專利名稱：一種直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法。
背景技術(shù)：
害藍(lán)穿系歲電XRadopholussimilis (Cobb) Thorne, 1949)是一種遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，已報道的寄主植物超過250種(O’Bannon，1977)，嚴(yán)重為害香蕉(ifesa spp.)、柑橘(CYtras spp.)、胡椒(/ /" nigrum、、生姜{Zingier o//ici/ a7e)等多種經(jīng)濟(jì)植物和觀賞植物(Luc et al, 1990 ；Richardson et al, 1993 ；Uchida et al,2003 ；Sundararaju etal，1979)，香蕉穿孔線蟲廣泛分布于熱帶和亞熱帶的大部分香蕉產(chǎn)區(qū)和溫帶地區(qū)的溫室中，已報道有該線蟲分布的國家和地區(qū)超過90個(謝輝，2006)，是諸多國家的重要檢疫危險性植物有害生物(Cotton J et al ;0EPP/EPP0，2008)，也是中國禁止進(jìn)境植物檢疫性有害生物(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2007)。香蕉穿孔線蟲最早是由美國線蟲學(xué)家Cobb在1891年從采自斐濟(jì)的香蕉(ifesa sp.)根部發(fā)現(xiàn)的，從19世紀(jì)開始隨著香蕉球莖和蕉苗等種植材料在香蕉種植國家和地區(qū)間傳播，20世紀(jì)60年代該線蟲隨著觀賞植物傳播到法國、比利時等歐洲國家的溫室中，到20世紀(jì)末世界上大多數(shù)香蕉種植區(qū)都有該線蟲分布(Gowen etal, 1990 ；Loof, 1991 ；ffillams et al, 1973 ；Marin et al，1998)。中國臺灣在 1971 年從美國夏威夷引進(jìn)的火鶴花上發(fā)現(xiàn)香蕉穿孔線蟲(羅宗爵等，1973);中國內(nèi)地口岸，從20世紀(jì)80年代開始多次從進(jìn)境香蕉苗和觀賞植物上截獲香蕉穿孔線蟲(林奇力，1986 ;宋紹等，1999 ;陳勇等，2002 ;鐘國強等，1999 ;孫國坤，2004 ;張紹生等，2003 ;李一農(nóng)等，2004 ;趙立榮等，2004 ;鐘國強等，2005 ;鐘國強等，2004 ;黃發(fā)余等，2001a ;黃發(fā)余等，2001b ;黃發(fā)余等，2002 ;蔣寒等，2004)?？梢?，隨著經(jīng)濟(jì)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易迅速發(fā)展，植物種苗等種植材料在國家和地區(qū)間調(diào)運的數(shù)量不斷增加，而其中很多植物是香蕉穿孔線蟲的寄主，從而促使了香蕉穿孔線蟲在世界廣泛的傳播。由于香蕉穿孔線蟲對作物為害所造成的損失非常大，要有效阻止香蕉穿孔線蟲在國家和地區(qū)間的傳播和擴(kuò)散，需要加強對引進(jìn)和調(diào)運的香蕉穿孔線蟲寄主植物及其攜帶土壤或基質(zhì)進(jìn)行檢測，并準(zhǔn)確快速的檢測鑒定可能攜帶的香蕉穿孔線蟲。香蕉苗和觀賞植物是目前攜帶傳播香蕉穿孔線蟲風(fēng)險最大的寄主植物，因此加強對可能攜帶該線蟲的植物種植材料及其粘附的土壤或其他栽培基質(zhì)的檢測至關(guān)重要。但常規(guī)檢測方法要首先對可疑植物攜帶的土壤或者基質(zhì)進(jìn)行分離，在體視顯微鏡下對分離到的線蟲進(jìn)行形態(tài)觀察，然后挑出疑似香蕉穿孔線蟲，再進(jìn)行具體的形態(tài)學(xué)鑒定或者進(jìn)行分子檢測鑒定。這種檢測鑒定方法需要的時間相對較長，并且操作人員需具備專門的植物線蟲鑒定技能和經(jīng)驗才能在體視顯微鏡下檢測鑒定并挑出疑似香蕉穿孔線蟲。本課題組已成功建立了從植物組織中直接檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的分子生物學(xué)技術(shù)(劉一帆等.從混合線蟲樣品和植物組織中直接檢測香蕉穿孔線蟲的ITS-PCR方法.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(19) : 3991-3998)，而運用分子生學(xué)方法直接檢測鑒定土壤或基質(zhì)中香蕉穿孔線蟲的技術(shù)尚未有報道。目前利用分子生物學(xué)方法直接檢測鑒定土壤中線蟲的報道很少。