專利名稱：一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，具體為一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法(LAMP)基本原理，具備速度快、特異性強等優(yōu)點的基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，簡寫AF)是一種真菌毒素，主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生，它影響機體的免疫系統(tǒng)、致突變、致畸、致癌，對動物體和人體健康造成嚴重威脅。 我國最新的飼料衛(wèi)生標準對霉菌和毒素都做了嚴格要求。目前檢測黃曲霉毒素的方法有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。但是，這些檢測霉菌的方法其處理方法均局限于傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法以及生物學的聚合酶鏈式反應(yīng)法(PCR)，前者操作十分麻煩，時間需要4 7天，后者對儀器以及反應(yīng)條件比較高，檢測成本也相應(yīng)提升，難以做到較大規(guī)模推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，利用環(huán)媒恒溫基因擴增(LAMP)法檢測黃曲霉毒素真菌，可應(yīng)用于飼料、食品等的樣品檢測。環(huán)媒恒溫基因擴增(Loop-mediatedisothermal amplification,簡稱LAMP)是日本學者Notomi等于2000年發(fā)明的一種新的高效的恒溫基因擴增技術(shù)。該方法在恒溫條件 (60 V 65 °C)通過4條引物B3、F3、BIP和FIP識別目的基因的6個特異性區(qū)域，在Bst DNA聚合酶的催化作用下擴增目的基因片段，反應(yīng)包括鏈置換反應(yīng)和環(huán)介導(dǎo)循環(huán)擴增兩個密切相關(guān)的環(huán)節(jié)。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)
一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，基于Ver-I基因建立LAMP法快速檢測黃曲霉素真菌，并應(yīng)用于飼料、食品的檢測；應(yīng)用ELISA法檢測樣品中AFBl毒素含量，并比較分析ELISA和LAMP檢測結(jié)果，其具體包括以下制備步驟
1.制備PDA培養(yǎng)基稱取去皮洗凈的馬鈴薯100g，放入500 mL蒸餾水中，將水煮沸至100 °C并保持30分鐘，過濾，加入10 g瓊脂粉，補足水至1000 mL,調(diào)pH值至7. O,分裝后高壓滅菌，4 °C保溫貯存?zhèn)溆茫?br> 2.培養(yǎng)菌種將黃曲霉接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)上，28°C培養(yǎng)；
3.設(shè)置環(huán)媒恒溫基因擴增(LAMP)引物；
4.提取真菌DNA模板；
5.將模板、引物、dNTP和緩沖液等反應(yīng)試劑按比例配制加入PCR管，將反應(yīng)體系至于 63 °C的溫度條件下保溫60 min，其后在80 °C下熱浴3分鐘滅活BstDNA聚合酶，反應(yīng)終止， 產(chǎn)物于2. 0%瓊脂糖凝膠中電泳；
6.參考株DNA提取液作模板，采用25μL反應(yīng)體系。分別改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、Mg2+的濃度、dNTP的濃度、Betaine的濃度，分別進行LAMP反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳判斷LAMP結(jié)果，以選擇最好的擴增條件；
7.用LAMP檢測法擴增黃曲霉，凝膠電泳成像檢查擴增產(chǎn)物，判斷該試驗的特異性；
8.以上制備的模板作IOn倍比稀釋。分別取各稀釋度Iμ L進行LAMP擴增。結(jié)合飼料中霉菌總數(shù)的測定方法(GB\T13092-2006)，以MPN法測定所挑取的菌液濃度；
9.按照上述方法建立黃曲霉素真菌檢測試劑盒；
在本發(fā)明中，凝膠用溴化乙錠染色，用以方便紫外線透射觀察。在本發(fā)明中，所述黃曲霉素真菌檢測試劑盒可用SYBR Green I判斷法和凝膠電泳成像法判斷樣品檢測結(jié)果。有益效果本發(fā)明比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更快、更準確。同時，LAMP法采用4條引物識別6個特異位點，保證了該方法高度特異性，同時，本發(fā)明還具備以下優(yōu)點
