專利名稱：一種磁性酶納米凝膠生物催化顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磁性酶納米凝膠生物催化顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
天然酶的穩(wěn)定性以及可回收利用性，是酶作為生物催化劑工業(yè)應(yīng)用的主要限制性因素。目前，化學(xué)添加劑方法、固定化方法、基因工程等方法能夠提高酶分子的穩(wěn)定性，但是，添加劑方法需要加入大量的添加劑，同時會對體系帶來新的雜質(zhì)和干擾；傳統(tǒng)固定化方法引入較高的傳質(zhì)阻力，帶來酶催化活性的顯著下降；而基因工程方法較為復(fù)雜、成本較高、對穩(wěn)定性提高效果有限、無法解決大量廉價生產(chǎn)的問題。現(xiàn)階段納米級催化顆粒制劑因其傳質(zhì)阻力低，催化活性高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)受到關(guān)注。制備納米級酶制劑的方法包括酶分子與納米粒子的化學(xué)交聯(lián)法以及原位聚合法生成單分子酶納米粒子或納米凝膠?；瘜W(xué)交聯(lián)法依賴于納米粒子與酶分子的共價結(jié)合，往往導(dǎo)致蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)被破壞，底物對活性位點(diǎn)的空間阻礙增大或酶催化過程必須的中間體無法形成，總體催化活性降低。原位聚合法往往依賴目標(biāo)蛋白的表面氨基酸殘基實(shí)現(xiàn)可聚合集團(tuán)修飾，大量研究在特定蛋白或特定高分子，存在無法推廣至所有工業(yè)用酶的問題。因此開發(fā)一種具有普適性的，可以推廣到多種工業(yè)用酶的制備具有高穩(wěn)定性、高生物催化活性、易于實(shí)施、粒徑可控的具有良好市場和重大價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磁性酶納米凝膠顆粒，以解決現(xiàn)有的天然酶熱穩(wěn)定性差、無法回收利用的問題，對于進(jìn)一步開拓酶的應(yīng)用具有重要意義。本發(fā)明所提供的磁性酶納米凝膠顆粒，其為核殼結(jié)構(gòu)，核芯為表面吸附酶分子的磁性納米粒子，酶分子與磁性納米粒子以靜電力相互作用；外殼為交聯(lián)的高分子材料層； 所述磁性納米粒子的表面修飾有可與所述交聯(lián)的高分子材料層反應(yīng)的基團(tuán)，所述核殼之間通過化學(xué)鍵連接。本發(fā)明中，所述磁性酶納米凝膠顆粒的粒徑可為150_250nm，所述交聯(lián)的高分子材料層的厚度為100-200nm。所述磁性納米粒子具有磁性金屬(如Fe, Ni, Co)或合金納米粒子(如Fe-Pt, Fe-Co),過渡族金屬氧化物納米粒子(Fe3O4, y -Fe2O3, MnO, FeCoO)。所述磁性納米粒子的粒徑可為5-20nm，其在水溶液中以小聚集體的形式存在，粒徑為50nm。所述酶具體可為脂肪酶、胰蛋白酶、細(xì)胞色素丙等。本發(fā)明還提供了上述磁性酶納米凝膠顆粒普適性的制備方法，以解決現(xiàn)有固定化酶引入化學(xué)修飾劑或交聯(lián)劑常導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變以及酶催化活性較低的問題。采用該制備方法可以實(shí)現(xiàn)在保持酶催化活性的同時顯著改善酶的熱穩(wěn)定性和具有易回收利用的特性。本發(fā)明所提供的制備磁性酶納米凝膠顆粒的方法，是以下述質(zhì)量份的物質(zhì)為原料制備得到的表面修飾的磁性納米粒子40份、酶10份、形成殼層高分子材料的單體200 400份、交聯(lián)劑O. 5 5份和引發(fā)劑O. 5 20份，所述表面修飾的磁性納米粒子其表面具有可聚合基團(tuán)以及對所述酶分子具有靜電吸附作用的基團(tuán)；所述方法包括下述步驟I)將表面修飾的磁性納米粒子與酶加入pH值為5 10的緩沖溶液中，在O 50°C條件下反應(yīng)O. 5 6小時，得到酶-納米粒子復(fù)合物，即所述磁性酶納米凝膠顆粒的核
-I-H