Qiu等(2006)用土壤DNA提取試劑盒和通用引物檢測鑒定出混在土壤中的南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincogniia)、花生根結(jié)線蟲CK arenaria)和爪睡根結(jié)線蟲Ql javanica) ；Yan和Smiley (Guiping Yan etc. , Detection and Discrimination of Pratylenchusneglectus and P. thornei in DNA Extracts from Soil, plant disease, November2008，Volume 92，Number 11:1480-1487)利用自制的DNA抽提緩沖液提取含有落選短體線蟲iPratylenchus fleWeciiAs)和索恩短體線蟲{P. thornei )的土壤DNA,并用其所計設(shè)的特異引物和建立的DNA提取及純化方法，實現(xiàn)了直接檢測鑒定土壤中的這2種線蟲的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在Yan和Smiley研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，得出一種可以直接從土 壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，步驟如下
(I)待檢樣品中DNA提取
稱取待檢樣品，與等重的直徑0. 5 mm玻璃珠一起移至尖底離心管(優(yōu)選規(guī)格為15mL的尖底離心管)中，加入體積比為1:1的磷酸緩沖液和SDS緩沖液，翻轉(zhuǎn)3 4次；
再加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，振蕩后以3 000 rpm的速度離心，上清轉(zhuǎn)移至一 I. 5 mL離心管；
加入預(yù)冷的醋酸鈉，混勻，_20°C靜置5 min，常溫離心，上清轉(zhuǎn)移至另一新I. 5 mL離心
管;
加入冷異丙醇，靜置20min，離心，沉淀加入體積百分含量為70%的乙醇洗滌，離心，棄上清，重復(fù)洗滌一次，離心；
沉淀自然風(fēng)干，加入超純水靜置lOmin，獲得DNA粗提液。(2)使用 Promega 公司的 Wizard DNA Clean-up Systems 試劑盒純化步驟(I)的DNA提取液。(3)PCR檢測以純化的DNA為模板，SEQ ID NO: Γ2所示核苷酸序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出518bp的核苷酸序列，則證明待檢樣品中有香蕉穿孔線蟲。上述步驟(I)主要參照文獻(xiàn)(YanG , Smiley R ff. Detection anddiscrimination of Pratylenchus neglectus and P. thornei in DNA extracts fromsoil. Plant Disease, 2008，92 (11) : 1180-1487)的方法進(jìn)行，但其中部分方法做了修改1)使用與加入待檢樣品等重且直徑為0. 5 mm的玻璃珠(ks I mm)；2)將待檢樣品和玻璃珠放入15 mL尖底離心管中(Ks 2 mL螺帽離心管)；3)離心時，轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 000 rpm(vs 16 000 g)。上述檢測方法步驟(2 )是直接使用商品試劑盒，按試劑盒說明書操作即可。與Yan和Smiley (2008)的方法相比，使用試劑盒操作規(guī)范、易推廣，DNA純化效果好、被檢測靈敏度高。
作為一種優(yōu)選方案，上述檢測方法步驟(3)所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用(東洋紡)Τ0Υ0Β0公司的KOD FX酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該酶具有高擴(kuò)增率和高保真性等特征，擴(kuò)增條帶清晰。上述檢測方法中步驟(3)所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選反應(yīng)體系為25PL :DNA模板5 μ ,2 XPCR buffer 12. 5 PL，2mmol/L 的 dNTP 5 μ , 10 Mmol/L 的 SEQ ID NO: I 引物 O. 75 μ ,10 Mmol/L的SEQ ID N0:2引物0. 75 μ ,ΚΟ FX酶0.5 μ ，用三蒸水補足體積；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2 min，98°C變性10 s，50°C退火30 s，68°C延伸I min，從變性到延伸進(jìn)行35個循環(huán)，然后72°C再充分延伸5 min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明建立的直接檢測鑒定土壤或基質(zhì)中的香蕉穿孔線蟲的技術(shù)，采用了 Yan和Smiley (2008)的DNA提取方法，但DNA純化未采用Yan和Smiley (2008)的方法，而是采用Promega公司的Wizard DNA Clean-up Systems試劑盒,使DNA的純化效果更好、被檢 測靈敏度更高，使用本發(fā)明建立的PCR反應(yīng)體系及程序和本課題組設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實現(xiàn)了直接檢測鑒定出混在土壤或基質(zhì)中的香蕉穿孔線蟲，靈敏度達(dá)到從O. 5 g土壤或基質(zhì)中檢測出I條香蕉穿孔線蟲。