專利名稱：表達hsa-miR-21^＊的重組腺相關病毒的制備方法及其在高血壓病治療中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能調(diào)控人類miRNA-21 *的重組腺相關病毒重組體(rAAV-miRNA_21 */ rAAV-anti-mi RNA-21 * )的構(gòu)建和制備方法,更具體地說涉及hsa-miR-21 *及反義序列hsa-anti-miR-21 *的克隆及分別包含hsa-miR-21 *和hsa-anti-miR-21 *的重組腺相關病毒重組體的包裝制備方法，和所述的重組腺相關病毒重組體的藥學用途。
背景技術：
microRNA(miRNA, miR)是一類新近發(fā)現(xiàn)的來源于內(nèi)源 性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本的長度大約為22個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3，untranslated region, 3’ UTR)特異性結(jié)合,促進革E mRNA降解,或者抑制革E mRNA翻譯，降低編碼蛋白質(zhì)水平，從而實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控。miCToRNA與機體的多種疾病聯(lián)系緊密，包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腎病以及腫瘤等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在心臟的生成、發(fā)育和功能方面均有著重要作用。高血壓是我國最常見的心血管疾病，可導致多種嚴重并發(fā)癥，如慢性心力衰竭、慢性腎功能衰竭、腦中風等，導致社會經(jīng)濟負擔加重。關于高血壓的預防、診斷和治療工作，目前仍存在巨大的不足，治療率、控制達標率低，而致心腦血管疾病預防效果欠佳。高血壓病因和發(fā)病機制復雜，涉及多種效應器官和靶器官。目前世界衛(wèi)生組織推薦的抗高血壓藥物有六大類利尿劑、鈣拮抗劑(CCB)、β受體阻滯劑、α I受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素II受體拮抗劑(ARB)，但尚不能達到讓人滿意的效果。miRNA參與許多重要病理生理過程，由于單一 miRNA可調(diào)控多個靶基因的表達，因此針對疾病關鍵miRNA靶點的藥物可參與多種信號通路調(diào)控，從而為高血壓的防治帶來新的希望。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-155對血管緊張素11_1型受體的調(diào)控作用可能是調(diào)控動脈血壓的重要機制之一。而L-精氨酸轉(zhuǎn)運子SLC7A1的3’ UTR的多態(tài)性位點ss52051869與miR-122之間的調(diào)控關系與高血壓之間的關系，并已在幾個遺傳性高血壓家系中得到證實。但是目前為止尚未見關于miR-21*在高血壓中的作用及相關的治療藥物用途。目前多米用腺病毒和慢病毒作為miRNA的表達載體,但腺病毒載體表達時間短、對機體有免疫原性，慢病毒多由白血病病毒或HIV改造而來，生物安全性堪憂，均不適合將來的臨床應用。而重組腺相關病毒載體(rAAV)克服了其他基因表達載體所難以克服的缺點，它可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞(即具有廣泛的轉(zhuǎn)基因范圍)、無副作用(無免疫源性)、感染效率高、能驅(qū)動目的基因在體內(nèi)長期表達，而且成功地解決了無腺病毒污染的體外大量復制問題，從而成為基因治療最有前途的載體。為了真正實現(xiàn)高血壓的基因治療，我們將hsa-miR-21 *與重組腺相關病毒載體重組構(gòu)建，并經(jīng)檢測獲得滿足治療要求的高滴度，在動物實驗中證實了其可以有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓水平，同時改善了心臟功能。因此，有希望成為用于臨床高血壓治療的藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人根據(jù)hsa-miR-21 *堿基序列，分別設計并合成了表達hsa-miR-21 *和反義互補anti-hsa-miR-21 *的序列，并成功分別插入真核表達載體pAAV_D(+)中構(gòu)成重組質(zhì)粒 pAAV-D (+) -miR-21 * 和 pAAV-D (+) -anti-miR-21 *。