專利名稱：大菱鲆c135t單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳標(biāo)記研究技術(shù)，具體涉及一種檢測大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide polymorphism, SNP)的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記是基因組中最豐富的突變類型，因它數(shù)量多，覆蓋密度大，位點(diǎn)豐富，幾乎分布于整個(gè)基因組，具有片段短易于擴(kuò)增、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)； 易于高通量、自動(dòng)化分析，易于遺傳機(jī)制的研究等優(yōu)勢，所以它是遺傳育種研究中的熱門領(lǐng)域。有關(guān)大菱鲆SNP標(biāo)記開發(fā)的研究，在本發(fā)明做出之前，國內(nèi)外有部分相關(guān)的報(bào)道，國內(nèi)湖北省林業(yè)科學(xué)研究院張新葉等(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2009)發(fā)表的基于EST序列的楊樹候選SNPs標(biāo)記分析，曾報(bào)道了利用生物信息學(xué)方法對(duì)來自2個(gè)不同cDNA文庫的2萬余條楊樹EST序列進(jìn)行了候選SNPs標(biāo)記篩選的方法，但是研究對(duì)象并非大菱鲆，而且后期的驗(yàn)證方法為重新測序法，該方法需要的成本高，而且重新測序的樣品數(shù)量少，隨機(jī)誤差較大。 豐貴鵬等(生命的化學(xué)2010)發(fā)表的高分辨率熔解曲線法的非標(biāo)記探針基因分型技術(shù)，曾報(bào)道了高分辨率熔解曲線技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，但只是綜述，對(duì)發(fā)明探索有一定幫助，沒有具體的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)路線參考。殷豪等(園藝學(xué)報(bào)2011)發(fā)表的利用高分辨率熔解曲線(HRM)分析梨微衛(wèi)星標(biāo)記，曾報(bào)道了利用高分辨率熔解曲線(HRM)分析微衛(wèi)星(即SSRs)序列多態(tài)性的方法，它是對(duì)已知位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測，對(duì)實(shí)驗(yàn)的精密度要求相對(duì)較低，而本發(fā)明不需要有已知突變位點(diǎn)這個(gè)前提，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)的精密度要求較高； 西班牙 Manuel Vera 等(Aquaculture2011)發(fā)表的 Validation of single nucleotide polymorphism(SNP)markers from an immune Expressed Sequence Tag(EST)turbot, Scophthalmus maximus, database,曾報(bào)道基于EST序列開發(fā)大菱鲆SNP標(biāo)記的方法，他運(yùn)用基于四種可能核苷酸兩步反應(yīng)法對(duì)候選SNP熒光檢測進(jìn)行基因分型驗(yàn)證，共篩選出77個(gè)大菱鲆SNP標(biāo)記。但是他們分析EST序列時(shí)，應(yīng)用的軟件是CAP3和QualitySNP，該軟件的運(yùn)行需要Iinux操作系統(tǒng)，操作相對(duì)繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法，該方法費(fèi)用低、特異性準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡便，可快速高通量地檢測大菱鲆 Ci;35TSNP 標(biāo)記。本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法，包括1)、基因組DNA提??； 2)、候選SNP篩選；3)、引物、探針設(shè)計(jì)；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；5)、探針雜交；6)、數(shù)據(jù)采集； 7)、基因分型，具體步驟如下1)、基因組DNA提取提取大菱鲆基因組DNA，將其稀釋為20ng/ul ；2)、候選 SNP 篩選采用 Vector NTI Advancell 綜合軟件包中的 Contig Express模塊對(duì)大菱鲆EST序列進(jìn)行聚類、拼接，再利用拼接后的EST重疊群通過人工判讀的方式篩查出候選C135TSNP位點(diǎn)，候選C135TSNP位點(diǎn)所在的基因序列為ACAAGCCTGGGGTCTACACTCGGGTCACTCACTTCCTGGACTGGATCAAATCAAAGACTCAAGCAACAT
ttccatcagcaacatgccatggttaataagggagcttttgaattttgtgcagataaaactgctatC_ctgctttca
AGGCTATTTGATACTTACAAAAATGTAGTCATTGACTAAGCATTGTCACTTCAGTTTAACTGGATAAAGCATCACTG TCTGTGAACATTAAATAGCTCTCTGTTCTCCCAGTTATCTTTTTGTGTTAACACAGTTGCAAGCAATGATTGTTTGA TGGATTCAAGTGCAAATGGGGAATAAAGGCGAAAACTTTGCTCACAT，其中加粗、加下劃線的堿基即為候選C135TSNP位點(diǎn)；3)、引物、探針設(shè)計(jì)在候選C135TSNP位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)特異性引物，目的片段長度小于350bp，引物設(shè)計(jì)用ft~imer5.0，參數(shù)分析用01igo7. 