心;2)將所述酶-納米粒子復(fù)合物加入到有機(jī)溶劑水溶液中，再加入單體、引發(fā)劑和交聯(lián)劑，在O 50°C下反應(yīng)O. 5 6小時，得到所述磁性酶納米凝膠顆粒。上述表面修飾的磁性納米粒子可根據(jù)具體所選用的酶，按照下述三種方法中的任意一種制備得到的方法一將磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑在有機(jī)溶劑水溶液中，于30 70°C下反應(yīng)5 12 小時，即得表面修飾的磁性納米粒子；其中，所述硅烷偶聯(lián)劑為至少兩種硅烷偶聯(lián)劑的混合物，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式為Y (CH2) SiX3, X代表可水解基團(tuán)，如氯基、甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、乙酰氧基等，這些基團(tuán)水解時即生成硅醇，從而與磁性納米粒子表面的羥基結(jié)合形成硅氧烷，Y代表有機(jī)功能基團(tuán)，此處Y具體指對所述酶分子具有靜電吸附作用的基團(tuán)以及可聚合基團(tuán)，當(dāng)在制備條件下，酶分子帶負(fù)電荷，此處Y則為帶正電荷的基團(tuán)如氨基等，當(dāng)在制備條件下，酶分子帶正電荷，此處Y則為帶負(fù)電荷的基團(tuán)如環(huán)氧基、巰基、氯基或脲基；所述可聚合基團(tuán)具體可為乙烯基等。所述對所述酶分子具有靜電吸附作用的基團(tuán)和可聚合基團(tuán)的摩爾比為90 10到 50 50 ;所述磁性納米粒子與所述硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量份數(shù)比為200 2 40。方法二I)將磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑在有機(jī)溶劑水溶液中，于30 70°C下反應(yīng)5 12小時；其中，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式為Y(CH2)SiX3,X代表可水解基團(tuán)和Y代表帶氨基；2)將步驟I)修飾后的磁性納米粒子加入到pH值為8 9的緩沖液中，再加入粒子修飾劑A,在O 50°C條件下反應(yīng)O. 5 6小時，即得表面修飾的磁性納米粒子；所述粒子修飾劑A是分子結(jié)構(gòu)中至少含有一個可聚合基團(tuán)且可與氨基發(fā)生反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接的物質(zhì)；所述磁性納米粒子、所述硅烷偶聯(lián)劑與所述粒子修飾劑A的質(zhì)量份數(shù)比為 200 2-40 O.2-20 ；方法三I)將磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑在有機(jī)溶劑水溶液中，于30 70°C下反應(yīng)5 12小時；其中，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式為Y(CH2)SiX3, X代表可水解基團(tuán)和Y代表氨基；2)將步驟I)修飾后的磁性納米粒子加入到pH值為8 9的緩沖液中，再加入粒子修飾劑A，在O 50°C條件下反應(yīng)O. 5 6小時；所述粒子修飾劑A是分子結(jié)構(gòu)中至少含有一個可聚合基團(tuán)且可與氨基發(fā)生反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接的物質(zhì)；3)將步驟2)修飾后的磁性粒子加入到有機(jī)溶劑中，再加入粒子修飾劑B，在O 50°C條件下反應(yīng)2 6小時，即得表面修飾的磁性納米粒子；所述粒子修飾劑B是分子結(jié)構(gòu)中至少含有一個羧基且可與所述硅烷偶聯(lián)劑中的有機(jī)功能基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接的物質(zhì)；所述磁性納米粒子、所述硅烷偶聯(lián)劑、所述粒子修飾劑A、所述粒子修飾劑B的質(zhì)量份數(shù)比為 200 2-40 O. 2-20 100-150。在本發(fā)明中，所述磁性納米粒子為金屬納米粒子、合金納米粒子或過渡族金屬氧化物納米粒子；所述金屬納米粒子具體為Fe, Ni或Co納米粒子。所述合金納米粒子具體為 Fe-Pt合金納米粒子或Fe-Co合金納米粒子,所述過渡族金屬氧化物納米粒子具體為Fe3O4 納米粒子、Y -Fe2O3納米粒子、MnO納米粒子或FeCoO納米粒子。所述磁性納米粒子的粒徑為5-20nm，所形成的小聚集體的直徑約為50nm。該磁性納米粒子可按照現(xiàn)有方法進(jìn)行制備。