之后，將 pXX9、phelper>pAAV-D (+) -miR-21 *和pAAV_D (+) -anti-miR-21 *用鈣磷共轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)入293細胞包裝制備能分別表達hsa-miR-21 *和反義互補anti-hsa-miR-21 *的重組腺相關病毒,經(jīng)純化后，real-time PCR法測定滴度。下一步將包裝制備的兩種重組腺相關病毒(rAAV-miRNA_21 *和rAAV-anti-miRNA-21*)分別經(jīng)尾靜脈注射至自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，發(fā)現(xiàn)大鼠主動脈中hsa-miR-21 *的長期表達發(fā)生明顯變化，說明重組腺相關病毒能介導hsa-miR-21 */anti-hsa-miR-21 *的長期有效表達,從而促進/抑制血管hsa-miR-21 *的表達。并且發(fā)現(xiàn) SHR大鼠的血壓受到明顯調(diào)控，重組腺相關病毒能介導的hsa-miR-21 *表達明顯減低大鼠的血壓水平,并且改善心臟功能。而anti-hsa-miR-21 *則明顯升高動物血壓水平,進一步支持hsa-miR-21 *的降血壓作用。所以，本發(fā)明的第一個目的是提供分別含有hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21*的
重組腺相關病毒。本發(fā)明的第二個目的是提供分別含有hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的重組腺相關病毒的包裝和制備過程。本發(fā)明的第三個目的是提供利用分別含有hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的重組腺相關病毒治療和處理高血壓的動物實驗方法和主要結(jié)果。
四

摘要

不同MicroRNA治療對SHR大鼠尾動脈血壓的影響(*表示與相同時間點control組相比，ρ < O. 05)。說明書

從下面給出的說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上面和其他目的和特征將變得明了。其中圖IA顯示了自發(fā)性高血壓大鼠血壓水平尾動脈監(jiān)測Wistar大鼠和SHR大鼠血壓O表示與相同時間點Wistar大鼠相比，P < O. 05)；圖IB自發(fā)性高血壓大鼠主動脈中hsa-miR-21 *的表達情況實驗終點時，不同組別大鼠主動脈中hsa-miR-21 *的表達情況(*表示與Wistar大鼠相比，ρ < O. 05)。圖2 顯不了 hsa-miR-21 *的序列(取自 miRBase)。圖3 是顯不 ρAAV-D (+)—miR-21 *和 pAAV_D (+) _anti_miR_21 *的質(zhì)粒構(gòu)成。圖4是純化后的病毒轉(zhuǎn)染細胞后熒光顯微鏡觀察GFP(綠色顯示的是轉(zhuǎn)染成功的細胞)，其轉(zhuǎn)染效率可達90%以上。圖5是real-time PCR檢測不同處理的SHR大鼠主動脈中hsaniR-21 *的表達情況(* 表不與 control 組相比，ρ < O. 05)。結(jié)果顯不 rAAV-miR-21 * 和 rAAV-anti-miR-21 *可明顯調(diào)控SHR大鼠主動脈hsa-miR-21 *表達(前者升高hsa-miR-21 *表達水平，后者降低 hsa-miR-21*水平)。圖6A是SHR大鼠尾動脈血壓情況尾動脈血壓監(jiān)測明確不同MicroRNA治療對SHR大鼠尾動脈血壓的影響(*表示與相同時間點control組相比，p < O. 05),結(jié)果顯示rAAV-miR-21 *可明顯降低SHR大鼠尾動脈血壓，而rAAV-anti_miR-21 *則明顯升高動物血壓。圖6B是SHR大鼠尾動脈心臟功能情況=Millar導管檢測不同處理的SHR大鼠心臟收縮能力(*表示與相同時間點control組相比，p < O. 05),結(jié)果顯示rAAV-miR-21 *可明顯改善SHR大鼠心臟功能。
本發(fā)明中的重組腺相關病毒rAAV-miR-21*于2011年7月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國，武漢，武漢大學；保藏編號為CCTCC No :V201123。 五具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例I自發(fā)性高血壓大鼠主動脈miRNA表達的篩查I.本實驗采用4周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)及對照大鼠(Wistar)，飼養(yǎng)8周，監(jiān)測大鼠尾動脈血壓。