0 ；根據(jù)候選C135TSNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’端封閉非標(biāo)記探針，探針的退火溫度范圍為60°C -80°C，探針3’端采用2 堿基錯(cuò)配封閉，探針序列為5 ’ -TTGAAAGCAGGATAGCAGTTTAG-3 ’；特異性引物正鏈為 5，-ACAAGCCTGGGGTCTACACTC-3，，負(fù)鏈為5，-ATGTGAGCAAAGTTTTCGCCTT-3，，引物退火溫度 56 0C ；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增使用候選C135TSNP對(duì)應(yīng)引物對(duì)步驟1所提取的大菱鲆基因組DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系為15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因組 DNAlul，10XPCR bufferl. 5ul，2. 5mMdNTPs 各 1. 2ul，25mMMgCl2l. 2ul，5U/ul Taq DNApolymeraseO. 075ul,IXLC Green Plusl. 5ul，10 μ M 正鏈引物 1. 2ul，2 μ M 負(fù)鏈引物 1.2ul，加 ddH20 至 15ul ；設(shè)置 PCR 儀的程序?yàn)?95 °C 變性 5min ；94 °C 30sec，56°C 30sec, 72°C 30sec,60 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min，4°C保存；5)、探針雜交將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與3’端封閉的非標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交體系為每個(gè)不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系中加入10 μ M對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的3’端封閉的非標(biāo)記探針1. 5ul，設(shè)置PCR儀的雜交程序變性溫度95°C lOmin，之后自然降至室溫降至室溫，置4°C保存；6)、數(shù)據(jù)采集將雜交產(chǎn)物置于Light Scanner分析儀上進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集，采集曲線的溫度范圍為45°C至97°C，每攝氏度獲得10個(gè)點(diǎn)，升溫速度為0. I0C /s ；7)、基因分型數(shù)據(jù)的檢索和分析運(yùn)用Light Scanner分析軟件，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果；本發(fā)明不需要有已知突變位點(diǎn)，通過Vector NTI Advancell綜合軟件包中的 ContigExpress軟件對(duì)大菱鲆EST序列進(jìn)行聚類、拼接，從重疊群中篩選出候選SNP，在其兩端設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，經(jīng)過條件優(yōu)化之后，該引物能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出 C135TSNP標(biāo)記，在其位點(diǎn)前后(包含該位點(diǎn))設(shè)計(jì)3’端封閉的非標(biāo)記探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，該探針能夠較好地與SNP標(biāo)記基因座雜交，雜交產(chǎn)物在大菱鲆群體檢測中呈現(xiàn)較好多態(tài)性；本發(fā)明應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析快速檢測大菱鲆每個(gè)個(gè)體在SNP位點(diǎn)的遺傳變異情況，可快捷獲得該引物對(duì)大菱鲆多態(tài)性圖譜，所得結(jié)果可直觀地檢測出大菱鲆每個(gè)個(gè)體的基因型，以期找到與該SNP位點(diǎn)連鎖的性狀，為以后與傳統(tǒng)方法結(jié)合進(jìn)行育種工作
奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明運(yùn)用的是Vector NTI Advance 11綜合軟件包中的ContigExpressProject軟件，操作相對(duì)簡便，而且運(yùn)用高分辨率熔解曲線進(jìn)行SNP基因分型實(shí)現(xiàn)了低成本、高精度、高通量的閉管操作，大大降低了實(shí)驗(yàn)過程中可能的污染造成的誤差。


下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明基于表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的檢測大菱鲆C135TSNP遺傳標(biāo)記的方法。圖1 :C135TSNP引物對(duì)大菱鲆42個(gè)個(gè)體高分辨率熔解曲線圖譜A :C135TSNP引物對(duì)大菱鲆42個(gè)個(gè)體標(biāo)準(zhǔn)化的熔解曲線圖；B :C135TSNP引物對(duì)大菱鲆42個(gè)個(gè)體衍生的基因分型峰圖；C:大菱鲆42個(gè)個(gè)體對(duì)應(yīng)樣品的位置圖。編號(hào)A01-D06代表大菱鲆的42個(gè)個(gè)體，其中淺灰色樣品(a)代表野生純合基因型，深灰色樣品(b)代表突變雜合基因型。
具體實(shí)施例方式一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法，包括1)、基因組DNA提??； 2)、候選SNP篩選；3)、引物、探針設(shè)計(jì)；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；5)、探針雜交；6)、數(shù)據(jù)采集； 7)、基因分型，具體步驟如下1.基因組DNA提取本實(shí)驗(yàn)樣品來源于煙臺(tái)天源水產(chǎn)有限公司8個(gè)家系10個(gè)不同性狀群體的42個(gè)個(gè)體，運(yùn)用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，TIANGEN)法提取DNA。a、取新鮮樣品的肌肉組織20mg，放入裝有200 μ LGA緩沖液的離心管中，渦旋振蕩15s。b、加入20μ L 蛋白酶K(20mg/ml)溶液，渦旋混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。在56°C放置，直至組織完全溶解，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。