在本發(fā)明中，含氨基的硅烷偶聯(lián)劑具體可選自3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基二甲氧基娃燒，含可聚合基團(tuán)的娃燒偶聯(lián)劑具體為乙稀基二甲氧基娃燒、乙稀基二乙氧基硅烷、3_(異丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷、或3-甲基丙烯酸丙基(三甲氧基硅烷)。在本發(fā)明中，所述粒子修飾劑A具體選自下述至少一種丙烯酸琥珀酰亞胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴和衣康酸酯。所述粒子修飾劑B是具體選自琥珀酸酐和/或馬來酸酐。所述形成高分子材料層的單體為含乙烯基的單體；所述乙烯基單體是可通過自由基聚合反應(yīng)形成聚合物的乙烯基單體；具體可選自下述至少一種丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸鈉、丙烯?；垡叶?、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、順丁二烯、三羥基甲基丙烷和三甲基丙烯酸酯。在本發(fā)明中，所述引發(fā)劑是在O 50°C條件下能夠引發(fā)產(chǎn)生自由基使乙烯基單體發(fā)生自由基聚合的熱引發(fā)或氧化還原引發(fā)類物質(zhì)。所述引發(fā)劑具體選自A和B(1 I I 3，質(zhì)量比)組成的復(fù)合引發(fā)體系；所述A選自下述至少一種過硫酸鉀、過硫酸銨、過氧化氫、叔丁基過氧化氫和過氧化苯二甲酰；所述B選擇下述至少一種亞鐵鹽、亞硫酸鹽、 N，N’ - 二甲基苯胺、氨水、N，N’ - 二甲基-對甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和 N-甲基嗎啉。所述交聯(lián)劑具體可為N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺。所述有機(jī)溶劑選自下述任意一種二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、四氫呋喃、乙腈、乙醇和丙酮；所述有機(jī)溶劑水溶液是含下述至少一種有機(jī)溶劑的水溶液二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、四氫呋喃、乙腈、乙醇和丙酮，其中，有機(jī)溶劑的質(zhì)量百分比含量為O. 5 50% ；所述pH值為5 10的緩沖溶液選自下述任意一種物質(zhì)的水溶液磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、硼酸、硼酸鈉、硼酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉和Tris堿-鹽酸。本發(fā)明制備的磁性酶納米凝膠生物催化顆粒具有較高的生物催化活性，其原因如下首先，由于酶分子不與外殼高分子或磁性納米粒子共價連接，或被化學(xué)修飾劑修飾，酶分子本身最大限度得保持了天然酶的分子構(gòu)象從而降低了酶活性喪失。第二，高分子材料外殼層與磁性粒子表面的乙烯基集團(tuán)通過共價連接，并以交聯(lián)劑形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠防止磁性納米粒子和酶分子脫落，保證磁性酶納米凝膠的可重復(fù)使用性；第三，高分子外殼中的高分子層將酶分子包埋在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，顯著強(qiáng)化酶分子的結(jié)構(gòu)，從而有效阻止了高溫下酶的結(jié)構(gòu)振動導(dǎo)致的失活問題。同時親水性高分子材料層可以有效的保持酶分子表面的結(jié)構(gòu)必需水。并且由于脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的粒徑處于納米范圍、外殼連接的高分子材料層薄至幾個到幾十納米，因此對酶催化反應(yīng)的底物傳質(zhì)物無明顯的影響。綜上所述， 本發(fā)明的磁性酶納米凝膠生物催化顆粒具有活性高、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、可回收利用、易操作、粒徑小、比表面積高、無傳質(zhì)擴(kuò)散阻力特點(diǎn)。