結(jié)果顯示SHR的基礎血壓明顯高于正常對照大鼠，并且隨著周齡增力口，SHR大鼠的血壓水平不斷上升(圖1A)。2.實驗終點時(周)，常規(guī)提取大鼠主動脈RNA 每IOOmg組織中加入Iml TRIZOL試劑，電動勻漿器勻漿。室溫下放置5min后，力口入O. 2ml氯仿,混勻后室溫下放置5min, 4°C 12, OOOg離心15min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新Ep管中，加入O. 5ml異丙醇,混勻后室溫下放置IOmin, 4°C 12, OOOg離心lOmin。棄上清,加入Iml 75%乙醇，混勻后4°C 7，500g離心5min。棄上清，空氣干燥沉淀5min，加入20 μ IDEPC處理水，55-60°C水浴IOmin溶解RNA。獲得的RNA溶液保存于_80°C。3.紫外吸收法測定RNA濃度及純度按照BioPhotometer plus (Eppendorf)儀器使用說明進行操作,測量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。根據(jù)260nm處讀值獲得RNA濃度，以A260/A280的比值判定RNA純度。4.變性瓊脂糖凝膠電泳Ig瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C，加入IOml的10XMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12. 3M)。取3yg RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 μ g/mL·加熱至70°C孵育5min使樣品變性。上樣于膠孔中，5_6V/cm電壓下電泳至溴酹蘭指示劑進膠至少2-3cm，紫外透射光下觀察并拍照。5.采用廣州銳博公司miRNA檢測試劑盒對hsa_miR-21 *的表達進行檢測miRNAs 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物(RT Primer Mix)配置miRNA-21* RT Primer I μ IU6RT Primer I μ I
RNase free H2O 78 μ I逆轉(zhuǎn)錄反應體系RNA template 2 μ gRT Primer Mix 4 μ IRNase free H2O up to 19 μ I以上體系混勻后，瞬時離心，70°C孵育IOmin后，冰育2min，再加入以下試劑2 X TS reaction buffer 25 μ ITS enzyme 2. 5 μ I·
RNase free H2O 3. 5 μ I逆轉(zhuǎn)錄反應程序420C 60min，70°C IOmin ;停止后 4°C備用，產(chǎn)物保存于-20°C。miRNAs real-time PCR 反應體系2XSYBRGreen Mix 9μ IRT product 2 μ ImiRNA Forward Primer 2 μ ImiRNA Reverse Primer 2 μ IRNase-free H2O 5 μ I反應程序95°C 30sec—(95°C IOsec—60°C 20sec—70°C lsec) X40cycles—Melting Curve結(jié)果顯示SHR大鼠主動脈中的miR-21*的含量為對照正常Wistar大鼠主動脈中的2. 84倍(圖1B) ο實施例2重組腺相關病毒的構(gòu)建1.插入片段合成依據(jù)hsa-miR-21 *的堿基序列(圖2)，分別設計并合成表達hsa_miR-21 *及反向互補hsa-anti-miR-21 *的兩條反向互補鏈，并用TE溶解。序列如下hsa-miR-21 * 上游引物5，GATCCacagcccatcgactggtgttgTTCAAGAGAcaacaccagtcgatgggctgtCCGC 3’下游引物3，GtgtcgggtagctgaccacaacAAGTTCTCTgttgtggtcagctacccgacaGGCGCCGG 5’hsa-anti-miR-21 * 上游引物5，GATCCcaacaccagtcgatgggctgtTTCAAGAGAacagcccatcgactggtgttgCCGC 3’下游引物3，GgttgtggtcagctacccgacaAAGTTCTCTtgtcgggtagctgaccacaacGGCGCCGG 5’2.按照說明書中體系及溫度進行反應Nuclease-Free Water 36 μ IAnnealing Buffer for DNA Oligos(5X) 10 μ IDNA oligo Α(50μΜ) 2μ I