本發(fā)明建立的檢測方法可直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的技術(shù)，不需對所采集的待檢測樣品進(jìn)行線蟲分離和在體視顯微鏡進(jìn)行初步的形態(tài)鑒定及挑蟲等過程，直接對土壤或其他基質(zhì)進(jìn)行總DNA的提取和純化，使用香蕉穿孔線蟲ITS區(qū)特異性引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，若O. 5g土壤或其他基質(zhì)中有一條香蕉穿孔線蟲即能擴(kuò)增出約500bp的特異片段，因此本發(fā)明的檢測鑒定方法具有簡便快速、省工和靈敏的優(yōu)點。本發(fā)明的方法使用常規(guī)PCR儀和常規(guī)的PCR方法，是目前最為基礎(chǔ)的常用的分子生物學(xué)儀器和方法，因此實用性強易于推廣。本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)香蕉穿孔線蟲病的早期診斷，防止香蕉穿孔線蟲病突發(fā)成災(zāi)，可以加快口岸檢驗檢疫機(jī)關(guān)對進(jìn)出口植物和基質(zhì)的檢測水平和檢測速度，避免將帶有香蕉穿孔線蟲的植物和基質(zhì)輸入中國，同時加快口岸驗放速度，減少貨物在貨存場存放的時間和費用；提聞我檢驗檢疫機(jī)關(guān)在國際貿(mào)易中的地位和形象。


圖I.用香蕉穿孔線蟲與土壤混合樣品的DNA模板進(jìn)行特異性引物PCR擴(kuò)增，其中a: 1-3. O. 5 g加入50條香蕉穿孔線蟲的土壤樣品，4-6，土壤樣品；b: 1-3. 0.5 g 土壤中加入5條香蕉穿孔線蟲，4-6. O. 5 g 土壤中加入4條香蕉穿孔線蟲；c: 1-3. 0.5 g 土壤中加入3條香蕉穿孔線蟲，4-6. 0.5 g 土壤中加入2條香蕉穿孔線蟲，7-9. 0.5 g 土壤中加入I條香蕉穿孔線蟲；M Marker DL2000。圖2.從發(fā)病巴西蕉根際土壤DNA模板中用特異性引物PCR擴(kuò)增檢測香蕉穿孔線蟲，1-1 5-2 :發(fā)病巴西蕉根際土壤；6_1，6-2 :滅菌土 ；7 :三蒸水；M Marker DL2000。圖3.用香蕉穿孔線蟲與基質(zhì)混合樣品的DNA模板進(jìn)行特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果，a: 1-3.加入50條香蕉穿孔線蟲的O. 5 g基質(zhì)樣品,4-6,土壤樣品；b: 1-3. 0.5 g基質(zhì)中加入5條香蕉穿孔線蟲，4-6. O. 5 g基質(zhì)中加入4條香蕉穿孔線蟲；c: 1-3. 0.5 g基質(zhì)中加入3條香蕉穿孔線蟲，4-6. 0.5 g基質(zhì)中加入2條香蕉穿孔線蟲，7-9. 0.5 g基質(zhì)中加Λ I條香蕉穿孔線蟲；M Marker DL2000。圖4.從發(fā)病孔雀竹芋根際基質(zhì)DNA模板中用特異性引物PCR擴(kuò)增檢測香蕉穿孔線蟲，1-1飛-2.發(fā)病孔雀竹芋根際基質(zhì)；6-1，6-2.滅菌土；7.三蒸水；M :Marker DL2000。
具體實施例方式實施例I從含有香蕉穿孔線蟲的土壤樣品中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料香蕉穿孔線蟲采自紅掌根際土壤的種群，本實驗室在25°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)保存在胡蘿卜愈傷組織上；土壤為采自大田香蕉根際土壤。具體實施步驟如下
1.香蕉穿孔線蟲與土壤混合樣品總DNA的提取
1.1稱取O. 5 g上述大田土壤樣品，裝入15 mL滅菌尖底離心管中，加入等重量的直徑為O. 5 mm的小玻璃珠；
1.2從培養(yǎng)香蕉穿孔線蟲的胡蘿卜愈傷組上分離獲得香蕉穿孔線蟲，在顯微鏡下分別挑取50、5、4、3、2及1條香蕉穿孔線蟲分別放進(jìn)不同的裝有0.5 g 土壤的15 mL尖底離心管中，加入磷酸鹽緩沖液(100 mM NaH2PO4, pH 8. O)和SDS緩沖液(100 mM NaCl, 500 mMTris, pH 8. 0,10% SDS)各 300μ ，翻轉(zhuǎn) 3-4 次；
1.3加入氯仿異戊醇(體積比24:1) 400 μ ，用漩渦振蕩器以中速振蕩30 s，3 000rpm離心5 min,將上清(小于600 μ )轉(zhuǎn)移至I. 5 mL離心管中；
1.4加入300 PL預(yù)冷的NaOAc (3Μ，ρΗ5. 2)，上下顛倒混勻，置于_20°C冷凍箱中放置5 min,取出后以12 OOOrpm離心5 min,將上清(不超過650 KL)轉(zhuǎn)移至一新I. 5 mL尖底離心管中；