這種磁性酶納米凝膠生物催化顆粒作為一種高性能的納米酶制劑，在納米科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的磁性酶納米凝膠的制備方法，即先在磁性納米粒子表面通過化學(xué)修飾引入氨基基團(tuán)，碳碳雙鍵基團(tuán)，羧基基團(tuán)等，然后通過調(diào)節(jié)溶液PH值(達(dá)蛋白等電點(diǎn)pi值) 得到酶-磁性納米粒子的納米級復(fù)合材料，最后以含有碳碳雙鍵的乙烯基單體為原料，通過自由基聚合得到。該方法具有簡單溫和、便于純化、易于工業(yè)實(shí)施放大的特點(diǎn)。上述方法的核心在于制備過程如何保持酶的活性，同時既能夠提供較高的制備收率，又能夠制備具備理想的粒徑分布的納米顆粒。因此本發(fā)明在磁性粒子表面修飾引入氨基或羧基以及碳碳雙鍵基團(tuán)階段和自由基聚合階段使用了溫度控制，保證制備溫度發(fā)生在O 50°C，可以盡量避免酶在制備過程中的失活問題，制備過程幾乎不會引起酶的失活；同時為了保證在較低的制備溫度下自由基聚合可以得到較高的收率，使用了復(fù)合引發(fā)體系；為了保證自由基聚合主要發(fā)生在酶表面，使用了有機(jī)溶劑水溶液作為自由基聚合環(huán)境。同時該制備方法可以制備200納米以下尺度的磁性酶納米凝膠生物催化顆粒，避免了以往的酶固定化過程中高的傳質(zhì)阻力，方法簡便、易于工業(yè)實(shí)施和放大。


圖I為實(shí)施例I制備的磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒的透射電鏡照片。圖2為實(shí)施例I制備的磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒的原子力顯微鏡照片。圖3為實(shí)施例I制備的磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒在外加磁場作用下的磁相應(yīng)特性的照片。圖4為實(shí)施例I制備的磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒和天然脂肪酶的在50°C 和60°C定性對比圖。圖5為實(shí)施例I制備的磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒在循環(huán)利用10次的剩余活性圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明所述的磁性酶納米凝膠生物催化顆粒及其制備方法予以進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所用的酶包括脂肪酶，胰蛋白酶，細(xì)胞色素病，辣根過氧化物酶。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明， 均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I :制備磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒I)制備具有超順磁性的四氧化三鐵納米粒子
原料氯化鐵以摩爾計2份，氯化亞鐵以摩爾計I份，氨水(質(zhì)量濃度30% )以重量計為7份，合計10份。將氯化鐵與氯化亞鐵按照摩爾比2 I的比例溶解于雙蒸水中，滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH值小于2，通氮?dú)?0分鐘除氧。將上述氯化鐵/氯化亞鐵溶液冷卻至4 8°C，迅速攪拌的條件下(轉(zhuǎn)速大于l，000rpm)，迅速加入冷卻的氨水7份，形成黑色膠體溶液。將反應(yīng)體系溫度提高至70°C，并保持30分鐘，磁力攪拌，同時保持通氮?dú)?，得到黑色的四氧化三鐵納米粒子。用釹鐵硼磁體回收四氧化三鐵納米粒子，并用雙蒸水清洗3次除殘余氨水及各種離子。該納米粒子具有超順磁性，粒徑3 8nm。利用高分辨透射電鏡觀察上述四氧化三鐵納米粒子的形態(tài)，結(jié)果如圖I所示，平均粒徑為6nm，粒徑分布較為均勻。2)制備氨基和雙鍵修飾的四氧化三鐵納米粒子將步驟I)制備的四氧化三鐵納米粒子200質(zhì)量份分散于200質(zhì)量份乙醇/水(體積比1/1)混合溶劑中，再加入10質(zhì)量份3-氨丙基三乙氧基硅烷(偶聯(lián)劑)，通氮?dú)?0分鐘除氧。將反應(yīng)體系溫度升到50°C并保持12小時。用釹鐵硼磁體回收氨基修飾的四氧化三鐵納米粒子，并用雙蒸水清洗。將所得氨基修飾粒子分散于2000質(zhì)量份pH8. O的Tris-HCl 緩沖液中，緩緩加入20質(zhì)量份丙烯酸琥珀酰亞胺酯(粒子修飾劑A，先溶解于20質(zhì)量份二甲基砜)，磁力攪拌，在30°C條件下反應(yīng)2小時。