專利名稱：一種紅掌苞片和花序總rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物總RNA提取方法，特別涉及一種紅掌苞片和花序總RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
紅掌(Anthurium andraeanum)是世界著名的盆栽、切花花丼,市場份額巨大,在我國有著廣泛的種植區(qū)域。隨著應(yīng)用的擴(kuò)大，紅掌品種培育工作方興未艾，但是由于資源的限制，新品種培育越來越困難，所以世界各地的育種專家都將新品種的培育寄托到生物技術(shù)上來?；谥参锓肿由飳W(xué)發(fā)展壯大的生物技術(shù)育種，必須將研究深入到核酸水平，這期間，獲得可靠、豐富的核酸信息是做好育種工作的前提，而RNA提取幾乎是必不可少一個環(huán)節(jié)。紅掌的觀賞器官是其苞片，而不是花，但是常規(guī)雜交育種必須研究其花器官，所以紅掌苞片和花序的總RNA提取在其分子生物學(xué)育種過程中顯得十分必要，但是目前國外對紅掌分子生物學(xué)的研究剛剛展開，國內(nèi)更是沒有可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。在對模式植物及大宗農(nóng)作物的研究中，Trizol作為一種廣譜、高效的RNA提取試劑被廣泛的應(yīng)用，但是不同的植物對該種試劑的適用度不同，對于紅掌而言，這種最為普遍的試劑卻不能夠提取出理想的總 RNA。為了對紅掌進(jìn)行更為深入的研究，必須找到一種高效、快捷而又經(jīng)濟(jì)的總RNA提取方法，這樣才能突破紅掌的生物技術(shù)育種瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種紅掌的苞片和花序總RNA提取的方法，該方法高效、快捷、 經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種紅掌苞片和花序總RNA的提取方法，其特征在于所述方法為(I)將幼嫩紅掌苞片和花序置于研缽中液氮研磨，獲得研磨干粉；(2)將裝有初始RNA提取液的離心管于 63 67°C水浴預(yù)熱，加入所述的研磨干粉，迅速蓋嚴(yán)并劇烈搖晃15 20s，63 67°C水浴靜置5 8min，加入初始RNA提取液1/5體積的氯仿A，再次劇烈搖晃15 20s，室溫下靜置 5 8min，離心，獲得上清液A ;所述初始RNA提取液由終濃度如下的組分構(gòu)成0. 2g/L十六烷基三甲基溴化銨、O. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、O. 073g/L乙二胺四乙酸、I. 168g/L氯化鈉、
O.121g/L Tris、體積濃度O. I %的焦炭酸二乙酯和體積濃度2%的β-巰基乙醇；(3)取上清液Α，加入所述上清液Α1/5體積的氯仿B劇烈搖晃15 20s后靜置5 8min，離心，獲得上清液B ； (4)取上清液B，加入上清液B1/2體積的8M LiCl溶液，混勻，_20°C放置5 Sh,離心，收集沉淀記為沉淀A，沉淀A用體積濃度75 %乙醇水溶液洗滌，離心收集沉淀記為沉淀B，沉淀B自然晾干到乙醇剛揮發(fā)完全為止，獲得所述紅掌苞片和花序總RNA。本發(fā)明所述的紅掌苞片和花序總RNA的提取方法，所述方法優(yōu)選按如下步驟進(jìn)行(I)將幼嫩紅掌苞片和花序置于研缽中液氮研磨，獲得研磨干粉；(2)將裝有初始RNA提取液的離心管于65°C水浴預(yù)熱，加入研磨干粉，迅速蓋嚴(yán)并劇烈搖晃15s，65°C水浴靜置5min，加入初始RNA提取液1/5體積的氯仿A，再次劇烈搖晃15s，室溫下靜置5min， 13000rpm/min離心15min,獲得上清液A ;所述初始RNA提取液由終濃度如下的組分構(gòu)成
O.2g/L十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、0. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、0. 073g/L乙二胺四乙酸(EDTA)U. 168g/L氯化鈉、O. 121g/L Tris、體積濃度O. I %的焦炭酸二乙酯(DEPC) 和體積濃度2%的β -巰基乙醇；(3)取上清液Α，加入上清液Α1/5體積的氯仿B劇烈搖晃 15s后靜置5min, 13000rpm/min離心IOmin,獲得上清液B ； (4)取上清液B,加入上清液B1/2 體積的8M LiCl溶液，混勻，_20°C放置5h，12000rpm/min離心lOmin，收集沉淀記為沉淀A， 并用體積濃度75%乙醇水溶液洗滌，離心收集沉淀記為沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇剛揮發(fā)完全為止，獲得所述紅掌苞片和花序總RNA。