1.5加入600 μ 冷的異丙醇，室溫放置20 min用于沉淀DNA，然后12 OOOrpm離心5min,棄上清液，加入700 mL體積百分含量為70%的無水乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)，充分洗滌DNA沉淀，12 000 rpm離心5 min,再棄上清,重復(fù)洗漆一次；
1.6將DNA沉淀置于室溫，待其自然風(fēng)干后，加入100 PL超純水，室溫放置10 min，使DNA充分溶于水中獲得DNA粗提液，可直接進(jìn)行下一步實驗，也可放_20°C保存?zhèn)溆谩?.香蕉穿孔線蟲與土壤DNA粗提液的純化
2.I 先混勻純化試劑盒(Wizard DNA Clean-up Systems, Promega)中裝有溶液 Resin的小瓶(若有沉淀，37°C水浴10 min)，取I mL Resin到保存的100 μ L DNA粗提液中，顛倒混勻；
2.2去掉10 mL注射器針頭，與試劑盒中的純化柱擰緊在一起，加入步驟(I)的混合液到注射器管中，過濾混合液；
2.3加入2 mL 80%異丙醇到注射器管中，再次過濾；
2.4將純化柱放入I. 5 mL離心管中，12 000 rpm離心2 min ；
2.5將純化柱轉(zhuǎn)移至另一新I. 5 mL離心管中，加入50 μ L在65°C水中預(yù)熱的TE緩沖液(10 mM Tris, I mM EDTA,pH 8. O),靜置 I min, 12 000 rpm 離心 20 s,收集離心管中的DNA，得到純化的DNA，可直接用于下一步實驗或_20°C保存?zhèn)溆谩?從香蕉穿孔線蟲與土壤混合樣品純化的DNA中特異性檢測香蕉穿孔線蟲DNA片段3.I合成已設(shè)計的香蕉穿孔線蟲ITS區(qū)特異引物
上游引物 PF (5，-CTACAAATGTGACGCGAA-3，SEQ ID N0:1),
下游引物 PR (5，-CMTCTGC ACAA TGAACATAC-3，SEQ ID N0:2)；
3.2香蕉穿孔線蟲特異性擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系和程序如下
在200 μ L PCR管中，配置25 μ L反應(yīng) 體系取步驟2. 5 DNA模板5 μ L,2XPCRbuffer (TOYOBO 公司)12.5 μ L, dNTP (2 mM each) 5 yL (TOYOBO)，上游引物 PF(10 μ Μ) O. 75 μ L，下游引物 PR (10 μ Μ) O. 75 μ L，KOD FX 酶(1U / μ L) O. 5 μ L(TOYOBO)，其余用三蒸水補足。在Bio-rad S1000 PCR儀上設(shè)定反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2 min，98°C變性10 s,50°C退火30 s，68°C延伸I min，從變性到延伸進(jìn)行35個循環(huán)，然后72°C再充分延伸5 min。把各PCR反應(yīng)管放入PCR儀內(nèi)，蓋好蓋子，按設(shè)定程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3. 3瓊脂糖凝膠電泳檢測
待3. 2 PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3 μ L產(chǎn)物在已經(jīng)加入Goldview DNA燃料的1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓為121 V，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察、拍照和記錄，若出現(xiàn)500 bp的特異性片段說明有香蕉穿孔線蟲的存在(見圖I)。實施例2直接從發(fā)生香蕉穿孔線蟲病的香蕉根際土壤中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料本實驗室在溫室大棚內(nèi)盆栽接種香蕉穿孔線蟲并且發(fā)病的巴西蕉根際土壤。具體實施步驟如下
取發(fā)病巴西蕉根際土壤約50(Tl 000g,充分混勻,稱取5份0. 5 g 土壤(編號1-5),此夕卜，再稱取0.5 g滅菌土(編號6)，分別放入15 mL滅菌離心管中，加入等重量的直徑為0.5 _的小玻璃珠；其他步驟同實施例1，檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，感染香蕉穿孔線蟲的巴西蕉根際土壤DNA經(jīng)過PCR檢測有目的片段出現(xiàn)，而沒有香蕉穿孔線蟲的土壤DNA則未有檢測到目的片段。實施例3從香蕉穿孔線蟲和基質(zhì)混合的樣品中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料香蕉穿孔線蟲的準(zhǔn)備和獲得同實施例1，基質(zhì)購自廣州芳村綠源園藝植物材料場。具體實施步驟如下
