專利名稱：鵝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是鵝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPAR Y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法及其在畜禽育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因突變是指基因的核苷酸順序或數(shù)目發(fā)生改變。涉及DNA分子中單個(gè)堿基改變者稱為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。目前對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)的方法較多，而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的是成本相對(duì)較低、技術(shù)易掌握、檢出率較高和操作步驟簡(jiǎn)單的PCR-SSCP技術(shù)。該方法原理經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段在變性劑(如甲酰胺)或低離子濃度下經(jīng)高溫處理使之解鏈并保持在DNA單鏈狀態(tài)下，然后在一定濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長(zhǎng)短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，這種構(gòu)象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來(lái)維持。相同長(zhǎng)度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同，PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因靶DNA中發(fā)生單堿基置換，或個(gè)別堿基插入或缺失時(shí)，因遷移產(chǎn)生變化會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其順序不同或單個(gè)堿基差異，所形成的構(gòu)象就會(huì)不同，其在凝膠中泳動(dòng)速度不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態(tài)型。PPARy是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體家族(PPARs)的成員之一。是一種由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于II型核受體超家族成員，是影響脂肪細(xì)胞分化、內(nèi)分泌功能的重要調(diào)節(jié)因子，是噻唑烷二酮類藥物(TZDs)作用的靶分子，TZDs通過(guò)與PPAR Y結(jié)合而發(fā)揮降低血糖、血脂及增加胰島素敏感性的作用，人的PPARy基因常見的多態(tài)與胰島素敏感性、肥胖和心血管發(fā)病有關(guān)。常見多態(tài)Prol2Ala變異即使對(duì)肥胖有作用，需要與其他基因的相互作用表現(xiàn)出來(lái)，如Prol2Ala與0腎上腺素能受體(P 3-adrenergic receptor, BAR3)基因的Trp64Arg突變的相互作用，在墨西哥美國(guó)人中PPAR Y Ala等位基因攜帶者比Pro個(gè)體更肥胖，但這些個(gè)體需攜帶BAR3Arg64等位基因[1]。PPARy在脂肪和免疫器官表達(dá)。PPARy過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化，與C/EBP a協(xié)同作用，可以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。孟和等已經(jīng)克隆出鵝PPAR Y基因的⑶S區(qū)，并證實(shí)基因在肝臟和肌肉中無(wú)表達(dá)，高表達(dá)于脂肪，其次是腦和腎臟，低量表達(dá)于脾臟、心臟、肺臟、胃和小腸。王娉等構(gòu)建PPARy基因的真核表達(dá)載體免疫小鼠使其產(chǎn)生抗體，獲得的重組蛋白和抗血清。蘇勝?gòu)┑妊芯坷实蛮Z填飼后不同組織PPAR Y基因表達(dá)量差異結(jié)果顯示，肝臟組織中， 填飼組PPARy基因表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組中該基因的表達(dá)量(P < 0.01)，且表達(dá)量與肝臟指數(shù)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量呈顯著正相關(guān)(P < 0. 05)，說(shuō)明肝臟、皮下脂肪、腹脂組織PPARy基因的表達(dá)水平與朗德鵝肥肝形成有一定的關(guān)系。韓清等構(gòu)建了雞PPARy基因5’側(cè)翼區(qū)的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)單倍型，證明對(duì)雞脂肪性狀和骨骼性狀有一定的影響[5]。PPARy可由多種脂肪酸及其衍生物激活，是脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝重要調(diào)節(jié)因子。Koutnikova等研究表明，肌肉中PPARy主要負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)能量利用，而不是單純的控制糖穩(wěn)態(tài)或胰島素敏感性。Verma等證實(shí)PPAR y對(duì)肌肉分化有調(diào)節(jié)作用，PPAR y活性對(duì)C2C12肌細(xì)胞分化具有重要作用，上調(diào) 和下調(diào)PPAR Y蛋白水平均能抑制肌細(xì)胞分化。Cock等證實(shí)在脂肪組織中抑制PPARy表達(dá)，可以抑制間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)MSC向成骨干細(xì)胞分化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可能是由于PPARy表達(dá)量下降，限制了脂肪細(xì)胞分泌瘦素等抗成骨信號(hào)因子的能力，從而提高骨骼強(qiáng)度并增加骨量。