專利名稱：適應無血清培養(yǎng)的hek293細胞系及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細胞系及其應用，特別涉及一種適應無血清培養(yǎng)的HEK293細胞系及其應用。屬于生物技術領域。
背景技術：
血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復雜混合物，其組成成份包括碳水化合物、血漿蛋白、多肽、脂肪、生長因子、激素、無機物等，這些物質是通過促進細胞生長或抑制細胞生長活性從而達到生理平衡的。除此之外，血清還提供除營養(yǎng)物質外的激素、生長因子，轉運大分子的結合蛋白以及能夠促使細胞貼壁并免受機械損傷的促接觸和伸展因子。在常規(guī)細胞培養(yǎng)中，血清是一個不可或缺的成分，但仍存在一些問題。比如成份復雜，不同批次之間差異明顯；而且對于大多數(shù)細胞，血清不是它們在體內(nèi)的常規(guī)內(nèi)環(huán)境， 只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能會改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。無血清培養(yǎng)作為一種新興的細胞大規(guī)模培養(yǎng)方案，在避免了上述采用有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的缺點的同時，并有一些新的特性，例如培養(yǎng)液成分明確，不同批次之間各成分含量沒有差異等，這些特性提高了培養(yǎng)基的穩(wěn)定性和實驗數(shù)據(jù)的一致性，并簡化了純化和下游加工的過程；另外，無血清培養(yǎng)基不含動物源性大分子蛋白，避免了細胞水平和機體水平不必要的副作用(如疫苗過敏反應)。重組腺病毒載體作為一種基因轉移載體系統(tǒng)，具有安全、病毒增殖滴度高、基因轉移效率高、宿主譜廣等優(yōu)點，在疫苗開發(fā)、基因治療等方面得到廣泛應用。但現(xiàn)行的腺病毒生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)量低、純化困難、依賴血清培養(yǎng)等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上問題，本發(fā)明發(fā)明人馴化了一株能高效包裝腺病毒的無血清細胞系。本發(fā)明以HEK293細胞為原始材料，篩選了一株適應無血清培養(yǎng)的細胞系，并研究了其產(chǎn)毒性能和穩(wěn)定性。本發(fā)明的一株適應無血清培養(yǎng)的HEK293細胞系，其特征在于所述HEK293細胞系命名為293SF，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCCNo. 5824，保藏日期為 2012年2月29日。本發(fā)明還提供了一種建立以上所述的HEK293細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)HEK293細胞進行適應培養(yǎng)前，采用10% FBS DMEM對其進行培養(yǎng)，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面時用含O. 25% EDTA的胰酶消化，1500r/min離心5min收集細胞，用適應液稀釋細胞至5 X IO5個細胞/mL，進入適應階段；(2)適應過程中采用培養(yǎng)液漸進替換的方法，按照以下步驟進行適應培養(yǎng)第I步用含有25%的無血清培養(yǎng)基293 SFM II和75%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基，傳代2次；第2步用含有50%的293 SFM II培養(yǎng)基和50%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基， 傳代2次；第3步用含有75%的293 SFM II培養(yǎng)基和25%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基， 傳代3次；第4步用含有87. 5%的293 SFM II培養(yǎng)基和12. 5%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基，傳代3次；第5步用含有95%的293 SFM II培養(yǎng)基和5%的含10%的牛血清DMEM培養(yǎng)基， 根據(jù)細胞狀態(tài)，傳代3 5次；第6步當?shù)?步細胞生長快速、狀態(tài)良好后，更換為100%的293 SFM II培養(yǎng)基傳代，得到適應無血清培養(yǎng)的293SF細胞系。在本發(fā)明的方法中，其特征在于在適應過程中，當細胞密度> IX IO6個細胞/mL 時，以3X IO5 5X IO5個細胞/mL的細胞密度進行傳代培養(yǎng)；完全更換為100%的293SFM II培養(yǎng)基后，當細胞密度達到I X IO6 3X IO6個細胞/mL時，以5X IO5個細胞/mL的細胞密度進行傳代培養(yǎng)。在本發(fā)明的方法中，其特征在于處于適應初期的細胞傳代時使用胰酶消化；當適應液中293 SFM II的比例達到95%時，停止使用胰酶，改用彎頭吸管將細胞從培養(yǎng)瓶表面吹下。在本發(fā)明的方法中，其特征在于所述方法還進一步包括待細胞適應無血清培養(yǎng)后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培養(yǎng)液在培養(yǎng)條件為37°C、8% CO2的