進(jìn)一步，所述SM LiCl溶液按如下方法制得將LiCl溶于水，再加入焦炭酸二乙酯混合，室溫下靜置I 2天，然后lkg/cm2熱壓120°C蒸氣滅菌20min，冷卻獲得SM LiCl溶液，所述水和焦炭酸二乙酯的體積比為I : O. 001，所述的LiCl的摩爾濃度為8M，這里所述的室溫是指23°C ±2°C。步驟⑷所述沉淀B在室溫下(23°C左右)自然晾干時間為lOmin。本發(fā)明所述RNA提取液提取RNA過程中，事先不能稱量材料(紅掌的苞片和花序) 的重量，因?yàn)樵谝旱心ミ^程中會有相當(dāng)多的材料凝固在研磨棒和研缽內(nèi)壁上，損失非常多，應(yīng)該研磨后用藥匙往緩沖液中加入適量的研磨漿液進(jìn)行提取，提取過程中加入異戊醇、 苯酚與否對結(jié)果無影響，只加入氯仿而不加異戊醇，既能簡化試驗(yàn)流程，對結(jié)果無任何不良影響，又能減少對人體危害，優(yōu)點(diǎn)明顯。本發(fā)明加入氯仿后一定要劇烈搖晃，盡可能的將雜質(zhì)與RNA分開，吸取上清的時候避免吸到中間層也是十分重要的。本發(fā)明用氯化鋰沉淀前，上清液吸取的越多越能提高產(chǎn)量，但是也帶來了雜質(zhì)含量的提高，所以一般吸取上清液總體積的80%，這樣可以保證RNA的質(zhì)量較高；且沉淀時間太短會導(dǎo)致產(chǎn)量太低，太長則會導(dǎo)致雜質(zhì)過多，所以在5 8h為好。本發(fā)明沉淀后不提倡使用過高的轉(zhuǎn)數(shù)離心，那樣會導(dǎo)致雜質(zhì)含量升高，加入酒精后也不提倡用低于12000rpm/min的轉(zhuǎn)數(shù)離心,那樣會導(dǎo)致沉淀不易貼壁,傾倒酒精時會失手倒掉沉淀。沉淀不能晾太長時間，否則會增加溶解難度，通常為IOmin。本發(fā)明對提取的RNA進(jìn)行凝膠電泳分析時，不采用甲醛變性膠，經(jīng)比較，普通電泳效果與變性膠沒有明顯區(qū)別，而工作量和成本卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于變性膠。電泳電壓和電流不宜太高，過高的電壓電流會導(dǎo)致電泳液溫度驟升，使凝膠變熱、發(fā)黑，嚴(yán)重影響電泳效果；電泳時間也不易過長，時間太長既不能提高電泳質(zhì)量，還會導(dǎo)致RNA降解。本發(fā)明所述氯仿A、氯仿B均為氯仿，所述上清液A、上清液B均為上清液，所述沉淀A、沉淀B均為沉淀，字母A和B均無意義，為便于區(qū)分不同步驟而命名。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(I)最大限度地減少了有毒有害藥品的使用，例如異戊醇、苯酚在本發(fā)明中不再使用，減輕了 RNA提取對人體的危害；(2) 可以獲得足量、純凈、沒有DNA污染的高質(zhì)量RNA，省去了后續(xù)試驗(yàn)中必須解決的去除DNA 污染的人力和財力；(3)用常規(guī)方法達(dá)到了商品試劑達(dá)不到的效果本發(fā)明方法所用藥品均為分子實(shí)驗(yàn)室常用藥品，成本低廉，配制容易，配制同體積(IOOml)藥品，可比選用美國 Invitrogen公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒(12322-012和15596-018)節(jié)省1000元以上，可以大大節(jié)省經(jīng)費(fèi)開支；(4)本發(fā)明方法操作簡單，無論是大量提取還是微量提取紅掌總RNA， 都可以在短時間內(nèi)得到優(yōu)質(zhì)產(chǎn)物。


