專利名稱：共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒ha基因重組腺病毒的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，特別是涉及ー種共表達(dá)HlNl與H3N2亞型豬流感病毒血凝素蛋白重組腺病毒的構(gòu)建；兩種血凝素之間的linker FMDV 2A為重組腺病毒中不同血凝素蛋白的単獨(dú)表達(dá)提供了新的手段，為H3、Hl亞型豬流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為進(jìn)一歩研究開(kāi)發(fā)基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
豬流感(swine influenza, SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的ー種急性高度接觸性傳染病，単獨(dú)感染發(fā)病率高、死亡率低，臨床上常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胸膜肺炎等并發(fā)或繼發(fā)感染，導(dǎo)致患病動(dòng)物生產(chǎn)性能下降或死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。除此之外，豬作為人流感和禽流感病毒的“混合器”，在流感病毒種間傳播及流行病學(xué)研究中占據(jù)重要地位。近來(lái)，HlNU H1N2和H3N2亞型流感病毒一直在世界豬群中共同流行，豬流感的病原學(xué)和血清學(xué)調(diào)查顯示，HlNl和H3N2亞型已成為在我國(guó)豬群中廣泛流行的優(yōu)勢(shì)毒株。目前，主要是通過(guò)接種疫苗來(lái)預(yù)防該病的發(fā)生。常規(guī)滅活疫苗對(duì)該病的免疫防制存在不足之處，而弱毒疫苗則存在潛在的生物安全問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效、廉價(jià)、安全的疫苗勢(shì)在必行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，學(xué)者們不斷進(jìn)行著新型基因工程流感疫苗的研究。HA蛋白為SIV的表面糖蛋白，病毒感染后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗HA蛋白的抗體，該抗體具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作為重要的革巴抗原。腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有穩(wěn)定且易調(diào)控、表達(dá)外源抗原活性高、免疫途徑廣泛、安全高效等優(yōu)點(diǎn)。多種人類和動(dòng)物病原基因的重組腺病毒的成功構(gòu)建與應(yīng)用結(jié)果表明重組腺病毒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，能夠抵御相應(yīng)病原的致死性侵襲，在動(dòng)物疫苗方面顯示出良好的應(yīng)用前景。FMDV 2A具有自剪切功能，2個(gè)外源基因之間以2A序列連接形成一個(gè)完整的0RF。翻譯時(shí)融合蛋白可在編碼2A區(qū)域的C端被2A切開(kāi)，將融合蛋白切割分離為兩個(gè)獨(dú)立的蛋白(Mattion et al.，1996)。FMDV 2A基因其短小的基因序列和2A高效的自剪切效率為ニ價(jià)基因疫苗的研制提供了新的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其構(gòu)建ー株以FMD 2A為linker共表達(dá)HlNl與H3N2亞型豬流感病毒血凝素蛋白重組腺病毒，為H3、H1亞型豬流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為SIV腺病毒活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)，采用第三代腺病毒載體，它突出的優(yōu)點(diǎn)是缺失全部的腺病毒蛋白編碼序列，感染后沒(méi)有病毒蛋白表達(dá)，降低了機(jī)體的免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性，提高了安全性。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于首先分別設(shè)計(jì)針對(duì)HlNl與H3N2亞型豬流感病毒HA蛋白及FMD 2A的基因序列，然后將其與酶切后的腺病毒穿梭載體連接，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定；將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有腺病毒骨架質(zhì)粒的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒；然后用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在293細(xì)胞內(nèi)包裝出重組腺病毒；通過(guò)熒光顯微鏡觀察、PCR檢測(cè)，證明血凝素基因已成功克隆入腺病毒載體。并通過(guò)小鼠免疫試驗(yàn)驗(yàn)證獲得的重組腺病毒可以同時(shí)對(duì)此兩種亞 型豬流感的攻擊提供一定的保護(hù)。具體步驟如下
1.針對(duì)HlNl和H3N2亞型SIVHA基因及FMD 2A基因的設(shè)計(jì)
從GenBank上下載HlNl和H3N2亞型SIV毒株HAl基因及FMD 2A的序列，擴(kuò)增基因的特異性引物由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成設(shè)計(jì)。見(jiàn)表I針對(duì)HlNl和H3N2亞型SIV毒株HAl基因及FMD 2A基因的引物序列。
2.重組穿梭載體的構(gòu)建
將擴(kuò)增得到的H1HA1-2A與酶切線性化的pAdTrack載體16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)PCR、酶切篩選正確克隆，將得到的重組穿梭載體質(zhì)粒線性化后與H3HA1連接并轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定得到重組腺病毒穿梭質(zhì)粒。如圖I所示。3.重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及重組腺病毒的獲得
將線性化的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)攜帶腺病毒骨架質(zhì)粒的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，得到重組腺病毒質(zhì)粒。將重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，包裝后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行純化和鑒定。如圖2所示。4.重組腺病毒的鑒定
