專利名稱：一種降解發(fā)酵藥渣中殘余林可霉素的酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物菌株處理藥物廢渣、飼料蛋白技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種降解發(fā)酵藥渣中殘余林可霉素的酵母菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
“超級細(xì)菌”是細(xì)菌和抗生素博弈的產(chǎn)物，抗生素在殺死細(xì)菌的同時，也讓一部分未死的細(xì)菌不斷進(jìn)化，產(chǎn)生了耐藥性，抗生素使用越多，細(xì)菌耐藥性也越強(qiáng)。據(jù)調(diào)查，我國60%的病人使用抗生素都是自作主張，只有少數(shù)會向醫(yī)生尋求幫助。研究表明，抗生素攝 入后除少部分殘留在體內(nèi)，85%以上以原藥和代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)由病人與動物的糞尿排出體外，其殘留的抗生素進(jìn)入土壌、水域等環(huán)境中，在雨水、風(fēng)等攜帯或促進(jìn)下，進(jìn)而污染地下水、地表水和人們的生活用水。近年來，在人們生活用水中檢測到抗生素的報道越來越多?？梢?，這些殘余的抗生素進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，破壞了環(huán)境的微生態(tài)平衡。因此，控制抗生素的濫用比研制殺滅“超級細(xì)菌”的抗生素更為重要和緊迫。林可霉素類藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，屬于目前結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的抗生素之一。它的作用機(jī)理是通過與核糖體的大亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成，對大多數(shù)革蘭陽性菌和某些厭氧的革蘭陰性菌有抗菌作用。但是在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素過程中，由于存在提煉純度低等問題，造成廢渣中殘留林可霉素含量高，難降解等諸多問題，造成嚴(yán)重環(huán)境污染，難以達(dá)到直接利用或排放標(biāo)準(zhǔn)。因此，將林克鏈霉菌發(fā)酵藥渣中殘余的高濃度的林可霉素進(jìn)行生物降解，是將廢渣有效實現(xiàn)廢物利用的關(guān)鍵步驟，目前備受關(guān)注。作為單細(xì)胞真核微生物的酵母菌菌體蛋白質(zhì)含量高，富含多種維生素，能夠用作飼料，可利用エ廠排出的有機(jī)廢料、廢水生長繁殖。利用酵母菌降解廢渣中高濃度的林可霉素，這不僅變廢為寶，還能解決環(huán)境污染問題，可謂ー舉兩得。同時，在微生物家族中，酵母菌是食品、飼料等エ業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)最成熟的種類，研究開發(fā)酵母菌藥洛飼料有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種可以有效降解林克鏈霉菌發(fā)酵藥渣中殘余林可霉素含量的酵母菌，使用該酵母菌可以開發(fā)酵母菌源生物飼料。本發(fā)明所述的酵母菌株，為半乳糖霉{Galactomyces geotrichud) S9菌株。上述半乳糖霉S9菌株已于2012年3月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址武漢市珞珈山武漢大學(xué))，保藏登記入冊編號CCTCC M 2012056。上述半乳糖霉S9菌株在平板上呈現(xiàn)雪花狀，顏色為白色，呈薄層狀，表面比較干燥，四周有絨絲狀物質(zhì)；中間沒有突起，該菌的生物量特別大，2周即可長滿整個平板，菌落直徑約4 5 cm ;細(xì)胞體積大小為(I. 60 2. 36Mm)X (I. 6 4. 9Mm);光學(xué)顯微鏡下觀察S9大多數(shù)細(xì)胞的形態(tài)呈橢圓形、腎形、圓柱形，有些細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀細(xì)胞的生殖方式為裂殖。上述半乳糖霉S9菌株降解林可霉素，源于菌株發(fā)酵液中的某種代謝物質(zhì)成份，主要作用機(jī)理是菌株產(chǎn)生的某種代謝物質(zhì)成份對林可霉素結(jié)構(gòu)中的某個關(guān)鍵化學(xué)鍵產(chǎn)生作用，從而使其分解成小分子物質(zhì)。上述S9菌株系本發(fā)明人在開展發(fā)酵藥渣中高濃度林可霉素的生物降解的研究中，從林可霉素生產(chǎn)藥廠的大量廢水廢渣中篩選到的地霉菌屬酵母菌。研究發(fā)現(xiàn)其對林可霉素具極高降解活性，通過多批次降解林可霉素藥物活性試驗確定其活性后，委托武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)對菌株進(jìn)行鑒定,確定為半乳糖霉菌G geotrichum。本發(fā)明半乳糖霉S9菌株是一類全新發(fā)現(xiàn)的具有顯著的降解林可霉素的地霉菌酵母菌菌株，其降解功能主要源于發(fā)酵液中的某種代謝物質(zhì)成份，主要作用機(jī)理是菌株產(chǎn)生的某種代謝物質(zhì)對林可霉素結(jié)構(gòu)中的某個關(guān)鍵化學(xué)鍵，從而使其分解成小分子物質(zhì)。同時半乳糖霉S9菌株在本發(fā)明所述的培養(yǎng)條件下生長迅速，容易進(jìn)行エ業(yè)化生產(chǎn)，具備了很好的應(yīng)用開發(fā)前景，本發(fā)明利用半乳糖霉S9菌株處理林克鏈霉菌發(fā)酵藥渣具有高效性和實用性。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)ー步地說明
