專利名稱：一種交叉保護(hù)性dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種針對(duì)鰻弧菌和海豚鏈球菌的交叉保護(hù)性DNA疫苗。
背景技術(shù)：
獲弧菌(Vibrioanguillarum)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)分別為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌，二者皆為重要的養(yǎng)殖魚類病原菌，其宿主范圍涵蓋多種海水和淡水魚類，包括牙鲆、大菱鲆、羅非魚、美國(guó)紅魚等。在我國(guó)，由鰻弧菌和海豚鏈球菌引起的疫病暴發(fā)流行給多種養(yǎng)殖魚類產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。除了魚類外，鰻弧菌和海豚鏈球菌皆為動(dòng)物感染性病原，能夠感染人類和其它陸生動(dòng)物。目前，分別針對(duì)鰻弧菌和海豚鏈球菌的單一性DNA疫苗在國(guó)際上已有報(bào)道，但是尚無(wú)能夠同時(shí)針對(duì)這兩種病原的交叉保護(hù)性DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種細(xì)菌傳遞的交叉保護(hù)疫苗。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種交叉保護(hù)性DNA疫苗為真核重組表達(dá)質(zhì)粒PIS0。所述重組質(zhì)粒pISO，將質(zhì)粒pBSOU和質(zhì)粒pISilO分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒piS0。交叉保護(hù)性DNA疫苗的制備方法，所述重組質(zhì)粒pISO，將質(zhì)粒pBSOU和質(zhì)粒PlSilO分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒PlSO0所述質(zhì)粒pISilO，以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體PBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒pISilO ；所述質(zhì)粒pBSOU，以鰻弧菌VA68為模板，采用F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體PBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，得質(zhì)粒pBSOU。具體為I)質(zhì)粒PlSilO的構(gòu)建以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T于室溫連接4-6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，得質(zhì)粒pBSSlO ；將質(zhì)粒pBSSlO和質(zhì)粒pID2分別用SmaI和EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，即為質(zhì)粒pISi 10 ； 2) DNA疫苗pISO的構(gòu)建以鰻弧菌VA68為模板，采用F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T于室溫連接4-6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，得質(zhì)粒pBSOU ；
將質(zhì)粒pBSOU和質(zhì)粒pISilO分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為DNA疫苗pISO ;所述弓丨物Fl 為 5’ -CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’，Rl 為 5’ -CTCGAGCCCGGGGA TATGAATATAATTATATGAGCT-3’ ；所述引物為 F2 為 5’ -CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3，，R2 為 5，-CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3，。交叉保護(hù)性DNA疫苗的應(yīng)用，所述DNA疫苗在制備具有預(yù)防和治療鰻弧菌和海豚鏈球菌的交叉疫苗制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明疫苗能夠同時(shí)保護(hù)魚類抵抗鰻弧菌和海豚鏈球菌感染，且保護(hù)效應(yīng)分別高達(dá)83 %和82 %。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。 2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPres s 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實(shí)施例I交叉保護(hù)性DNA疫苗pISO的構(gòu)建步驟I)質(zhì)粒pISilO的構(gòu)建以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s，5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s, 62°C 60s, 72°C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)IOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與載體pBS-T (購(gòu)于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室溫連接4-6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含安卡青霉素(Ap，100ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pBSSlO。將pBSSlO和質(zhì)粒pID2 (pID2構(gòu)建過(guò)程參見 Hu YH, Sun L. A bivalent Vibrio harveyi DNA vaccine induces strongprotection in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Vaccine 2011 ；29 4328-33)分別用SmaI和EcoRV酶切，分別回收0. 5kb和6kb片段，將二者用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pISilO。所述菌株G26保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 1984，分類命名為海豚鏈球菌(Sti^ptococcus iniae)，保藏日期2007年3月22日。所述弓丨物為Fl :5’ -CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’和 Rl :5’ -CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3，。