DNA oligo B (50 μ Μ) 2μ I9(TC 3min，37°C lhr，4°C 保存。3.載體酶切采用BamH I和Not I對真核表達載體pAAV_D (+)在37°C下雙酶切2hr，體系如下IOXK Buffer I μ IBSA I μ IBamH I I μ I Not I I μ IρAAV-D (+) 2 μ IddH20 14 μ I4.瓊脂糖凝膠電泳膠回收用I %的瓊脂糖電泳凝膠電泳雙酶切產(chǎn)物，然后使用TaKaRa公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O回收雙酶切產(chǎn)物，具體操作步驟如下I.制作IXTAE緩沖液瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳；2.在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠；3.稱量膠塊重量，計算膠塊體積，切碎膠塊；4.向膠塊中加入3倍體積的膠塊融化液DR-I Buffer, 75°C加熱融化膠塊；5.向膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當分離小于400bp的DNA片段時，應在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇；6.將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上；7.將上述操作5的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12, OOOrpm離心Imin,棄濾液；8.將 500 μ I 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12, OOOrpm 離心 30sec，棄濾液；9.將 700μ1 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 離心 30sec,棄濾液;10.重復操作步驟9 ；11.將 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12，OOOrpm 離心 Imin ;12.將Spin Column安置于新的I. 5ml的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入25μ I的60°C預熱的Elution Buffer,室溫靜置Imin ；13. 12, OOOrpm 離心 Imin 洗脫 DNA。5.載體連接I.用T4連接酶連接回收的pAAV-D⑴載體和合成的DNA片段，按照下述反應體系16 °C孵育過夜10xT4DNA 連接酶2.5 μΙ
DNA 片段0.3 pmol
載體片段0.03 pmol
T4 DNA連接酶1 μΙ
ddhbOup to 25 μΙ2.全量(25 μ I)加入至100 μ I DH5 α感受態(tài)細胞中，冰中放置30min ；3. 42°C加熱45sec后，再在冰中放置Imin ；4.加入500 μ I無抗生素LB培養(yǎng)基，37°C IOOrpm振蕩培養(yǎng)60min ；5.在Amp+的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選白色單克隆菌落鑒定。6.質(zhì)粒小提挑取單克隆菌落，加入到3ml Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 280rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用北京全式金公司EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取質(zhì)粒,具體操作步驟如下I.取I. 5ml過夜培養(yǎng)的細菌10，OOOg離心lmin，盡量吸盡上清；2.加入250 μ I無色溶液RB (含RNase Α)，震蕩懸浮細菌沉淀；3.加入250 μ I藍色溶液LB，溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合4_6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液；4.加入350 μ I黃色溶液NB，輕輕混合5_6次，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2min ；5. 15, OOOg離心5min,小心吸取上清加入吸附柱中；6. 15, OOOg 離心 lmin,棄流出液；7.加入650 μ I溶液WB, 15，OOOg離心lmin,棄流出液；8. 15，OOOg離心2min，徹底去除殘留的WB ;9.將吸附柱置于新Ep管中，在柱中央加入20μ I 70°C預熱的ΕΒ，室溫靜置lmin ;10. 