圖I是本發(fā)明實施例中林可霉素濃度與抑菌圈直徑線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下面實施例中，如果沒有特殊說明，均為常規(guī)方法；百分含量如果沒有特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。擴(kuò)大培養(yǎng)半乳糖霉(にgeoiricAa ) S9菌株
制備菌液，將菌液接入含林可霉素的藥渣和稻殼固態(tài)培養(yǎng)基中，提取林可霉素藥物，進(jìn)行降解活性試驗，確定其對林可霉素的降解作用。半乳糖霉S9菌株的培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)
I、試管種培養(yǎng)
培養(yǎng)基配方為0. 2 1%酵母粉、O. 5 2%蛋白胨、O. I 2%葡萄糖；pH3 6。將S9菌體接種到培養(yǎng)基上，20 30°C下培養(yǎng)2 5天，獲得試管種。2、液體擴(kuò)大培養(yǎng)
液體培養(yǎng)基配方為0. 2 1%酵母提取物；0. 5 2%蛋白胨；0. I 2%葡萄糖；pH值3 6，其余為水。將試管種接種到500ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200ml，于20 30°C下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時間2 5天，轉(zhuǎn)速為200 300 rpm。半乳糖霉S9菌株降解林可霉素活性試驗
I、制備試驗用藥渣培養(yǎng)基
將發(fā)酵新鮮藥渣5g和Ig稻殼混合均勻，121 °C高壓蒸汽滅菌30 min,作為測試降解林可霉素活性的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。2、制備待測菌液
按上述液體擴(kuò)大培養(yǎng)方法制備S9待測菌液。3、制備對照用試劑
對照I :前述2制備待測菌液方法制備對照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入S9菌株。
對照2 :以50mM磷酸緩沖液作為對照。對照3 以等量的無菌水溶液作為對照。4、制備指示菌藤黃八疊球菌菌液
培養(yǎng)指示菌藤黃八疊球菌的培養(yǎng)基配方將O. 5 %酵母提取物、1%蛋白胨、l%NaCl、pH7. 5。培養(yǎng)條件將藤黃八疊球菌菌體接種到100 ml培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)I天，獲得指示菌菌液。5、試驗方法 (1)將5ml上述待測菌液2及對照用試劑3加入上述試驗用藥渣固態(tài)培養(yǎng)基I中，在室溫下靜止培養(yǎng)2 3周，觀察至有菌體產(chǎn)生時再加入15ml無菌水?dāng)噭颍o置24h，使其中殘余林可霉素充分溶解到水中；
(2)制備平板取6套無菌培養(yǎng)皿，分別加入約20ml上述4培養(yǎng)基(加I.8 2%瓊脂)后，置水平玻璃板上凝固，作為底層；另取冷卻至50°C左右的50ml上述4培養(yǎng)基(加I. 8 2%瓊脂)，加入Iml指示菌藤黃八疊球菌菌懸液，迅速搖勻后，用IOml破ロ吸管取6ml混菌培養(yǎng)基倒在底層平板上，作為菌層，并放置在水平玻璃板上凝固；
(3)在培養(yǎng)基平板底部作好相應(yīng)標(biāo)記，用彎頭鑷子在每個培養(yǎng)皿中等距離放入4個牛津杯；
(4)用滴管分別將高、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液加入到牛津杯中，以滴滿為度，換上皿蓋；
(5)將培養(yǎng)皿平穩(wěn)送入恒溫箱,37°C下培養(yǎng)16 18h； (6)用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直
徑;
(7)制作林可霉素濃度與抑菌圈直徑間線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取林可霉素純品，溶于蒸餾水，先配成儲備液。再稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法測定不同濃度下的抑菌圈直徑大小，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；如圖I所示。降解率為(初始濃度ー加菌液反應(yīng)后的濃度)/初始濃度 分別用3種對照藥劑，每個處理重復(fù)三次。6、試驗結(jié)果
實驗數(shù)據(jù)結(jié)果如表I所示