用釹鐵硼磁體回收雙鍵修飾的四氧化三鐵納米粒子I，并用雙蒸水清洗。將雙鍵修飾的粒子I分散于1000質(zhì)量份四氫呋喃中，加入100質(zhì)量份琥珀酰亞胺 (粒子修飾劑B)，在室溫條件下反應(yīng)6小時。用釹鐵硼磁體回收羧基與雙鍵修飾的四氧化三鐵納米粒子II，并用雙蒸水清洗。3)制備磁性酶納米凝膠生物催化顆粒原料為脂肪酶以重量計為10份，經(jīng)過修飾劑A修飾的磁性納米粒子I以重量計為 40份，含乙烯基的單體為200份丙烯酰胺，交聯(lián)劑為2份甲叉雙丙烯酰胺，引發(fā)劑為4份過硫酸銨和6份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物，合計10份。將上述脂肪酶與磁性納米粒子加入pH為8的50mM Tris-HCl緩沖液中，在30°C 條件下反應(yīng)2小時，以磁鐵收集酶-納米粒子復(fù)合物并用緩沖液洗3次除去自由酶。加入 200份丙烯酰胺和2份甲叉雙丙烯酰胺(溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的二甲基亞砜水溶液中)，溫度保持30°C，磁力攪拌，加入上述引發(fā)劑，溫度保持30°C，繼續(xù)反應(yīng)2小時，然后以磁鐵收集產(chǎn)物，并凍干即可得到脂肪酶磁性酶納米凝膠催化顆粒。以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量磁性酶納米凝膠生物催化顆粒的生物催化活性總收率為85%，聚合反應(yīng)收率為99%， 而產(chǎn)物粒徑為220nm，外殼厚度為170nm。如圖4所示，50°C下，天然脂肪酶的酶活半衰期為30分鐘，而脂肪酶納米高分子生物催化顆粒在相同條件下500分鐘內(nèi)仍然保持了很高的催化活性。在60°C條件下，天然脂肪酶與脂肪酶磁性納米凝膠都會有一定程度失活，天然酶的半衰期為18分鐘，磁性納米凝膠的半衰期延長到253分鐘。如圖5表明，利用磁鐵可以從復(fù)雜體系中分離脂肪酶磁性酶納米凝膠并回收，在連續(xù)使用10次后，脂肪酶磁性酶納米凝膠的催化活性仍然保持在90% 以上。而天然脂肪酶無法回收利用。實(shí)施例2 :制備磁性胰蛋白酶納米凝膠生物催化顆
將實(shí)施例I中的目標(biāo)酶改為20份胰蛋白酶，磁性粒子改為實(shí)施例I中制備的羧基與雙鍵修飾的四氧化三鐵納米粒子II 80份，含乙烯基的單體為400份丙烯酰胺，交聯(lián)劑為4份甲叉雙丙烯酰胺，引發(fā)劑為8份過硫酸銨和12份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物。其余步驟與實(shí)施例I相同。最后將胰蛋白酶磁性酶納米凝膠分散在含有CaCl2 IOmM, pH值為8的 50mMTris-Cl激活緩沖液中。以Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽作為底物測量胰蛋白酶磁性酶納米凝膠生物催化顆粒的生物催化活性總收率為95%，聚合反應(yīng)收率為 89%，而產(chǎn)物粒徑為200nm。實(shí)施例3 :制備磁性細(xì)胞色素丙納米凝膠生物催化顆將實(shí)施例I中的目標(biāo)蛋白改為10份細(xì)胞色素丙，磁性粒子改為實(shí)施例I中制備的羧基與雙鍵修飾的四氧化三鐵納米粒子II 40份，乙烯基單體改為300份丙烯酸鈉、交聯(lián)劑改為O. 5份N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺，其余配方和步驟與實(shí)施例I相同。此時，得到的產(chǎn)物以2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)以及過氧化氫作為底物測量納米高分子生物催化顆粒的生物催化活性總收率為82%，聚合反應(yīng)收率為70%，而產(chǎn)物粒徑為250nm。實(shí)施例4 :制備磁性脂肪酶納米凝膠生物催化顆粒將實(shí)施例I步驟I)所制備的四氧化三鐵納米粒子200質(zhì)量份分散于20質(zhì)量份乙醇/水(體積比1/1)混合溶劑中，再加入10質(zhì)量份3-氨丙基三乙氧基硅烷(偶聯(lián)劑)與 3_(異丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷的混合物(二者質(zhì)量比I : I)，通氮?dú)?0分鐘除氧。將反應(yīng)體系溫度升到50°C并保持12小時。