圖I是實(shí)施例I提取紅掌苞片和花序總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中I為 18sRNA,2 為 28sRNA ；圖2是對比例I用RNA提取試劑盒提取紅掌苞片和花序總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中 I 為 18sRNA，2 為 28sRNA，3 為 DNA ；圖3是對比例2用RNA提取試劑盒提取紅掌苞片和花序總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I一、試劑的配制I)初始RNA提取液的配制稱取2g CTAB、2g PVP、0. 73g EDTAU I. 68g氯化鈉于一個干凈的250ml三角瓶中，加水定容到100ml，然后加入體積濃度O. 1%的DEPC (O. Iml)， 搖動混勻溶液，密閉狀態(tài)下室溫靜置I 2d，然后lkg/cm2熱壓120°C蒸氣滅菌20min，冷卻后無菌條件下加入1.21g Tris，并用質(zhì)量濃度100%濃鹽酸調(diào)整pH值到8.0，密封備用，使用前加入體積濃度2%的β -巰基乙醇(2ml)。2)8M LiCl溶液的配制將24. 16g氯化鋰溶于50ml蒸餾水中同時加入50 μ I DEPC,混勻后室溫下靜置I 2天,然后lkg/cm2熱壓120°C蒸氣滅菌20min,冷卻備用。3)0. 5mol/L EDTA (pH8. O)的配制將 18. 6g EDTANa2 · H2O 用蒸餾水溶解，定容至 100ml,用氫氧化鈉顆粒調(diào)節(jié)pH值至8. O, lkg/cm2熱壓120°C蒸氣滅菌20min后備用。4) DEPC處理的水廣口瓶一個，量取IL雙蒸水，加入lmlDEPC，密封，混勻后室溫靜置l-2d,然后lkg/cm2熱壓120°C蒸氣滅菌20min,冷卻備用。5) RNA 檢測緩沖液(TBE)的配制將 3. 24g Tris、I. 65g 硼酸、I. 2ml0. 5mol/L 的 EDTA溶于300ml DEPC處理的水中，混勻備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。二、紅掌苞片和花序總RNA的提取方法(I)將幼嫩紅掌苞片和花序置于研缽中液氮研磨(液氮在行使完使命后變成空氣揮發(fā)了，剩下的是干粉，不是漿液，如果動作遲緩，干粉變成了漿液，實(shí)驗(yàn)就失敗了)，獲得研磨干粉；(2)將裝有Iml初始RNA提取液的I. 5ml離心管于65°C水浴預(yù)熱，用藥匙加入IOOmg上述研磨干粉，迅速蓋嚴(yán)并劇烈搖晃15s，65°C水浴靜置5min，加入初始RNA提取液(Iml) 1/5體積的氯仿(200 μ I)，再次劇烈搖晃15s，室溫(23°C )下靜置5min，4°C下 13000rpm/min離心15min，獲得上清液A ； (3)取上清液A (800 μ I)，加入上清液A1/5體積的氯仿(160 μ I)劇烈搖晃15s后靜置5min,4°CT 13000rpm/min離心IOmin,獲得上清液B ；(4)取上清液B (600 μ I)置于一個新的I. 5ml離心管中，加入上清液B1/2體積的8M LiCl 溶液(300μ 1)，混勻，-20°C放置5h，4°C下12000rpm/min離心lOmin，收集沉淀記為沉淀A， 并用體積濃度75%乙醇水溶液洗滌，每次用1ml，洗滌2次，4°C下12000rpm/min離心IOmin 收集沉淀記為沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇剛揮發(fā)完全為止(lOmin)，獲得所述紅掌苞片和花序總RNA20 μ go 三、紅掌苞片和花序總RNA的電泳檢測(I) RNA 溶解液將上述總RNA20 μ g溶于20 μ I上述DEPC處理的水中。(2)瓊脂糖凝膠電泳稱取2g瓊脂糖，溶于20ml上述TBE緩沖液中，全自動微波爐內(nèi)煮膠，加入3 μ I EB (溴化乙錠)溶液后混勻，做電泳膠；電泳膠凝固好后取3 μ I上述RNA溶解液點(diǎn)樣并電泳，電泳條件80伏特，70毫安；30min后凝膠成像系統(tǒng)下檢測結(jié)果，結(jié)果見圖I。對比例I用RNA提取試劑盒(12322-012，美國Invitrogen公司)提取紅掌苞片和花序總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳同實(shí)施例1，結(jié)果見圖2，結(jié)果表明本發(fā)明方法提取出純凈、無DNA污染、條帶清晰的目標(biāo)產(chǎn)物，而對比方法雖然也能提取出所需要的RNA，但是DNA污染嚴(yán)重，給后續(xù)試驗(yàn)帶來很大麻煩，去除其DNA污染需要大量人力和財力。圖中I指示18sRNA，2指示 28sRNA, 3指示基因組DNA污染。對比例2用RNA提取試劑盒(15596-018，美國Invitrogen公司)提取紅掌苞片和花序總 RNA,瓊脂糖凝膠電泳同實(shí)施例I，結(jié)果見圖3，結(jié)果表明對比方法無法提出任何RNA產(chǎn)物，此試劑不適合紅掌苞片和花序的總RNA提取。
權(quán)利要求