稱取0. 5g基質(zhì)，裝入15mL滅菌離心管中，加入等重量的直徑為0. 5mm的小玻璃珠。其他步驟同實施例I。檢測結(jié)果見圖3。實施例4直接從發(fā)生香蕉穿孔線蟲病的孔雀竹芋根際基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料經(jīng)鑒定發(fā)生香蕉穿孔病的孔雀竹芋根際土壤，采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉種植室。具體實施步驟如下
取發(fā)病孔雀竹芋根際基質(zhì)土，充分混勻，稱取5份，每份0. 5g基質(zhì)土，編號1-5，此外，再稱取0. 5g滅菌基質(zhì)土，編號6，6份樣品分別放入15mL滅菌離心管中，加入等重量的直徑為0. 5mm的小玻璃珠。其他后續(xù)步驟同實施例I。檢測結(jié)果電泳圖見圖4，由該圖可知，感染香蕉穿孔線蟲的孔雀竹芋根際基質(zhì)土 DNA經(jīng)過PCR檢測有目的片段出現(xiàn)，而沒有香蕉穿孔線蟲的基質(zhì)土 DNA則未有檢測到目的片段。以上實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受上述實施例的任何限制，其他的任何不背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化 等，均應(yīng)視為本發(fā)明等效的置換方式，包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于步驟如下 (1)待檢樣品中DNA提取 稱取待檢樣品，與等重的直徑O. 5mm玻璃珠一起移至尖底離心管中，加入體積比為I: I的磷酸緩沖液和SDS緩沖液，翻轉(zhuǎn)3 4次； 再加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，振蕩后以3 OOO rpm的速度離心，上清轉(zhuǎn)移至一 I. 5 mL離心管； 加入預(yù)冷的醋酸鈉，混勻，_20°C靜置5min，常溫離心，上清轉(zhuǎn)移至另一新I. 5 mL離心管; 加入冷異丙醇，靜置20min，離心，沉淀加入體積百分含量為70%的乙醇洗滌，離心，棄上清，重復(fù)洗滌一次，離心； 沉淀自然風(fēng)干，加入超純水靜置lOmin，獲得DNA粗提液； (2)使用Promega 公司的 Wizard DNA Clean-up Systems 試劑盒純化步驟(I)的 DNA粗提液； (3)PCR檢測以純化的DNA為模板，SEQ ID NO: I 2所示核苷酸序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出518bp的核苷酸序列，則證明待檢樣品中有香蕉穿孔線蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于步驟(3)所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的酶為TOYOBO公司的KOD FX酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于步驟(3)所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25PL :DNA模板5 PL，2XPCR buffer.12. 5 PL，2mmol/L 的 dNTP 5 μ , 10 MmoI/L 的 SEQ ID NO: I 引物 0.75 μ , 10 MmoI/L 的SEQ ID NO:2引物0. 75 μ , KOD FX酶O. 5 μ ，用三蒸水補足體積；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2 min，98°C變性10 s，50°C退火30 s，68°C延伸I min，從變性到延伸進(jìn)行35個循環(huán)，然后72°C再充分延伸5 min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種直接從土壤或其他基質(zhì)中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，是先提取待檢測樣品中的DNA，經(jīng)過Promega公司的WizardDNAClean-upSystems試劑盒純化后作為模板，以SEQ ID NO:1～2所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠擴(kuò)增出518bp的目的條帶，則證明待檢測樣品中含有香蕉穿孔線蟲。該方法適用于香蕉栽培土壤或其他基質(zhì)的檢測，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，適用范圍廣，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK102703582SQ20121007201
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者劉一帆, 徐春玲, 李冬麗, 李靜, 謝輝, 趙傳波 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)