用釹鐵硼磁體回收雙鍵修飾的四氧化三鐵納米粒子，并用雙蒸水清洗。然后按照實(shí)施例I步驟3)中的方法制備磁性酶納米凝膠生物催化顆粒。以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量磁性酶納米凝膠生物催化顆粒的生物催化活性總收率為80%， 聚合反應(yīng)收率為80%，而產(chǎn)物粒徑為200nm。比較例I :將實(shí)施例I中引入交聯(lián)劑N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺這一步去掉，其余配方和步驟與實(shí)施例I相同，結(jié)果仍形成脂肪酶磁性納米凝膠生物催化顆粒，粒徑260nm，但是將該磁性酶納米凝膠在PH 6的磷酸鹽緩沖液(即調(diào)節(jié)pH使接近目標(biāo)蛋白脂肪酶pi)中溫育I小時，利用磁鐵分別收集磁性納米凝膠和上層清夜。發(fā)現(xiàn)上層清夜中還有相當(dāng)于 10%的蛋白以及催化活力，即聚丙烯酰胺沒有形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包埋脂肪酶，導(dǎo)致脂肪酶從磁性粒子表面逐漸脫落，不適合回收利用。比較例2 將實(shí)施例3中的N，N’_甲叉雙丙烯酰胺改為10份，其余配方和步驟與實(shí)施例3相同，結(jié)果反應(yīng)體系發(fā)生凝膠化，不形成納米級凝膠生物催化顆粒。凝膠仍具有催化活力，但由于傳質(zhì)阻力過高而不適合由于工業(yè)催化。比較例3 將實(shí)施例3中的緩沖液改為pH為4的乙酸鈉緩沖液，無法形成酶-粒子復(fù)合物， 即使引發(fā)聚合也無法形成將酶-粒子包埋的聚合物納米結(jié)構(gòu)，所形成的納米凝膠不具有催化活力。本發(fā)明可用其它的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)力要求書相當(dāng)?shù)暮泻头秶鷥?nèi)的任何改變，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種磁性酶納米凝膠顆粒，其為核殼結(jié)構(gòu)，核芯為吸附酶分子的磁性納米粒子，外殼為交聯(lián)的高分子材料層；所述磁性納米粒子的表面修飾有可與所述交聯(lián)的高分子材料層反應(yīng)的基團(tuán)，所述核殼之間通過化學(xué)鍵連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的磁性酶納米凝膠顆粒，其特征在于所述磁性酶納米凝膠顆粒的粒徑為150-250nm，所述交聯(lián)的高分子材料層的厚度為100_200nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的磁性酶納米凝膠顆粒，其特征在于所述磁性納米粒子為金屬納米粒子、合金納米粒子或過渡族金屬氧化物納米粒子；所述金屬納米粒子具體為 Fe、Ni或Co納米粒子,所述合金納米粒子具體為Fe-Pt合金納米粒子或Fe-Co合金納米粒子，所述過渡族金屬氧化物納米粒子具體為Fe3O4納米粒子、Y -Fe2O3納米粒子、MnO納米粒子或FeCoO納米粒子；所述磁性納米粒子的粒徑為5-20nm ;所述酶為脂肪酶、胰蛋白酶或細(xì)胞色素丙。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的磁性酶納米凝膠顆粒，其特征在于所述磁性酶納米凝膠顆粒是按照權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)所述方法制備得到的。
5.一種制備權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述磁性酶納米凝膠顆粒的方法，是以下述質(zhì)量份的物質(zhì)為原料制備得到的表面修飾的磁性納米粒子40份、酶10份、形成所述高分子材料層的單體200-400份、交聯(lián)劑O. 5 5份和引發(fā)劑O. 5 20份，所述表面修飾的磁性納米粒子其表面具有可聚合基團(tuán)以及對所述酶分子具有靜電吸附作用的基團(tuán)；所方法包括下述步驟.1)將表面修飾的磁性納米粒子與酶加入pH值為5 10的緩沖溶液中，在O 50°C條件下反應(yīng)O. 5 6小時，得到酶-納米粒子復(fù)合物，即所述磁性酶納米凝膠顆粒的核芯；.2)將所述酶-納米粒子復(fù)合物加入到有機(jī)溶劑水溶液中，再加入所述形成所述高分子材料層的單體、引發(fā)劑和交聯(lián)劑，在O 