c、加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻， 70°C放置lOmin，溶液變得清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。d、加入200 μ L無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。e、將所得溶液和絮狀沉淀均加入吸附柱CB3中，(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。f、向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。g、向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液PW， 12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。h、向吸附柱CB3中加入500ul 漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液。i、將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心 2min，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。j、 將吸附柱CB3軟入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加60 μ L洗脫緩沖液 ΤΕ，室溫放置％iin，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，將其定量稀釋成20ng/ul 備用。2、候選SNP篩選采用Vector NTI Advancell綜合軟件包中的ContigExpress模塊對(duì)大菱鲆EST序列進(jìn)行聚類、拼接，再利用拼接后的EST重疊群通過人工判讀的方式篩查出候選C135TSNP 位點(diǎn)，候選C135TSNP位點(diǎn)所在的基因序列為ACAAGCCTGGGGTCTACACTCGGGTCACTCACTTCCTGGACTGGATCAAATCAAAGACTCAAGCAACATttccatcagcaacatgccatggttaataagggagcttttgaattttgtgcagataaaactgctatCctgctttcaag
GCTATTTGATACTTACAAAAATGTAGTCATTGACTAAGCATTGTCACTTCAGTTTAACTGGATAAAGCATCACTGTC TGTGAACATTAAATAGCTCTCTGTTCTCCCAGTTATCTTTTTGTGTTAACACAGTTGCAAGCAATGATTGTTTGATG GATTCAAGTGCAAATGGGGAATAAAGGCGAAAACTTTGCTCACAT，其中加粗、加下劃線的堿基即為候選 C135TSNP 位點(diǎn)；3.引物、探針設(shè)計(jì)在候選C135TSNP位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)特異性引物，目的片段長度小于350bp，引物設(shè)計(jì)用I^rimerS. 0，參數(shù)分析用01 igo7. 0 ；根據(jù)候選C135TSNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)3，端封閉非標(biāo)記探針，要求探針的退火溫度范圍為60°C -80°C，探針3’端采用2堿基錯(cuò)配封閉， 探針序列為5’ -TTGAAAGCAGGATAGCAGTTTAG-3’ ；由于SNP突變率相對(duì)較高，在雜交的過程中造成單堿基錯(cuò)配的變化，這是檢測單核苷酸多態(tài)性的根源；特異性引物正鏈為 5，-ACAAGCCTGGGGTCTACACTC-3，，負(fù)鏈為 5，-ATGTGAGCAAAGTTTTCGCCTT-3，，引物退火溫度 56 0C ；4.不對(duì)稱PCR擴(kuò)增使用候選C135TSNP對(duì)應(yīng)引物對(duì)步驟1所提取的大菱鲆基因組DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系為15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因組DNAlul， 10XPCR bufferl. 5ul，2. 5mMdNTPs 各 1. 2ul, 25mMMgCl2l. 2ul,5U/ul Taq DNA polymerase (Takara) 0. 075ul,IXLC Green Plusl. 5ul，10 μ M正鏈引物 1. 2ul，2 μ M負(fù)鏈弓| 物 1. 2ul，加(MH2O 至 15ul ；設(shè)置 PCR 儀的程序?yàn)?95°C變性 5min ；94°C 30sec，56°C 30sec, 72°C 30sec,60 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min，4°C保存；5.探針雜交將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與3’端封閉的非標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交體系為每個(gè)不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系中加入10 μ M對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的探針1. 5ul，設(shè)置PCR儀的雜交程序變性溫度 950C lOmin，之后自然降至室溫，置4°C保存；6.數(shù)據(jù)采集將雜交產(chǎn)物置于Light Manner分析儀(Idaho，LightScanner96)上進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集，采集曲線的溫度范圍為45°C至97°C，每攝氏度獲得10個(gè)點(diǎn)，升溫速度為 0. rc /s ；7.基因分型數(shù)據(jù)的檢索和分析運(yùn)用Light farmer分析軟件，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態(tài)性圖譜(如圖1中的A、B、C所示)。
權(quán)利要求