10，OOOg 離心 lmin，洗脫 DNA，洗脫出的 DNA 于-20°C保存。7.質(zhì)粒鑒定采用雙酶切和測序?qū)λ鶚?gòu)建的質(zhì)粒進行鑒定，得到真核表達質(zhì)粒pAAV-D (+)-miR-21 *和 pAAV-D(+)-anti_miR-21 *，其結(jié)構(gòu)如圖 3 所示。8.質(zhì)粒大提準備IL的無菌錐形瓶，加入300ml無菌LB培養(yǎng)基，加氨芐青霉素溶液至終濃度為100 μ g/ml。分別加入 50 μ I 所需質(zhì)粒(pXX9、pheIper、pAAV-D (+)、pAAV-D (+) -miR-21 *和pAAV-D (+) -anti-miR-21 *)，280rpm, 37°C過夜培養(yǎng)。按照 OMEGA 公司 E.Z.N.A Endo-FreePlasmid Maxi Kit說明書操作,提取質(zhì)粒,具體步驟如下I.室溫下5000g離心IOmin收集細菌；2.棄培養(yǎng)基，加入10ml Solution I/RNase A混合液，漩渦震蕩完全重懸；3.重懸混合液中加入10ml Solution II,輕輕顛倒混勻10-15次后，室溫放置2min ；4.加入5ml冰浴的Buffer N3,并溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；5.將HiBind柱套在收集管中，加入5ml Buffer GPS，室溫靜置3-lOmin，5，000g離心5min，棄濾液，將柱子重新放回收集管中；6.將細菌裂解液倒入針筒過濾器中，靜置2min，插入并推動活塞，收集過濾的裂解液；7.過濾裂解液中加入1/10體積的ETR，顛倒7_10次后，冰浴IOmin ；8. 42°C水浴5min后，室溫5，OOOg離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，加入O. 5倍體積無水乙醇，混勻后室溫靜置2min ；9.轉(zhuǎn)移混合液至已激活HiBind柱中，室溫5，OOOg離心5min,棄去濾液；10.將結(jié)合柱重新裝回收集管，加入IOml HB Buffer，室溫5，OOOg離心5min，棄去 濾液；11.將結(jié)合柱重新裝回收集管，加入15ml DNA Wash Buffer，室溫5，OOOg離心5min,棄去濾液；12.重復上一步驟；13.棄去濾液,結(jié)合柱重新裝回收集管,6，OOOg離心15min ;14.取出結(jié)合柱，65°C干燥IOmin ;15.結(jié)合柱裝入新離心管，加入7CTC預熱的l_3ml Endotoxin free ElutionBuffer,室溫靜置2min后，6，OOOg離心5min以洗脫DNA。9. rAAV介導的病毒包裝293T細胞生長至90%，鈣磷轉(zhuǎn)染前l(fā)_2hr，每個培養(yǎng)皿換新鮮培養(yǎng)基(含血清)12-15ml，在50ml離心管內(nèi)先加入氯化鈣(CaCl2)，再加入質(zhì)粒，形成Ca-DNA混合液，充分混勻，向Ca-DNA混合液中緩慢滴加2XHEBS BUFFER,形成Ca-DNA-P混合液，一邊加2XHEBS一邊振蕩離心管，充分混勻形成鈣磷顆粒。8-12hr后，換18-20ml無血清培養(yǎng)基，72hr后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，每個培養(yǎng)皿中加入Tris+NaCl (pH 8. 5) 1ml，用刮匙刮取細胞，收集于干凈離心管，-80°C凍存。10.病毒純化將凍存于_80°C的細胞取出，在37°C解凍溶解，反復凍融4次，8，OOOg離心15min，
將上清放至干凈離心管，棄細胞沉淀。用-20°C預冷的無水乙醇與rAAV以3 : I的體積比充分混勻，_20°C冰箱放置2hr后，4°C，13，OOOrpm離心15min，棄上清；乙醇揮發(fā)后，加入相應體積Tris+NaCl (pH 8. 5)溶解沉淀。用Millipore小濾器(O. 22 μ m)過濾。11.病毒滴度測定樣品處理rAAV病毒液40 μ I蛋白酶 K(20mg/ml) 5 μ I55°C，反應 lhr;酚氯仿異戊醇45 μ I4°C, 12, OOOg 離心 5min 回收水相；氯仿45 μ I4°C，12，000g 離心 5min 回收水相。Real-time PCR Primer I (10 μ m) O. 4 μ I
Primer 2 (10 μ m) 0. 4 μ ISYBR Green I Mix 10 μ IddH20 8. 2 μ ITemplate I μ I