50°C下反應(yīng)O. 5 6小時，得到所述磁性酶納米凝膠顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述表面修飾的磁性納米粒子是按照下述三種方法中的任意一種制備得到的方法一將磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑在有機(jī)溶劑水溶液中，于30 70°C下反應(yīng)5 12小時， 即得表面修飾的磁性納米粒子；其中，所述硅烷偶聯(lián)劑為至少兩種硅烷偶聯(lián)劑的混合物，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式為Y(CH2)SiX3, X代表可水解基團(tuán)和Y代表有機(jī)功能基團(tuán)，所述Y為對所述酶分子具有靜電吸附作用的基團(tuán)和可聚合基團(tuán)，所述對所述酶分子具有靜電吸附作用的基團(tuán)和可聚合基團(tuán)的摩爾比為90 10-50 50 ;所述磁性納米粒子與所述硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量份數(shù)比為200 2 40 ;方法二 .1)將磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑在有機(jī)溶劑水溶液中，于30 70°C下反應(yīng)5 12小時；其中，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式為Y(CH2)SiX3, X代表可水解基團(tuán)和Y代表帶氨基；.2)將步驟I)修飾后的磁性納米粒子加入到pH值為8 9的緩沖液中，再加入粒子修飾劑A,在O 50°C條件下反應(yīng)O. 5 6小時，即得表面修飾的磁性納米粒子；所述粒子修飾劑A是分子結(jié)構(gòu)中至少含有一個可聚合基團(tuán)且可與氨基發(fā)生反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接的物質(zhì)；所述磁性納米粒子、所述硅烷偶聯(lián)劑與所述粒子修飾劑A的質(zhì)量份數(shù)比為.200 2-40 O.2-20 ；方法二 .1)將磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑在有機(jī)溶劑水溶液中，于30 70°C下反應(yīng)5 12小時；其中，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式為Y(CH2)SiX3, X代表可水解基團(tuán)和Y代表氨基；.2)將步驟I)修飾后的磁性納米粒子加入到pH值為8 9的緩沖液中，再加入粒子修飾劑A，在O 50°C條件下反應(yīng)O. 5 6小時；所述粒子修飾劑A是分子結(jié)構(gòu)中至少含有一個可聚合基團(tuán)且可與氨基發(fā)生反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接的物質(zhì)；.3)將步驟2)修飾后的磁性粒子加入到有機(jī)溶劑中，再加入粒子修飾劑B，在O 50°C 條件下反應(yīng)2 6小時，即得表面修飾的磁性納米粒子；所述粒子修飾劑B是分子結(jié)構(gòu)中至少含有一個羧基且可與所述硅烷偶聯(lián)劑中的有機(jī)功能基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接的物質(zhì)；所述磁性納米粒子、所述硅烷偶聯(lián)劑、所述粒子修飾劑A、所述粒子修飾劑B的質(zhì)量份數(shù)比為 200 2-40 O. 2-20 100-150。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式中Y代表氨基， 所述娃燒偶聯(lián)劑具體為3-氨丙基二乙氧基娃燒或3-氨丙基二甲氧基娃燒；所述娃燒偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)式中Y代表可聚合基團(tuán)，所述硅烷偶聯(lián)劑具體為乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、3_(異丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷、或3-甲基丙烯酸丙基(三甲氧基硅烷)；所述粒子修飾劑A選自下述至少一種丙烯酸琥珀酰亞胺酯、丙烯酰氯、丙烯酰溴和衣康酸酯；所述粒子修飾劑B選自下述至少一種琥珀酸酐和馬來酸酐。