迄今為止，國(guó)內(nèi)外均未見鵝PPAR Y基因遺傳變異的研究，由于中國(guó)地方鵝PPAR Y基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與屠宰性狀(如屠體重、胸肌重、腿肌重等)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鵝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPAR Y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法及其本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種鵝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPAR Y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，包括提取鵝血樣基因組DNA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用的上游引物序列為CCAITTGTTAITTATGACATGAACT，下游引物序列為GATCAITCAGGTCAAGAITCACA，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序鑒定后，與NCBI公布的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。所述的檢測(cè)方法，其中PCR擴(kuò)增體系2 X Taq PCR MasterMix 5 U L, ddH20
3.6 u LUOpmol/u L 引物各 0. 3 u L,50ng/mL 模板 DNA0. 8 u L ;PCR 擴(kuò)增參數(shù)94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；35 個(gè)循環(huán)，72°C 8min。所述的檢測(cè)方法，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為205bp。鵝PPAR Y基因位點(diǎn)A/G多態(tài)性在畜禽育種中的應(yīng)用，用于篩選屠宰性能高的鵝。采用上述方案，本發(fā)明利用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)鵝PPAR Y基因的多態(tài)性，并將其與屠宰性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證表明其可以作為鵝分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記。檢測(cè)鵝PPAR y編碼區(qū)存在I個(gè)SNP，呈現(xiàn)兩種基因型(AA、AG)，對(duì)浙東白鵝腿肌率的遺傳效應(yīng)達(dá)到顯著水平(P < 0. 05)，AG基因型個(gè)體的腿肌率顯著地高于AA型個(gè)體。選出的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可以輔于育種，從而加快畜禽育種進(jìn)程。。


圖I :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖2 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖；圖3 =PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
(I)特定引物的設(shè)計(jì)
針對(duì)鵝PPARY基因發(fā)生密碼子突變而可能引起剪接位點(diǎn)的活性進(jìn)而影響基因功能的單核苷酸多態(tài)性，以NCBI公布的鵝序列(Gene ID AF481798. I)為參考，利用Primer5. O設(shè)計(jì)PCR引物，其引物序列為上游引物CCATTTGTTATTTATGACATGAACT，下游引物GATCATTCAGGTCAAGATTCACA。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為205bp。對(duì)浙東白鵝的血樣提取DNA為模板，應(yīng)用該對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到與目的片段大小一致的片段(圖1)，經(jīng)雙向測(cè)序鑒定后，與NCBI公布的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。(2)鵝樣本的采集以浙東白鵝為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見下表。
品種樣品數(shù)樣品名稱樣品來(lái)源采樣方式
浙東白鵝I 172個(gè) I血樣上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所翅下靜脈采血(3)鵝血樣基因組DNA的提?、倮鋬鲅涸谑覝厝诨院螅?50 μ L移至離心管中，加入100 μ L鹽酸胍緩沖液(O. 47g/ml)和 400 μ L 裂解液(Tris 堿 O. 6057g ；Nacl 4. 383g ；EDTA 0. 29225g ；SDS 5g ;定容至500ml，NaOH調(diào)pH值至8· 0)，加入20 μ L蛋白酶K (濃度為100mg/mL)，上下顛倒試管充分混合，55 °C水浴過(guò)夜。②加入600 μ L氯仿抽提兩次,每次振蕩混勻15min, 12000r/min。③取上清至另一潔凈離心管中，加入等體積異丙醇,沉淀數(shù)小時(shí),4°C，12000r/min離心15分鐘，棄上清。④取上清，加入2倍體積的預(yù)冷_20°C冰乙醇洗滌沉淀DNA。⑤將DNA置于室溫下自然風(fēng)干干燥(注意不能太干燥)，根據(jù)沉淀的量加入適量(100-200 μ L) TE (ρΗ8. O)緩沖液溶解，置4°C冰箱溶解過(guò)夜；溶解后的DNA可貯于_20°C中備用。(4) DNA濃度和純度的檢測(cè)用I. 2 %的瓊脂糖凝膠檢測(cè)總DNA，并用DNA定量?jī)x測(cè)定濃度及純度。①瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取5 μ L待測(cè)DNA溶液和I μ L溴酚藍(lán)置入混勻，上樣于I. 2%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)，觀察電泳條帶，無(wú)明顯拖尾，條帶明亮則符合實(shí)驗(yàn)要求。②分光光度法測(cè)定取6 μ L待測(cè)DNA溶液稀釋500倍至3mL，分別在紫外分光光度計(jì)260nm和280nm處測(cè)定OD值。DNA 濃度(ul/ml) = 0D260X 稀釋倍數(shù) X 50 ；DNA 純度=0D260/0D280 ；(5) PCR 擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增體系2XTaq PCR MasterMix 5 μ L、ddH20 3· 6 μ L、引物(lOpmol/μ L)各 O. 3μ L、模板 DNA(50ng/mL)0. 8μ Lo PCR 擴(kuò)增參數(shù):94 °C 4min ；94 °C 30s, 55 °C 30s,72°C Imin ；35 個(gè)循環(huán)，72°C 8min。(6)電泳及基因型判定和測(cè)序圖將擴(kuò)增產(chǎn)物99°C變性5min后于12%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電泳完畢后進(jìn)行硝酸銀染色拍照。根據(jù)電泳結(jié)果直接判定個(gè)體基因型，引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在12%的聚丙烯酰胺凝膠上分別呈現(xiàn)兩種帶型，見圖2、圖3。(7)鵝PPAR Y基因SNP位點(diǎn)的基因和基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析①基因型頻率指一個(gè)群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。由于PCR-SSCP方法的檢測(cè)結(jié)果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率?；蛐皖l率=基因型個(gè)數(shù)/檢測(cè)群體總數(shù)②等位基因頻率記為Pi，表示在一個(gè)群體中某一等位基因的數(shù)量與占據(jù)同一基因座位的全部等位基因總數(shù)的比例，取值0-1之間。Pi = [2(ii) + (ijl) + (ij2)+......(ijn)]/2NPi :第i個(gè)等位基因的頻率i :純合復(fù)等位基因jl、j2、......jn :與i共顯的第I到第η個(gè)等位基因計(jì)算PPARy基因不同位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果見表。SNP的AA基因型和A等位基因頻率明顯聞?dòng)贏G基因型和G等位基因。表PPAR Y基因各位點(diǎn)在浙東白鵝群體中的基因型和基因頻率
權(quán)利要求
1.一種鵝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPAR y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，包括提取鵝血樣基因組DNA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用的上游引物序列為CCAITTGTTAITTATGACATGAACT，下游引物序列為GATCAITCAGGTCAAGAITCACA，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序鑒定后，與NCBI公布的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，其中PCR擴(kuò)增體系2XTaqPCRMasterMix 5 u L, ddH20 3. 6 u LUOpmol/u L 引物各 0. 3 y L、50ng/mL 模板 DNA0. 8 y L ；PCR擴(kuò)增參數(shù)94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ;35 個(gè)循環(huán)，72°C 8min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為205bp。
4.鵝PPARy基因位點(diǎn)A/G多態(tài)性在畜禽育種中的應(yīng)用，用于篩選屠宰性能高的鵝。
全文摘要
本發(fā)明公開了鵝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法及其在畜禽育種中的應(yīng)用，包括提取鵝血樣基因組DNA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用的上游引物序列為CCATTTGTTATTTATGACATGAACT，下游引物序列為GATCATTCAGGTCAAGATTCACA；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序鑒定后，與NCBI公布的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。檢測(cè)鵝PPAR γ編碼區(qū)存在1個(gè)SNP，呈現(xiàn)兩種基因型(AA、AG)，對(duì)浙東白鵝腿肌率的遺傳效應(yīng)達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，AG基因型個(gè)體的腿肌率顯著地高于AA型個(gè)體。選出的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可以輔于育種，從而加快畜禽育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643900SQ20121007128
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者何大乾, 劉毅, 吳華莉, 朱慶, 胡耀東 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院