培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明的HEK293細胞系(命名為293SF)可用于貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。為促使細胞在無血清條件下貼壁，本發(fā)明在培養(yǎng)細胞前，使用多聚賴氨酸(TOL)處理細胞培養(yǎng)瓶，具體操作如下用去離子水配制的PBS緩沖液稀釋多聚賴氨酸至O. lmg/ml，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾備用；將21111多聚賴氨酸稀釋液加入細胞培養(yǎng)瓶中，搖動培養(yǎng)瓶使液體鋪滿瓶底，放入 37°C培養(yǎng)箱中孵育6小時后取出；處理過的培養(yǎng)瓶即可用于所述的HEK293細胞系的培養(yǎng)；用于懸浮培養(yǎng)時，可直接將細胞置于未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。進一步的，本發(fā)明還公開了所述的HEK293細胞系在表達外源蛋白中的應用。及所述的HEK293細胞系在培養(yǎng)腺病毒疫苗載體中的應用。本研究采用目前較為成熟的商品化培養(yǎng)基加以漸進替換法馴化HEK293細胞，最大限度地減少了培養(yǎng)條件對細胞的沖擊，對保持細胞株活性、降低細胞株變異有重要作用。 由于無血清培養(yǎng)的HEK293細胞具有懸浮生長的特征，難以快速區(qū)分正常細胞與病變細胞， 因此本實驗采用PDL處理過的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)使無血清細胞貼壁，使細胞貼壁生長，以提高病毒毒價測定數(shù)據(jù)的準確性。目前市售用于無血清培養(yǎng)的293細胞系有多種，如GIBOC 293F、HEK-293N3S。本發(fā)明中馴化無血清細胞的原材料(HEK293細胞系)與以上商品化無血清細胞系相同，通過改進馴化工藝和方法獲得了本細胞系，本發(fā)明的細胞系具有商品化細胞系的穩(wěn)定性和實用性，同時也為后期實驗節(jié)約了資金，降低了疫苗的生產(chǎn)成本。GIBOC 293F所使用的293F細胞是HEK293細胞的一個亞群，而本細胞系是采用HEK293細胞系直接馴化而來；HEK-293 N3S細胞系在國內(nèi)應用較少，多采用灌流培養(yǎng)，而灌流培養(yǎng)對設備和人員要求較高，成本也較大；本研究建立的無血清HEK293細胞系能以貼壁或懸浮狀態(tài)的方式生長，是目前商品化細胞系所沒有達到的。貼壁生長的特性有利于提高腺病毒包裝效率，懸浮生長的特性有利于腺病毒載體疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。由于無血清培養(yǎng)基中不含球蛋白、抗體等干擾腺病毒感染的組分，本研究方案降低了腺病毒的不必要損耗。病變時間由110小時縮短到97小時，同時產(chǎn)率平均提高了 43. 3%，可降低腺病毒疫苗的生產(chǎn)成本，同時為腺病毒疫苗生產(chǎn)和加工提供了便利條件。另外由于高滴度接種腺病毒會引起細胞快速裂解死亡，細胞中大部分未成熟的病毒粒子未能組裝成為具有感染性的完整病毒粒子，這樣可導致毒價下降，影響結果準確性； 因此本研究采用低感染復數(shù)腺病毒接種，在細胞病變初期采用IFA方法測定外源蛋白表達情況，這樣既能避免腺病毒裂解作用對實驗結果的影響，也能直觀的對比腺病毒增殖對數(shù)期的蛋白表達情況。無血清細胞培養(yǎng)技術一般應用于灌注培養(yǎng)、生物反應器等大規(guī)模培養(yǎng)方案，本研究建立的無血清細胞系能夠用于較大規(guī)模培養(yǎng)，并評價所生產(chǎn)的腺病毒載體疫苗。


圖I為完全適應無血清培養(yǎng)的細胞的生長狀態(tài)；A 293SF 細胞；B HEK293 細胞圖2為腺病毒在兩種細胞中分別連續(xù)傳代16次后各代的毒價測定；圖3為不同細胞感染重組腺病毒后的目的蛋白表達情況。A :感染 rAdV-SFV-E2 的 HEK293 細胞；B :感染 rAdV-SFV_E2 的 293SF 細胞；C :未感染的293SF細胞
具體實施例方式下文將參考實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例II材料與方法I. I細胞、抗體、培養(yǎng)基、病毒和其它材料HEK293細胞系由本實驗室保存提供；抗豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體HQ06為本實驗室制備；無血清培養(yǎng)液293 SFM II、DMEM、犢牛血清(FBS)、GlutaMAX -l均購自Life Technology公司；細胞培養(yǎng)耗材均購自Corning公司；多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine, PDL) 購自Sigma公司；rAdV-SFV-E2為攜帶甲病毒復制子載體、表達豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒，具體構建過程記載在申請日為2010年9月30日，申請?zhí)枮?01010297576.0，發(fā)明名稱為“腺病毒/甲病毒復制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應用”的專利文獻中。I. 2培養(yǎng)方法細胞進行適應培養(yǎng)前，采用10% FBS DMEM對其進行培養(yǎng)，細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底面時用含O. 25% EDTA的胰酶消化，1500r/min離心5min收集細胞，用適應液稀釋細胞至 5 X IO5個細胞/mL，進入適應階段。適應過程中采用培養(yǎng)液漸進替換的方法，按照表格中所給出的適應液配比和傳代次數(shù)進行適應培養(yǎng)。處于適應初期的細胞傳代時使用胰酶消化；當適應液中293SFM II的比例達到95%時，停止使用胰酶，改用彎頭吸管將細胞從培養(yǎng)瓶表面吹下。適應過程中，當細胞密度〉1\106個細胞/1^時，以3父105個細胞/1^到5X IO5 個細胞/mL的細胞密度進行傳代培養(yǎng)。完全更換為無血清培養(yǎng)基后，當細胞密度達到IX IO6 個細胞/mL到3 X IO6個細胞/mL時，以5 X IO5個細胞/mL的細胞密度進行傳代培養(yǎng)。待細胞完全適應無血清培養(yǎng)后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II 培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液在37°C、8% CO2培養(yǎng)箱中保存?zhèn)溆谩１緦嶒灢捎梅植竭m應的方法，使HEK293細胞適應無血清培養(yǎng)條件，具體步驟如下首先配制10% FBS DMEM作為正常細胞生長液。然后用10% FBS DMEM和293SFM II混合配制細胞適應液，并用不同配比的適應液培養(yǎng)數(shù)代細胞(表I)。表I適應液的配比及培養(yǎng)代數(shù)
