒;進(jìn)行酶切驗(yàn)證后,再送至上海杰瑞生物公司測序進(jìn)行測序驗(yàn)證插入基因的正確性,最后獲得原核表達(dá)載體m^-APybHLH。實(shí)施例3的原核表達(dá)使用熱刺激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TfoMiia (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。涂LB+Amp固體平板,挑取pET32a-PybHLH的重組菌落于LB + Amp液體培養(yǎng)基中37 0C>200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜,按I : 100的比例接種于相同的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD6c 為
O.6-0. 8,加IPTG至終濃度為O. 5 mM,分別在16 °C下培養(yǎng)0、2、4、6和16 h后收集菌液用于分析總蛋白。4 0C >12 000 rpm離心I min,棄上清液,沉淀用100 μ I SDS凝膠加樣緩沖液(Tris-HCl 50 mM, pH 6. 8 ;SDS 2 % ;DTT 100 mM ;溴酚藍(lán) O. I % ;甘油 10 %)重懸,煮沸5 min后,12 000 rpm離心I min,取20 μ I上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(O. I %考馬斯亮藍(lán)R-250,40 %甲醇,10 %冰乙酸)染色,脫色液(25 %甲醇,6 %冰乙酸)進(jìn)行脫色后,使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。結(jié)果顯示插入有外源片段的重組質(zhì)粒pET32a- NPybHLH經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,在預(yù)期的蛋白分子量約50 kD (包括載體上TRX蛋白)左右有I條蛋白條帶,而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和pET-32a對照質(zhì)粒未出現(xiàn)這條蛋白帶(圖5),表明重組質(zhì)粒pET32a-A/y/^Z"在大腸桿菌沿xseiia (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)了 APybHLH蛋白。超聲破碎后,SDS-PAGE檢測后,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要在上清表達(dá)(圖5)。
實(shí)施例4 : APybHLH蛋白純化
(I)APybHLH蛋白的鎳柱純化,在16 0C>0.5 mM IPTG下大量搖菌,收集菌體后
a、菌體破碎將大量誘導(dǎo)表達(dá)IL后的菌體,經(jīng)超聲破碎菌體(工作3 S,休息6 s)5
min ;
b、收集上清和沉淀將菌體破碎液40C >12 000 rpm離心20 min,分別保留上清和沉
淀;
C、蛋白破碎上清液使用O. 22 μ m濾器進(jìn)行過濾,除去雜質(zhì);
d、His-TrapHP柱的預(yù)處理使用5倍柱體積純水洗柱;5倍柱體積結(jié)合緩沖液(磷酸鈉緩沖液20 mM (pH7. 4), NaCl 0.5 M,咪唑30 mM)平衡柱子,流速為I ml/min ;
e、蛋白樣品上柱流速為Iml/min,收集流出液;
f、洗柱使用5倍柱體積結(jié)合緩沖液(磷酸鈉緩沖液20mM(pH7.4),NaCl 0.5 M,咪唑30 mM)洗脫;
g、洗脫分別使用5倍柱體積洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4,NaCl 0.5 M,咪唑30、150、500 mM)依次洗脫,收集洗脫液;(見圖6)
h、His-TrapHP柱的后處理5柱體積洗脫緩沖液(磷酸鈉緩沖液20 mM(pH7. 4),NaCl
0.5 M,咪唑500 mM)洗去所有蛋白;5倍柱體積純水洗柱;5倍柱體積20 %乙醇洗柱;柱子前后封口,于4 °C、20 %的乙醇中保存;
i、SDS-PAGE檢測分別取50μ I各咪唑梯度流出液,加入5 μ I的5Χ蛋白上樣緩沖液,混勻后,煮沸5 min,4 °C>13 000 rpm離心5 min后,各取20 μ I上樣,進(jìn)行SDS-PAGE分析。(2)二次純化鎳柱純化后,蛋白仍有雜帶,使用割膠回收的方法進(jìn)行二次純化,具體操作如下
a、透析袋的預(yù)處理剪取適當(dāng)長度(10-20cm)的透析袋(截留范圍為8 000-12 000Da);置于500 ml含2 %(ff/V)碳酸氫鈉和I mM EDTA (pH8. O)水溶液中,煮沸10 min ;蒸餾水徹底清洗透析袋;置于ImM EDTA(pH8. O)溶液中再次煮沸10 min ;冷卻后4 °C保存;