使用重組腺病毒原液感染293T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察重組毒所攜帯的GFP蛋白的表達(dá)情況，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)收集細(xì)胞，反復(fù)凍融后，離心后取上清進(jìn)行PCR鑒定。如圖3，4所示。5.重組腺病毒的小鼠免疫試驗(yàn)
用重組病毒免疫6周齡的雌性昆明鼠,兩周后再次免疫,ニ免后兩周用HlNl和H3N2SIV進(jìn)行攻毒，測(cè)攻毒后免疫保護(hù)率。通過(guò)檢測(cè)小鼠對(duì)病毒攻擊的保護(hù)情況評(píng)價(jià)該重組病毒的免疫原性。本發(fā)明的積極效果是將不同亞型SIV HA基因以串聯(lián)方式插入到同一株腺病毒載體上，即用質(zhì)粒pUM-T、腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι等，經(jīng)一系列中間過(guò)程，得到基因表達(dá)質(zhì)粒等中間產(chǎn)物，將最后得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；根據(jù)腺病毒感染形成的細(xì)胞病變及GFP基因表達(dá)可見(jiàn)緑色熒光兩方面來(lái)篩選重組病毒，用PCR鑒定該重組腺病毒。該重組腺病毒為H3、H1亞型豬流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為進(jìn)一歩研究開(kāi)發(fā)基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。2009年3月至今，流行于全球許多國(guó)家人群中的HlNl亞型流感進(jìn)ー步突出了 SI在人類公共衛(wèi)生方面具有的潛在危害性，研制高效、安全的疫苗為SI的防制提供物質(zhì)儲(chǔ)備，已經(jīng)不單單具有獸醫(yī)學(xué)的研究意義，同時(shí)對(duì)保障人類的生命安全也具有重要意義。


圖I為重組腺病毒穿梭載體PCR和酶切鑒定結(jié)果，M:DL2000。圖2為重組腺病毒質(zhì)粒PCR和酶切鑒定結(jié)果，M:DL15000。圖3為重組腺病毒PCR鑒定結(jié)果，M:DL15000。圖4為重組腺病毒二次接種293T細(xì)胞結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I目的基因引物設(shè)計(jì)及重組穿梭載體構(gòu)建
根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的HlNl和H3N2亞型SIV HAl及FMD 2A的核酸序列設(shè)計(jì)引物，并在HA及2A基因上、下游分別引入限制性酶切位點(diǎn)。將H1-2A與經(jīng)內(nèi)切酶Sal I和Xho I雙酶切后線性化的pAdTrack載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定(上海生エ公司進(jìn)行測(cè)序分析)。鑒定陽(yáng)性克隆的引物序列
F :5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3，
R :5’-CGCTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3，
PCR反應(yīng)循環(huán)條件95°C預(yù)變性Imin ;95°C變性30s，60°C退火40s，72°C延伸50s (30個(gè)cycles);最后 72°C延伸 IOmin0將鑒定正確的重組載體經(jīng)Xho I和Xba I線性化后與H3連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定(上海生エ公司進(jìn)行測(cè)序分析)。鑒定陽(yáng)性克隆的引物序列
F :5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3’，
R :5’-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3’
PCR反應(yīng)循環(huán)條件95°C預(yù)變性Imin ;95°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸90s (30個(gè)cycles);最后 72°C延伸 IOmin0實(shí)施例2重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及重組腺病毒的獲得
如圖1-3所示，將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Pme I線性化、純化回收后，轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組。Kan抗性篩選后提取質(zhì)粒，對(duì)提取后的質(zhì)粒用Pac I進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。為了獲得大量高質(zhì)量的重組質(zhì)粒，將篩選的陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主菌DH5ci擴(kuò)增。用核酸內(nèi)切酶Pac I將從宿主菌DH5 α量擴(kuò)增的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后，純化回收。以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293Τ細(xì)胞，4Χ IO5/孔接種到六板中，每孔含3mL培養(yǎng)基，在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。將5μ FuGENG HD轉(zhuǎn)染試劑與2Pg純化回收得到的重組腺病毒質(zhì)粒DNA溶液加入到500μ1無(wú)血清，無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混合均勻，室溫溫育20min。將DNA與混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中混勻，于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37°C孵育6h后加入含10%血清的DMEM 3mL,繼續(xù)培養(yǎng)7 10d，并在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)狀況，了解腺病毒包裝過(guò)程，待有較明顯的熒光或明顯的細(xì)胞病變后，于-80°C /37°C反復(fù)凍融3次，收集于IOmL離心管中，以10000r/min離心IOmin,收集上清即為收獲的病毒原液，按I : 10的比例感染新的293T細(xì)胞，如此反復(fù)制備出3代重組