表I半乳糖霉(にgeoiricAw ) S9菌株對林可霉素的降解效果
丨咎理前r丨咎理后r[
樣品處理抑菌圈直徑(mm) 初始濃度(mg/ml) 抑菌圈直徑(mm) _林可霉素濃度(mg/ml) 降解率(％)
S9 菌液作用 7 天 12.5 _O. 77_8. 4_O. 56 _27.2 _
S9 菌液作用 10 天 12. 3O. 768.1O. 52:31.6
S9 菌液作用 14 天 12. 5O. 777.9O. 51:33.8
對照 I 作用 14 天 12. 5O. 7712.5O. 76: I. 3
對照 2 作用 14 天 12. 2 _O. 76_12. 3 _O. 76 _O_
對照 3 作用 14 天 12.3O. 7612.3O. 76
結(jié)果表明，半乳糖霉菌S9菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物對林可霉素發(fā)酵藥渣中的殘余林可霉素具較好的降解效果。處理廢渣7天、10天、14天的降解率分別達(dá)到27. 2%、31. 6%,33. 8%。同樣條件下，對照處理廢渣，其中林可霉素的濃度幾乎不變，從而進(jìn)ー步證明了半乳糖霉菌S9菌株對廢渣中殘余林可霉素的降解功能。以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例一將半乳糖霉菌S9菌株接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖巾!1值3 6。將半乳糖霉菌S9菌株接種到培養(yǎng)基上，20 30°C下培養(yǎng)2 5天，獲得試管種。將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中海瓶裝100ml)，液體培養(yǎng)基配方為1%酵母提取物；2%蛋白胨；2%葡萄糖；pH3 6，余下為水。將試管種接種到500ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200ml，于20 30°C下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時間2 5天，轉(zhuǎn)速為200 300rpm。該菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)物即為可降解林可霉素的培養(yǎng)液。實施例ニ
基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為0. 2%酵母提取物；0. 5%蛋白胨；0. 1%葡萄糖。實施例三 基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為0. 5%酵母提取物；1 %蛋白胨；1%葡萄糖。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明所述的酵母菌株，為半乳糖霉S9菌株。
2.如權(quán)利要求I所述的酵母菌株，已于2012年3月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記入冊編號CCTCC M 2012056。
3.上述半乳糖霉S9菌株菌株在平板上呈現(xiàn)雪花狀，顏色為白色，呈薄層狀，表面比較干燥，四周有絨絲狀物質(zhì)；中間沒有突起，該菌的生物量特別大，2周即可長滿整個平板，菌落直徑約4 5 cm ;細(xì)胞體積大小為(I. 60 2. 36Mm) X (I. 6 4. 9Mm);光學(xué)顯微鏡下觀察S9大多數(shù)細(xì)胞的形態(tài)呈橢圓形、腎形、圓柱形，有些細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀細(xì)胞的生殖方式為裂殖。
4.上述半乳糖霉S9菌株降解林可霉素，源于菌株發(fā)酵液中的某種代謝物質(zhì)成份對林可霉素結(jié)構(gòu)中的某個關(guān)鍵化學(xué)鍵產(chǎn)生作用，從而使林可霉素分解成小分子物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母菌株，為半乳糖霉S9菌株，于2012年3月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記入冊編號CCTCC M2012056，上述半乳糖霉S9菌株降解林可霉素，源于菌株發(fā)酵液中的某種代謝物質(zhì)成份，主要作用機(jī)理是菌株產(chǎn)生的某種代謝物質(zhì)成份對林可霉素結(jié)構(gòu)中的某個關(guān)鍵化學(xué)鍵產(chǎn)生作用，從而使其分解成小分子物質(zhì)。同時半乳糖霉S9菌株在本發(fā)明所述的培養(yǎng)條件下生長迅速，容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，具備了很好的應(yīng)用開發(fā)前景，本發(fā)明利用半乳糖霉S9菌株處理林克鏈霉菌發(fā)酵藥渣具有高效性和實用性。
文檔編號C12N1/16GK102676407SQ20121006625
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者丁鋒, 和晶亮, 唐悅, 張 林, 張清會, 沈艷麗, 牛秋紅 申請人:南陽師范學(xué)院