b、取已溶解的蛋白沉淀,加1/5體積5X蛋白上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳;C、電泳結(jié)束后將膠放在O. 25 M預(yù)冷的KCl中,4 °C浸泡5分鐘使蛋白顯白色。蒸餾水沖洗蛋白膠,用刀片從SDS-PAGE電泳凝膠上切下目的蛋白,切成I mm X I mm X I mm的碎片,放入預(yù)處理好的透析袋中,注入2 ml SDS-PAGE電泳緩沖液,將透析袋前后封口 ;
d、電泳回收在水平核酸電泳槽中加入適量SDS-PAGE電泳緩沖液,將裝有凝膠的透析袋置入其中,100 V電壓,4 °C電泳4-5 h,直至凝膠變透明,說明目的蛋白從凝膠中洗脫出來;
e、透析洗脫完畢,吸出透析袋內(nèi)溶液,SDS-PAGE檢測(以10μ I的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量)電泳結(jié)果,鑒定后正確的蛋白溶液裝入干凈的透析袋中,用預(yù)冷的IXPBS溶液(I XPBS (IL)KCl O. 2 g、NaCl 8 g、Na2HPO4 I. 42 g、KH2PO4 O. 27 g)添加尿素[8 M(96 g)、6M(72 g)、4 M(48 g)、2 M(24 g)、0 Μ]于4 °C下分別透析3-5 h,其間換透析液2-3次;
f、將鑒定正確的蛋白溶液(見圖7)純化后的蛋白送云大生物公司制備PybHLH蛋白特異性抗體,該特異性抗體可用于PybHLH蛋白表達(dá)水平檢測、亞細(xì)胞定位檢測、PybHLH蛋白 的純化、免疫沉淀(IP)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試驗(yàn)。實(shí)施例5 PybHLH蛋白特異性抗體的Western檢測
為檢測PybHLH蛋白特異性抗體的有效性,使用APybHLH蛋白抗體分別對大腸桿菌中Δ PybHLH蛋白和PybHLH過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了檢測,本實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法,具體內(nèi)容如下
本實(shí)施例中使用的試劑與儀器如下
垂直蛋白電泳儀、PVDF膜(millipore),半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD);
丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺,10 %APS,TEMED, I X甘氨酸Buffer,I XPBS, I XPBT,脫脂奶粉,Whitman 3MM濾紙等SDS-PAGE和Western試驗(yàn)試劑。本實(shí)施例中材料及處理方法如下
I、Λ PybHLH蛋白的處理使用在16 °C、0. 5 mM IPTG誘導(dǎo)16 h下的菌體,添加5X蛋白上樣緩沖液后,沸水煮10 min ;冰上放置2 min ;4 °C >13 000 rpm離心5 min后即可上樣進(jìn)行SDS-PAGE。2、35S:轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白的提取取I g煙草葉片,在研缽中使用液氮研磨后,加入 900 μ I 蛋白質(zhì)抽提液(10 % 甘油,100 mM Tris-HCl (pH 8. O), I mM PMSF, 5%PVP, 10 mM巰基乙醇)研磨混勻;在4 °C >12 000 rmp離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5ml離心管中,放置在冰上;取100 μ I上清于新的離心管中,其余的置于-20 °C保存?zhèn)溆?;向離心管中添加25 μ I 5Χ蛋白上樣緩沖液后,沸水煮10 min ;冰上放置2 min ;4 °C,13
000rpm離心5 min后即可上樣進(jìn)行SDS-PAGE。3、SDS-PAGE 檢測 Cl)配制 SDS-PAGE 膠;
(2)樣品制備見I和2,上樣后進(jìn)行電泳恒流,濃縮膠30 mA,分離膠40 mA。4> Western blot 檢測
(1)轉(zhuǎn)膜設(shè)定電流為2.O mA/cm2,轉(zhuǎn)膜I h ;
(2)封閉;
(3 )添加一抗(Δ PybHLH抗體);
(4)添加二抗;(羊抗兔的商業(yè)化抗體)(5)結(jié)果觀察
棄I X PBTjP I ml工作液(500 μ I穩(wěn)定劑+ 500 μ I發(fā)光底物,混勻),浸潤整個(gè)PVDF膜,轉(zhuǎn)入成像系統(tǒng)Chemidoc XRS (BIO-RAD),將成像系統(tǒng)上方調(diào)至O檔,選Chemi HiSensitivity進(jìn)行成像。Western Blot檢測結(jié)果如圖8和圖9,圖8中在大約50 kDa出現(xiàn)條帶,圖9中在大約73 kDa出現(xiàn)條帶,這與預(yù)期的結(jié)果相一致,表明本發(fā)明制備的PybHLH蛋白特異性抗體有效,且特異性非常好,適用于PybHLH蛋白的亞細(xì)胞定位檢測、與PybHLH蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)和DNA片段的分離、PybHLH蛋白的表達(dá)檢測等。實(shí)施例6 PybHLH蛋白特異性抗體驗(yàn)證PyMYB-PybHLH互作的Western檢測 為檢測PybHLH蛋白特異性抗體的在驗(yàn)證蛋白互作中的有效性,首先使用Λ PyMYB特異