95 °C 30sec—(95 °C 5sec—60 °C 5sec—72 °C 20sec)X40 個循環(huán)一MeltingCurve12.病毒轉(zhuǎn)染效率純化后的病毒轉(zhuǎn)染至293T細胞48小時后，熒光顯微鏡觀察被轉(zhuǎn)染細胞比例，其轉(zhuǎn)染效率可達90%以上(圖4)。實施例3表達hsa-miR-21 *的重組腺相關病毒對高血壓的治療作用I. SHR大鼠主動脈miR-21 *表達檢測我們采用4周齡的SHR大鼠，通過尾靜脈分別注射rAAV-miR-21 *和rAAV-anti-miR-21 *，病毒滴度IX IO11PFU/每只，至實驗終點(8周后)時采用real-timePCR法檢測SHR大鼠主動脈中miR-21 *的表達情況，結(jié)果顯示rAAV_miR-21 *處理可明顯增加主動脈miR-21 *的表達,而rAAV-anti-miR-21 *處理可明顯降低主動脈miR-21 *的表達(圖 5)。2. SHR大鼠血壓監(jiān)測每2周測量一次尾動脈血壓，結(jié)果顯示rAAV-miR-21 *處理可明顯降低SHR大鼠的收縮壓水平，且呈時間依賴趨勢，而rAAV-anti-miR-21 *處理可明顯升高SHR大鼠的收縮壓水平，也呈時間依賴趨勢(圖6A)。3. SHR大鼠心功能檢測實驗終點(8周后)時采用心內(nèi)導管術法檢測SHR大鼠心功能，方法如下按照美國Millar Instrument PowerLab 公司文獻介紹及 MPVS-300 (MillarPressure-Volume System)儀器說明進行。腹腔注射戍巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉大鼠，固定于小動物手術臺。頸部正中切口，鈍性分離各層組織，暴露右頸總動脈鞘，游離約
I.5cm頸動脈；結(jié)扎頸動脈遠心端，動脈夾夾閉近心端。將前端帶有電極的P-V微導管(SPR-838, Millar Instruments,Houston,TX)經(jīng)右頸總動脈插入至主動脈,通過壓力-容積傳導系統(tǒng)(Millar Instruments)連接 PowerLab/4SP A/D converter (ADInstruments,Mountain View, CA)記錄信號,動態(tài)觀察壓力波形變化,穩(wěn)定數(shù)分鐘后記錄動脈波形。將導管送入左心室，調(diào)整導管位置，直至穩(wěn)定出現(xiàn)完整的壓力-容積環(huán)圖形，連續(xù)記錄壓力、容積變化20min，以獲得穩(wěn)態(tài)的血流動力學數(shù)據(jù)。分離右頸靜脈，插管，彈丸式注射100 μ I15 %氯化鈉，獲得parallel volume (Vp)值，隨后切開腹部組織,暴露下腔靜脈，短暫阻斷下腔靜脈，獲得前負荷減少時血流動力學數(shù)據(jù)。經(jīng)pressure-volume analysis軟件(PVAN)處理后獲得血流動力學數(shù)據(jù)，觀測指標包括心率(heart rate, HR)、左室收縮末壓(LV end-systolic pressure, PES)、左室壓力最大上升速率(maximal rates of rise ofventricular pressure,dP/dt max)和左室壓力最大下降速度(maximal rates of declineof ventricular pressure, dp/dt min)。結(jié)果顯示rAAV-miR-21 *處理可明顯改善SHR大鼠的心臟功能，而rAAV-anti-miR-21 *處理可明顯損傷SHR大鼠的心臟功能(圖6B)。
權利要求
1.一種用于高血壓和/或由高血壓導致的各種并發(fā)癥的基因治療的重組腺相關病毒，其特征在于該載體系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒pXX9,輔助質(zhì)粒phelper,真核表達載體pAAV_D (+),并在真核表達載體pAAV_D(+)內(nèi)分別插入了人類hsa-miR-21 *或anti-hsa_miR-21 *表達序列。
2.如權利要求I所述的重組腺相關病毒由天然狀態(tài)的腺相關病毒和腺病毒經(jīng)分子生物學方法人工剪切、修飾和加工而成。
3.如權利要求I所述的重組腺相關病毒為分別表達人類hsa-miR-21*或anti-hsa-miR-21 *的重組腺相關病毒，其特征在于 1)pXX9:為包裝質(zhì)粒，含有編碼腺相關病毒Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列； 2)phelper:為輔助質(zhì)粒，刪除了腺病毒的致病基因序列，保留了感染性復制所需序列，它們表達的蛋白質(zhì)可發(fā)揮輔助作用以刺激AAV基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，保證AAV的產(chǎn)量； 3)pAAV-D(+):真核表達載體，所用的是CMV啟動子，有較強的表達效率，其含有多克隆位點，可以連接不同的目的基因；本發(fā)明PAAV-D (+)分別連接hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *表達序列(pAAV-D (+)-miR-21 *和 pAAV-D (+)-anti-miR-21 * );該載體含有rAAV轉(zhuǎn)基因表達所必須的末端重復序列(ITRs)，負責病毒的復制和病毒外殼的包被并攜帶目的基因。