所述LB組成成分按重量百分比計(jì)I. O %蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5 %蒸餾水。步驟2) DNA疫苗pISO的構(gòu)建以鰻弧菌VA68為模板，采用F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 60s，5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s, 65°C 60s, 72°C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)IOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。PCR產(chǎn)物純化后與天根載體pBS-T于室溫連接4_6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為PBS0U。將pBSOU和上述質(zhì)粒pISilO用SmaI酶切，分別回收Ikb和6. 5kb片段，將二者用T4DNA連接酶于室溫連接2_4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，SP為DNA疫苗pISO。所述獲弧菌VA68 購(gòu)于美國(guó) ATCC(American type culture collection),編號(hào)68554,分類名為 Vibrio anguillarum。所述弓丨物為 F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3’和 R2 :5’ -CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3，。實(shí)施例2DNA疫苗的應(yīng)用步驟I)疫苗制備液。將上述所得DNA疫苗質(zhì)粒pISO在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml，即為疫苗制備液。步驟2)疫苗的接種。將100條牙鲆(每條重約11. 3g)隨機(jī)分為4組，每組25條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的疫苗制備液，將B和D組(對(duì)照組)的每條魚分別腹腔注射IOOul PBS。步驟3)鰻弧菌和海豚鏈球菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)鰻弧菌VA68和海豚鏈球菌G26至0D_為0. 9，然后離心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌體。將鰻弧菌菌體懸浮于PBS中至終濃度為4xl07cfu/ml，即為鰻弧菌懸液；將海豚鏈球菌菌體懸浮于PBS中至終濃度為lxl08cfu/ml，即為海豚鏈球菌懸液。步驟4)疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3)的鰻弧菌懸液腹腔注射步驟2)的A和B組魚，用上述步驟3)的海豚鏈球菌懸液腹腔注射步驟2)的C和D組魚，每條魚的注射量為IOOu I。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚的總死亡數(shù)目A組，3條；B組，18條；C組，3條；D組，17條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS)RPS = IOOx (I-免疫組魚的總死亡百分比/對(duì)照組魚的總死亡百分比)故DNA疫苗pISO針對(duì)鰻弧菌和海豚鏈球菌的免疫保護(hù)效率分別為83%和82%。由此得出DNA疫苗pISO對(duì)鰻弧菌和海豚鏈球菌具有良好的交叉免疫保護(hù)效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種交叉保護(hù)性DNA疫苗，其特征在于DNA疫苗為真核重組表達(dá)質(zhì)粒pISO。
2.按權(quán)利要求I所述的交叉保護(hù)性DNA疫苗，其特征在于述重組質(zhì)粒pISO，將質(zhì)粒PBSOU和質(zhì)粒pISilO分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒pISO。
3.—種權(quán)利要求I所述的交叉保護(hù)性DNA疫苗的制備方法，其特征在于所述重組質(zhì)粒pISO，將質(zhì)粒pBSOU和質(zhì)粒pISilO分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒PI SO。
4.按權(quán)利要求3所述的交叉保護(hù)性DNA疫苗的制備方法，其特征在于所述質(zhì)粒PlSilO,以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pBS_T連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒pISilO ； 所述質(zhì)粒PBS0U，以鰻弧菌VA68為模板，采用F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體PBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，得質(zhì)粒pBSOU。
5.按權(quán)利要求3或4所述的交叉保護(hù)性DNA疫苗的制備方法，其特征在于 1)質(zhì)粒pISilO的構(gòu)建以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T于室溫連接4-6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，得質(zhì)粒pBSSlO ； 將質(zhì)粒pBSSlO和質(zhì)粒pID2分別用SmaI和EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后在含安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，即為質(zhì)粒PlSilO ； 2)DNA疫苗pISO的構(gòu)建以鰻弧菌VA68為模板，采用F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體PBS-T于室溫連接4-6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，得質(zhì)粒pBSOU ； 將質(zhì)粒pBSOU和質(zhì)粒pISilO分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為DNA疫苗pISO ;所述引物 Fl 為 5’ -CCCGGGCCACCATGGCAGAAITTAATCAATCAAA-3’，R1 為 5’ -CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’;所述引物為 F2 為 5’ -CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3，，R2 為 5，-CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3，。
6.一種權(quán)利要求I所述的交叉保護(hù)性DNA疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗在制備具有預(yù)防和治療鰻弧菌和海豚鏈球菌的交叉疫苗制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種針對(duì)鰻弧菌和海豚鏈球菌的交叉保護(hù)性DNA疫苗。DNA疫苗為真核重組表達(dá)質(zhì)粒pISO。制備方法所述重組質(zhì)粒pISO，將質(zhì)粒pBSOU和質(zhì)粒pISi10分別用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得質(zhì)粒pISO。本發(fā)明所述DNA疫苗pISO對(duì)鰻弧菌和海豚鏈球菌分別有83％和82％的免疫保護(hù)效率。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102614526SQ20121006514
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者孫云, 孫黎, 胡永華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所