性抗體沉淀光照0、3、5、7天的云紅梨I號果皮的總蛋白,然后使用Λ PybHLH蛋白抗體檢測PybHLH蛋白。具體內(nèi)容如下
I、實(shí)施例中使用的材料為云紅梨I號光照0、3、5和7天的果皮,削皮后,液氮冷凍,-80°C保存。2、免疫沉淀
(1)云紅梨I號總蛋白的提取分別取紅梨I號光照0、3、5和7天的果皮Ig,在研缽中使用液氮充分研磨成粉末后,加入5 ml蛋白質(zhì)抽提液(10 %甘油,100 mM Tris-HCl (pH8. O), I mM PMSF, 5 % PVP, 10 mM巰基乙醇)研磨混勻;在4 °C抽提3 h后,4 °C >12 000 rmp離心10 min ;將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中,放置在冰上;
(2)使用Bradford緩沖液檢測蛋白濃度后,各取500μ g總蛋白于新的離心管中;
(3)分別添加10μ I PyMYB特異性抗體,4 1搖床過夜;
(4)次日,添加20 μ I Protein-A-Agarose (Santa Cruz), 4 °C搖床 I h;
(5)4°C >2500 rmp 離心 5 min,棄上清;
(6)添加Iml IX磷酸緩沖液,4。(!'搖床清洗5 min ;4 °C >2500 rmp離心5 min,棄上
清;重復(fù)清洗3次;
(7)向沉淀中添加32μ I IX磷酸緩沖液、8 μ I的5Χ蛋白上樣緩沖液后,沸水煮10min ;冰上放置2 min ;4 °C、13 000 rpm離心5 min后即可上樣。3、SDS-PAGE 及 Western 檢測
操作同實(shí)例5,結(jié)果如圖10,光照0、3、5、7天后的云紅梨I號果皮總蛋白中檢測到PybHLH蛋白,這表明使用PyMYB-PybHLH在云紅梨I號果皮中存在相互作用,這些結(jié)果為世界上首次為云南紅梨果皮中PyMYB-PybHLH-PyWD40復(fù)合物模型調(diào)控花青素的生物合成提 供理論支持,同時(shí)表明本發(fā)明制備的PybHLH的特異性抗體專一性強(qiáng),適合檢測PybHLH的表達(dá)及分離PybHLH結(jié)合的蛋白和DNA分子等。
權(quán)利要求
1.云南紅梨基因,其特征在于:基因具有如SEQID NO. 5所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述云南紅梨基因的原核表達(dá)載體pET32a-z^j^K仏其特征在于該載體含有/!/基因,基因的上游有T7啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS, T7啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列,基因的N端和C端均帶有6XHis標(biāo)簽。
3.權(quán)利要求2的所述的原核表達(dá)載體在制備云南紅梨花青素合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白 APybHLH中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2的所述的原核表達(dá)載體在制備PybHLH特異性抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種云南紅梨花青素生物合成及毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白PybHLH基因的特異性片段ΔPybHLH及其原核表達(dá)載體,利用RT-PCR技術(shù)從云南紅梨中克隆特異性片段ΔPybHLH,并構(gòu)建其原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),獲得云南紅梨ΔPybHLH純化蛋白,云南紅梨ΔPybHLH純化蛋白應(yīng)用在制備PybHLH特異性抗體中,該抗體可用于PybHLH蛋白表達(dá)檢測及免疫沉淀和染色質(zhì)免疫共沉淀中,該抗體特異性強(qiáng),能夠準(zhǔn)確的檢測PybHLH蛋白的亞細(xì)胞定位、高效的進(jìn)行PybHLH蛋白的純化、高效分離PybHLH蛋白所結(jié)合的蛋白和DNA片段及檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況。
文檔編號C12N15/29GK102660553SQ20121006499
公開日2012年9月12日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者崔道雷, 張曉東, 李昆志, 樊磊, 舒群, 蘇俊, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)
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