權利要求
1.一株適應無血清培養(yǎng)的HEK293細胞系，命名為293SF，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5824。
2.建立權利要求I所述的HEK293細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)HEK293細胞進行適應培養(yǎng)前，采用10%FBS DMEM對其進行培養(yǎng)，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面時用含O. 25% EDTA的胰酶消化，1500r/min離心5min收集細胞，用適應液稀釋細胞至 5 X IO5個細胞/mL，進入適應階段；(2)適應過程中采用培養(yǎng)液漸進替換的方法，按照以下步驟進行適應培養(yǎng)第I步用含有25%的無血清培養(yǎng)基293 SFM II和75%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基，傳代2次；第2步用含有50%的293 SFM II培養(yǎng)基和50%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基，傳代 2次；第3步用含有75%的293 SFM II培養(yǎng)基和25%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基，傳代 3次；第4步用含有87. 5%的293 SFM II培養(yǎng)基和12. 5%的含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基， 傳代3次；第5步用含有95%的293 SFM II培養(yǎng)基和5%的含10%的牛血清DMEM培養(yǎng)基，根據(jù)細胞狀態(tài)，傳代3 5次；第6步當?shù)?步細胞生長快速、狀態(tài)良好后，更換為100%的293 SFM II培養(yǎng)基傳代， 得到適應無血清培養(yǎng)的HEK293細胞系。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于在適應過程中，當細胞密度>IXlO6個細胞 /mL時，以3X IO5 5X IO5個細胞/mL的細胞密度進行傳代培養(yǎng)；完全更換為100%的293 SFM II培養(yǎng)基后，當細胞密度達到I X IO6 3 X IO6個細胞/mL時，以5 X IO5個細胞/mL的細胞密度進行傳代培養(yǎng)。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于處于適應初期的細胞傳代時使用胰酶消化； 當適應液中293 SFM II的比例達到95%時，停止使用胰酶，改用彎頭吸管將細胞從培養(yǎng)瓶表面吹下。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法還進一步包括待細胞適應無血清培養(yǎng)后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培養(yǎng)液在培養(yǎng)條件為37°C、8% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6.培養(yǎng)權利要求I所述的HEK293細胞系的方法，其特征在于，所述的方法分為貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)兩種；用于貼壁培養(yǎng)時，在培養(yǎng)細胞前，使用多聚賴氨酸處理細胞培養(yǎng)瓶促使適應無血清培養(yǎng)的細胞貼壁，具體操作如下用去離子水配制的PBS緩沖液稀釋多聚賴氨酸至O. lmg/ml, 經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾備用；將21111多聚賴氨酸稀釋液加入細胞培養(yǎng)瓶中，搖動培養(yǎng)瓶使液體鋪滿瓶底，放入37°C培養(yǎng)箱中孵育6小時后取出，處理后的培養(yǎng)瓶即可用于所述的HEK293 細胞系的培養(yǎng)；用于懸浮培養(yǎng)時，直接將細胞置于未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
7.權利要求I所述的HEK293細胞系在表達外源蛋白中的應用。
8.權利要求I所述的HEK293細胞系在培養(yǎng)腺病毒疫苗載體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適應無血清培養(yǎng)的HEK293細胞系及其應用。本發(fā)明采用培養(yǎng)液漸進替換的方法獲得了一株適應無血清培養(yǎng)的HEK293細胞(293SF)，其菌種保藏編號為CGMCC No.5824。經(jīng)檢測293SF細胞具有穩(wěn)定的腺病毒增殖能力與外源蛋白表達能力；平均病變時間為97小時，比HEK293細胞縮短12.9％；毒價達到107.48TCID50/mL，比HEK293細胞提高43.3％；并且隨著代數(shù)的提高穩(wěn)定性良好，連續(xù)傳16次后293SF細胞狀態(tài)與易感性沒有發(fā)生變化。此細胞系可用于腺病毒載體疫苗的無血清生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/00GK102604889SQ20121007158
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權日2012年3月19日
發(fā)明者仇華吉, 孫元 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所