1.本發(fā)明在檢測結(jié)果的方法上，充分利用LAMP的特殊優(yōu)勢，運用了傳統(tǒng)的凝膠成像檢測的同時，還利用SYBR Green I實施可視化檢測。SYBR Green I實施可視化檢測避免了實際操作中EB帶來的污染，而且檢測的速度節(jié)約了 40分鐘以上；
2.本發(fā)明檢測飼料中毒素真菌穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好。用該方法檢測了180飼料樣品， 陽性率與ELISA方法吻合度高；
3.本發(fā)明中LAMP法檢測飼料中黃曲霉毒素真菌檢測成本不高，每個樣品只需要約3.O 元。LAMP法所用到的Bst酶價格比傳統(tǒng)的Taq酶要貴，但本實驗中對該酶5倍稀釋后，一方面試驗結(jié)果穩(wěn)定，另一方面成本明顯降低，平均每個樣品的Bst酶只需要O. 30元；
4.本發(fā)明所需要儀器比較簡單，主要儀器只要普通水浴鍋，不需要PCR儀，適用基層推
5.本發(fā)明檢測樣品速度非?？?，擴增時間只要60分鐘，檢測結(jié)果判斷只需要幾分鐘。


圖I :LAMP所用的引物及用于外部引物(FIP和BIP)與內(nèi)部引物(F3和B3)設(shè)計的部分 Aspergillus flavus ver_l 基因序列。圖2 :三種不同裂菌方法的LAMP反應(yīng)結(jié)果。圖3 :不同裂菌時間的LAMP反應(yīng)結(jié)果。圖4 :不同dNTPs濃度對LAMP反應(yīng)的影響。圖5 =AMP法檢測飼料產(chǎn)黃曲霉毒素真菌操作步驟。圖6 SYBR Green I判斷法檢測結(jié)果。圖7 :凝膠電泳成像法判斷樣品檢測結(jié)果。
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。實施例I :
基于Aspergillus flavus ver-1 gene基因序列作擴增模板,利用軟件和目測在序列 25bp 221bp處設(shè)計一套特異性引物F3、B3、FIP和BIP。各引物序列。具體結(jié)果見圖1，在圖I中，F(xiàn)3和B3為外引物，也稱短引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物，也稱長引物。其中BIP由 B2和BIC連接而成，而FIP由F2和FIC連接而成。四條引物識別目的基因6個位點。實施例2:
采用液氮提取法、微波熱振法及簡易提取法三種不同的裂菌方法都可以成功裂解細胞，相比而言簡易提取法簡單易行，并且效果穩(wěn)定，為本試驗采用三種方法破裂細胞制作模板LAMP擴增電泳結(jié)果如圖2，在圖2中，I表示液氮提取法的裂菌方法的LAMP反應(yīng)結(jié)果，2 表示微波熱振法裂菌方法的LAMP反應(yīng)結(jié)果，3表示傳統(tǒng)的反應(yīng)法的LAMP反應(yīng)結(jié)果，4表示無模板對照。實施例3:
真菌于溶菌液中 100°C分別水浴 I min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min 及 7 min, 10000 r/min離心I min后，取上清液，作為LAMP檢測的模板。重復(fù)試驗表明，5分鐘裂菌效果穩(wěn)定。具體結(jié)果見圖3，在圖中，f 7分別表示I分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6 分鐘、7分鐘時的反應(yīng)顯示，8表示無模板對照。實施例4:
以 O. 2 mmol / L, O. 4 mmol / L, O. 6 mmol / L, O. 8 mmol / L, I mmol / L, I. 2 mmol / L，1.4 mmol / L等幾個不同的dNTPs濃度進行LAMP擴增。用以檢測不同dNTPs 濃度對LAMP反應(yīng)的影響，結(jié)果表明當反應(yīng)體系中含dNTPs濃度小于6 mM時無特異性條帶， 6 mM時出現(xiàn)較暗條帶，當濃度在10 mM以上時條帶非常明顯。具體結(jié)果見圖4，其中廣7依次分另 1J表不 0. 2 mmol / L, 0. 4 mmol / L, 0. 6 mmol / L, 0. 8 mmol / L, I mmol / L, 1.2 mmol / L，1.4 mmol / L的dNTPs濃度對LAMP的影響，其中，8表示無模板對照組。實施例5
通過反復(fù)試驗，LAMP檢測飼料、食品中產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的操作方法最終得以確定，并且嘗試應(yīng)用于實際。該方法總共包括三大步驟1.樣品處理；2. LAMP擴增；3.檢測結(jié)果判斷。具體見圖5。實施例6:
SYBR Green I判斷法向LAMP產(chǎn)物中加入SYBR Green I，在肉眼下觀察結(jié)果，陽性樣品擴增產(chǎn)物為綠色，明亮，而陰性樣品無擴增產(chǎn)物，顏色為橘黃色，暗淡。具體結(jié)果見圖6，其中左邊為陰性，右邊為陽性。實施例7
凝膠電泳成像法判斷樣品檢測結(jié)果用2%的瓊脂糖凝膠，EB 2%,80 V電壓下電泳45 分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)成像后觀察，結(jié)果中有特異性條帶的為陽性，反之為陰性。具體結(jié)果見圖7。從湖南隨機取樣共180份飼料樣品，其中飼料廠90份，養(yǎng)殖場90份，另外有從湖南各市場采集的食品樣品200個。分別對這些進行ELISA檢測AFBl和LAMP法檢測其黃曲霉毒素真菌，并對結(jié)果進行比較分析。綜合LAMP法和ELISA法檢測結(jié)果，180個樣品中兩種檢測結(jié)果均為陽性的有29份，兩種檢測結(jié)果均為陰性的有136，即共有165個樣品兩種檢測檢測結(jié)果吻合，吻合率為91. 67%。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
1.一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，其特征在于，具體包括以下制備步驟1)制備PDA培養(yǎng)基稱取去皮洗凈的馬鈴薯100g，放入500 mL蒸餾水中，將水煮沸至 100 °C并保持30分鐘，過濾，加入10 g瓊脂粉，補足水至1000 mL,調(diào)pH值至7. 0，分裝后高壓滅菌，4 °C保溫貯存?zhèn)溆茫?)培養(yǎng)菌種將黃曲霉接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)上，28°C培養(yǎng)；3)設(shè)置環(huán)媒恒溫基因擴增(LAMP)引物；4)提取真菌DNA模板；5)將模板、引物、dNTP和緩沖液等反應(yīng)試劑按比例配制加入PCR管，將反應(yīng)體系至于63 °C的溫度條件下保溫60 min，其后在80 °C下熱浴3分鐘滅活BstDNA聚合酶，反應(yīng)終止，產(chǎn)物于2. 0%瓊脂糖凝膠中電泳；6)參考株DNA提取液作模板，采用25ii L反應(yīng)體系，分別改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、Mg2+ 的濃度、dNTP的濃度、Betaine的濃度，分別進行LAMP反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳判斷LAMP結(jié)果，以選擇最好的擴增條件；7)用LAMP檢測法擴增黃曲霉，凝膠電泳成像檢查擴增產(chǎn)物，判斷該試驗的特異性；8)以上制備的模板作IOn倍比稀釋，分別取各稀釋度IU L進行LAMP擴增，結(jié)合飼料中霉菌總數(shù)的測定方法(GB\T13092-2006)，以MPN法測定所挑取的菌液濃度；9)按照上述方法建立黃曲霉素真菌檢測試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，其特征在于，所述凝膠用溴化乙錠染色，用以方便紫外線透射觀察。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，其特征在于，所述黃曲霉素真菌檢測試劑盒可用SYBR Green I判斷法和凝膠電泳成像法判斷樣品檢測結(jié)果。
全文摘要
一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，基于環(huán)媒恒溫基因擴增(LAMP)基本原理，具體步驟包括制備PDA培養(yǎng)基；培養(yǎng)菌種；設(shè)計環(huán)媒恒溫基因擴增(LAMP)引物；提取真菌DNA模板；按比例配制加入PCR管，水浴保溫反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳等。并結(jié)合飼料中霉菌總數(shù)的測定方法(GB\T13092-2006)，以MPN法測定所挑取的菌液濃度；按照上述方法建立黃曲霉素真菌檢測試劑盒。該試劑盒檢測飼料、食品中黃曲霉毒素真菌特異性強、敏感性高，檢測快速，成本低，而且可以同時檢測多個樣品，適合基層飼料衛(wèi)生檢測，值得廣泛推廣。
文檔編號C12Q1/04GK102586455SQ20121006635
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者萬俊松 申請人:萬俊松