1. 一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法，其特征在于它的方法包括1)、 基因組DNA提??；2)、候選SNP篩選；3)、引物、探針設(shè)計(jì)；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；5)、探針雜交；6)、數(shù)據(jù)采集；7)、基因分型，具體步驟如下1)、基因組DNA提取提取大菱鲆基因組DNA，將其稀釋為20ng/ul；2)、候選SNP篩選采用VectorNTI Advancell綜合軟件包中的Contig Express模塊對(duì)大菱鲆EST序列進(jìn)行聚類、拼接，再利用拼接后的EST重疊群通過人工判讀的方式篩查出候選C135TSNP位點(diǎn)，候選C135TSNP位點(diǎn)所在的基因序列為ACAAGCCTGGGGTCTACACTCGGGTCACTCACTTCCTGGACTGGATCAAATCAAAGACTCAAGCAA CATTTCcatcagcaacatgccatggttaatmgggagcttttgaattttgtgcagataamctgctatCctgctttcaaggctATTTGATACTTACAAAAATGTAGTCATTGACTAAGCATTGTCACTTCAGTTTA ACTGGATAAAGCATCACTGTCTG TGAACATTAAATAGCTCTCTGTTCTCCCAGTTATCTTTTTGTGTT AACACAGTTGCAAGCAATGATTGTTTGATGG ATTCAAGTGCAAATGGGGAATAAAGGCGAAAACTTTG CTCACAT,其中加粗、加下劃線的堿基即為候選 C135TSNP 位點(diǎn)；3)、引物、探針設(shè)計(jì)在候選C135TSNP位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)特異性引物，目的片段長度小于350bp，引物設(shè)計(jì)用Primer5. O,參數(shù)分析用01igo7. O ；根據(jù)候選C135TSNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’端封閉非標(biāo)記探針，探針的退火溫度范圍為60°C -80°C，探針3’端采用2堿基錯(cuò)配封閉，探針序列為5’ -TTGAAAGCAGGATAGCAGTTTAG-3，；特異性引物正鏈為 5，-ACAAGCCTGGGGTCTACACTC-3，，負(fù)鏈為5，-ATGTGAGCAAAGTTTTCGCCTT-3，，引物退火溫度 56 0C ；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增使用候選C135TSNP對(duì)應(yīng)引物對(duì)步驟1所提取的大菱鲆基因組DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系為15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因組 DNAlul，IOXPCR buffer 1. 5ul，2. 5mMdNTPs 各 1. 2ul，25mMMgCl2l. 2ul，5U/ul Taq DNApolymeraseO. 075ul，IXLC Green Plusl. 5ul, 10 μ M 正鏈引物 1. 2ul，2yM 負(fù)鏈引物 1.2ul，加 ddH20 至 15ul ；設(shè)置 PCR 儀的程序?yàn)?95 °C 變性 5min ；94 °C 30sec，56°C 30sec, 72°C 30sec,60 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min，4°C保存；5)、探針雜交將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與3’端封閉的非標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交體系為每個(gè)不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系中加入10 μ M對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的3’端封閉的非標(biāo)記探針1. 5ul ；設(shè)置 PCR儀的雜交程序變性溫度95°C lOmin，之后自然降至室溫，置4°C保存；6)、數(shù)據(jù)采集將雜交產(chǎn)物置于LightScanner分析儀上進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集， 采集曲線的溫度范圍為45°C至97°C，每攝氏度獲得10個(gè)點(diǎn)，升溫速度為0. I0C /s ；7)、基因分型數(shù)據(jù)的檢索和分析運(yùn)用LightScanner分析軟件，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態(tài)性圖譜。
全文摘要
一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法，首先提取大菱鲆基因組DNA并稀釋備用；再分析EST的序列篩選包含候選SNP位點(diǎn)的序列，在其兩端設(shè)計(jì)特異性引物，在其位點(diǎn)前后(包含該位點(diǎn))設(shè)計(jì)3’端封閉的非標(biāo)記探針；然后使用該引物對(duì)大菱鲆群體基因組DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物與3’端封閉的非標(biāo)記探針雜交；將雜交產(chǎn)物置于LightScanner上檢測熔解曲線并分析，獲得大菱鲆的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明適用于大菱鲆群體遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等檢測技術(shù)；本發(fā)明可快捷的獲得大菱鲆的C135TSNP標(biāo)記的遺傳變異圖譜，方便、快捷、準(zhǔn)確，可直觀地檢測出大菱鲆每個(gè)個(gè)體的基因型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534043SQ20121006684
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者劉慶明, 商曉梅, 曲江波, 楊志, 王新安, 馬愛軍, 黃智慧 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所