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述磁性納米粒子為金屬納米粒子、 合金納米粒子或過渡族金屬氧化物納米粒子；所述金屬納米粒子具體為Fe, Ni所述合金納米粒子具體為Fe-Pt合金納米粒子或Fe-Co合金納米粒子,所述過渡族金屬氧化物納米粒子具體為Fe3O4納米粒子、Y -Fe2O3納米粒子、MnO納米粒子或FeCoO納米粒子；所述磁性納米粒子的粒徑為5_20nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述形成所述高分子材料層的單體為含乙烯基的單體；所述含乙烯基單體是可通過自由基聚合反應(yīng)形成聚合物的乙烯基單體；所述乙烯基單體具體選自下述至少一種丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸鈉、丙烯?；垡叶?、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、順丁二烯、三羥基甲基丙烷和三甲基丙烯酸酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述引發(fā)劑是在O 50°C條件下能夠引發(fā)產(chǎn)生自由基使乙烯基單體發(fā)生自由基聚合的熱引發(fā)或氧化還原引發(fā)類物質(zhì)； 所述引發(fā)劑具體選自A和B按照質(zhì)量比I : I I : 3組成的復(fù)合引發(fā)體系；所述A選自下述至少一種過硫酸鉀、過硫酸銨、過氧化氫、叔丁基過氧化氫和過氧化苯二甲酰；所述B 選擇下述至少一種亞鐵鹽、亞硫酸鹽、N, N’ - 二甲基苯胺、氨水、N, N’ - 二甲基-對甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基嗎啉；所述交聯(lián)劑為N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑選自下述任意一種二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、四氫呋喃、乙腈、乙醇和丙酮；所述有機(jī)溶劑水溶液是含下述至少一種有機(jī)溶劑的水溶液二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈、乙醇和丙酮其中，有機(jī)溶劑的質(zhì)量百分比含量為O. 5 50% ；所述PH值為5 10的緩沖溶液選自下述任意一種物質(zhì)的水溶液磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、硼酸、硼酸鈉、硼酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、 碳酸鉀、碳酸氫鉀、乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉和Tris堿-鹽酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁性酶納米凝膠顆粒及其制備方法。該磁性酶納米凝膠顆粒為核殼結(jié)構(gòu)，其核心為表面吸附酶分子的磁性納米粒子，酶分子與磁性納米粒子以靜電力相互作用；外殼為交聯(lián)的高分子材料層；核殼之間通過化學(xué)鍵連接。制備方法如下先在磁性納米粒子表面通過化學(xué)修飾引入氨基、碳碳雙鍵、羧基等基團(tuán)，然后通過調(diào)節(jié)溶液pI得到酶-粒子的納米級復(fù)合材料，最后以乙烯基單體為原料，通過自由基聚合得到。該方法具有簡單溫和、便于純化、易于工業(yè)實(shí)施放大的特點(diǎn)。本發(fā)明的磁性酶納米凝膠顆粒具有生物催化活性高、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、便于循環(huán)利用的特點(diǎn)，在有機(jī)合成、食品工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、能源工業(yè)、生物醫(yī)藥、傳感器等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N11/14GK102604925SQ20121007025
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者劉錚, 盧滇楠, 林萌萌 申請人:清華大學(xué)