腺病毒。實(shí)施例3重組腺病毒的鑒定
如圖4所示，重組腺病毒再次感染293細(xì)胞48h后，倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)GFP表達(dá)，證明重組腺病毒基因組中有GFP基因，符合預(yù)期結(jié)果。按照Wizard SV GenomicDNA Purification System試劑盒操作步驟提取重組腺病毒的基因組DNA,以I μ L (50 IOOng)基因組 DNA 為模板，Mgcl2 I μ L，dNTP I. 5 μ L，DEPC 水 20 μ L，上下游引物各 O. 5 μ L(IOpmoI / μ L), Taq 酶 O. 5 μ L,總體系 25 μ しF:5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3’
R:5’-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3’PCR反應(yīng)循環(huán)條件95°C預(yù)變性Imin ;95°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸90s (30個(gè)cycles);最后 72°C延伸 IOmin0
實(shí)施例4重組腺病毒的小鼠免疫試驗(yàn)
把7周齡的昆明鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。第一組用rAd-Hl-2A-H3免疫，第二組用rAd-GFP免疫，第三組用PBS免疫。在初免后2周加強(qiáng)免疫一次，采用皮下注射的方式，免疫劑量為IX 108TCID50。在加強(qiáng)免疫后2周，用106EID50的HlNl和H3N2通過(guò)滴鼻法對(duì)三組攻毒,姆只小鼠50 μ I0
權(quán)利要求
1.共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于首先分別設(shè)計(jì)針對(duì)HlNl和H3N2亞型SIV HA及FMD 2A引物序列，然后將其與酶切后的腺病毒穿梭載體PAdTrack連接，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定；將鑒定正確的重組腺病毒穿梭載體轉(zhuǎn)化入含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，經(jīng)PCR和酶切鑒定得重組腺病毒質(zhì)粒；將得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行重組腺病毒的包裝；包裝后將得到的病毒原液感染293T細(xì)胞或MDCK細(xì)胞，48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并通過(guò)PCR方法鑒定，具體步驟如下I)根據(jù)GeneBank上HlNl和H3N2亞型SIV HA及FMD2A序列設(shè)計(jì)引物；2)HA序列與pAdTrack載體連接，轉(zhuǎn)化，挑去菌落，應(yīng)用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)PCR，酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果顯示該重組腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功；3)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中同源重組，得到重組腺病毒質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝；4)將轉(zhuǎn)然后得到的病毒原液感染293T細(xì)胞，48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并提取細(xì)胞基因組DNA，通過(guò)PCR方法檢測(cè)HA基因序列；5)用重組病毒免疫6周齡的雌性昆明鼠,在ニ免后兩周用HlNl和H3N2 SIV進(jìn)行攻毒,測(cè)攻毒后免疫保護(hù)率以評(píng)價(jià)該重組病毒對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于所述的HA基因與含有CMV啟動(dòng)子的腺病毒穿梭載體pAdTrack組建成重組腺病韋穿梭質(zhì)粒 pAdTrack_Hl_2A_H3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于所述的重組腺病毒載體的構(gòu)建如下1)制備含有腺病毒骨架質(zhì)粒PAdEasy-I的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，2)將得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pme I單酶切后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及酶切鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的ー種共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于兩種目的基因之間以FMDV 2A為linker，F(xiàn)MDV 2A具有自剪切功能，翻譯時(shí)融合蛋白可在編碼2A區(qū)域的C端被2A切開(kāi)，分別表達(dá)為兩個(gè)獨(dú)立的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種共表達(dá)兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于首先分別設(shè)計(jì)針對(duì)H1N1和H3N2亞型SIVHA及FMD2A引物序列，然后將其與酶切后的腺病毒穿梭載體pAdTrack連接，進(jìn)行同源重組，經(jīng)PCR和酶切鑒定得重組腺病毒質(zhì)粒；將得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝后將得到的病毒原液感染293T細(xì)胞或MDCK細(xì)胞。該重組腺病毒為H3、H1亞型豬流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。2009年3月至今，流行于全球許多國(guó)家人群中的H1N1亞型流感進(jìn)一步突出了SI在人類公共衛(wèi)生方面具有的潛在危害性，研制高效、安全的疫苗為SI的防制提供物質(zhì)儲(chǔ)備。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102719479SQ201210069489
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者丁壯, 叢彥龍, 劉慧 , 朱利塞, 李鑫, 楊建新, 樊嬌, 郭育培, 韓明明, 黃志強(qiáng) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)