1.一種紅掌苞片和花序總RNA的提取方法，其特征在于所述方法為(I)將幼嫩紅掌苞片和花序置于研缽中液氮研磨，獲得研磨干粉；(2)將裝有初始RNA提取液的離心管于 63 67°C水浴預(yù)熱，加入所述的研磨干粉，迅速蓋嚴(yán)并劇烈搖晃15 20s，63 67°C水浴靜置5 8min，加入初始RNA提取液1/5體積的氯仿A，再次劇烈搖晃15 20s，室溫下靜置 5 8min，離心，獲得上清液A ;所述初始RNA提取液由終濃度如下的組分構(gòu)成0. 2g/L十六烷基三甲基溴化銨、O. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、O. 073g/L乙二胺四乙酸、I. 168g/L氯化鈉、O.121g/L Tris、體積濃度O. I %的焦炭酸二乙酯和體積濃度2%的β-巰基乙醇；(3)取上清液Α，加入所述上清液Α1/5體積的氯仿B劇烈搖晃15 20s后靜置5 8min，離心，獲得上清液B ； (4)取上清液B，加入上清液B1/2體積的8M LiCl溶液，混勻，_20°C放置5 Sh,離心，收集沉淀記為沉淀A，沉淀A用體積濃度75 %乙醇水溶液洗滌，離心收集沉淀記為沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇剛揮發(fā)完全為止，獲得所述紅掌苞片和花序總RNA。
2.如權(quán)利要求I所述的紅掌苞片和花序總RNA的提取方法，其特征在于所述方法為(1)將幼嫩紅掌苞片和花序置于研缽中液氮研磨，獲得研磨干粉；(2)將裝有初始RNA 提取液的離心管于65°C水浴預(yù)熱，加入所述的研磨干粉，迅速蓋嚴(yán)并劇烈搖晃15s，65°C 水浴靜置5min，加入初始RNA提取液1/5體積的氯仿A，再次劇烈搖晃15s，室溫下靜置 5min, 13000rpm/min離心15min,獲得上清液A ;所述初始RNA提取液由終濃度如下的組分構(gòu)成0. 2g/L十六烷基三甲基溴化銨、O. 2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、O. 073g/L乙二胺四乙酸、I. 168g/L氯化鈉、O. 121g/L Tris、體積濃度O. I %的焦炭酸二乙酯和體積濃度2 %的 β -巰基乙醇；(3)取上清液Α，加入上清液Α1/5體積的氯仿B劇烈搖晃15s后靜置5min， 13000rpm/min離心IOmin,獲得上清液B ； (4)取上清液B,加入上清液B1/2體積的8M LiCl 溶液，混勻，_20°C放置5h，12000rpm/min離心lOmin，收集沉淀記為沉淀A，并用體積濃度 75%乙醇水溶液洗滌，離心收集沉淀記為沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇剛揮發(fā)完全為止， 獲得所述紅掌苞片和花序總RNA。
3.如權(quán)利要求I或2所述的紅掌苞片和花序總RNA的提取方法，其特征在于步驟(4) 所述SM LiCl溶液按如下方法制得將LiCl溶于水，再加入焦炭酸二乙酯混合，室溫下靜置 I 2d，然后lkg/cm2熱壓120°C蒸氣滅菌20min，冷卻獲得8M LiCl溶液，所述水和焦炭酸二乙酯的體積比為I : O. 001，所述的LiCl的摩爾濃度為8M。
4.如權(quán)利要求I或2所述的紅掌苞片和花序總RNA的提取方法，其特征在于步驟(4) 所述沉淀B在室溫自然晾干時間為lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅掌苞片和花序總RNA的提取方法將幼嫩紅掌苞片和花序經(jīng)液氮研磨、RNA提取液63～67℃水浴靜置5～8min，加入RNA提取液1/5體積的氯仿A，再次劇烈搖晃15～20s，室溫下靜置5～8min，離心，獲得上清液，取上清液經(jīng)氯仿、8M LiCl溶液處理后，離心，獲得所述紅掌苞片和花序總RNA；本發(fā)明最大限度地減少了有毒有害藥品的使用，減輕了RNA提取對人體的危害；可以獲得足量、純凈、沒有DNA污染的高質(zhì)量RNA；本發(fā)明方法操作簡單，在短時間內(nèi)得到優(yōu)質(zhì)產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/10GK102586235SQ20121006569
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者劉慧春, 周江華, 朱開元, 鄒清成, 馬廣瑩 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心