4.如權利要求I所述的重組腺相關病毒是分別表達hsa-miR-21*和anti-hsa-miR-21* 的重組腺相關病毒 rAAV-miR-21 *和 rAAV-anti-miR-21 '
5.如權利要求I所述的重組腺相關病毒為分別插入重組腺相關病毒表達載體的人類hsa-miR-21 *和反義anti-hsa-miR-21 *表達序列,其特征在于該序列由人工設計、化學方法合成。
6.該發(fā)明為一種藥物制劑組合物，其特征在于它包括有效量的權利要求I所述的分別表達人類hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的兩種重組腺相關病毒和藥學上所接受的載體或賦形劑。
7.如權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于該重組腺相關病毒由天然狀態(tài)的腺相關病毒和腺病毒經(jīng)分子生物學方法人工剪切、修飾和加工而成。
8.如權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于該重組腺相關病毒是分別表達人類hsa-miR-21 *和 anti-hsa-miR-21 * 的重組腺相關病毒 rAAV-miR-21 *和 rAAV-anti-miR-21ο
9.一種制備分別表達人類人類hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *的重組腺相關病毒的方法，其特征在于 1)提供腺相關病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列pXX9質(zhì)粒，和刺激腺相關病毒復制和轉(zhuǎn)錄所必需的序列一Phelper質(zhì)粒； 2)提供含腺相關病毒基因組的真核表達載體pAAV-D(+)，在該真核載體中腺相關病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區(qū)，并分別插入hsa-miR-21 *和anti-hsa-miR-21 *表達序列，分別形成重組質(zhì)粒 pAAV_D (+) _miR_21 *和 pAAV_D (+) _anti_miR_21 * ； 3)將步驟2)中獲得的 pAAV-D (+) -miR-21 *和 pAAV_D (+) -anti-miR-21 *分別與 pXX9、phelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，適時回收，并純化、檢測其病毒滴度； 4)將步驟3)中回收純化的病毒經(jīng)尾靜脈注射入高血壓動物體內(nèi)，檢測其生物學活性。
10.根據(jù)權利要求書9所述的方法，其特征在于在步驟3)中共轉(zhuǎn)染的方法是鈣磷DNA共沉淀轉(zhuǎn)染法；真核表達載體pAAV-D(+)所含啟動子為CMV啟動子；用乙醇純化，用real-timePCR法檢測滴度。
全文摘要
本發(fā)明涉及能調(diào)控人類miRNA-21＊的重組腺相關病毒重組體(rAAV-miRNA-21＊/rAAV-anti-miRNA-21＊)的構(gòu)建和制備方法，更具體地說涉及hsa-miR-21＊及反義序列hsa-anti-miR-21＊的克隆及含hsa-miR-21＊和hsa-anti-miR-21＊的重組腺相關病毒重組體的包裝制備方法，和所述的重組腺相關病毒重組體的藥學用途。hsa-miR-21＊長21nt，為非編碼RNA，利用化學合成法構(gòu)建pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊表達質(zhì)粒，利用三種質(zhì)粒磷酸鈣共轉(zhuǎn)染法包裝制備含目的片段的重組腺相關病毒并純化，其中pAAV-D(+)-miR-21＊明顯自發(fā)性高血壓大鼠的血壓水平、同時改善心臟功能。因此，確定含hsa-miR-21＊表達序列的重組腺相關病毒成為用于高血壓及其他相關疾病的臨床治療藥物的可能性。
文檔編號C12N15/864GK102965347SQ20121006922
公開日2013年3月13日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權日2012年3月15日
發(fā)明者汪道文, 陳琛, 王峰, 楊盛蘭, 馬飛 申請人:汪道文, 陳琛, 王峰