專利名稱：一種非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法。
背景技術(shù)：
黃花烏頭是主產(chǎn)于我國(guó)北方的藥用植物，其塊根稱為關(guān)白附，屬常用中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明關(guān)白附中主要活性成分為一類C2tl赫替新型二萜生物堿，其中鹽酸關(guān)附甲素已開發(fā)成我國(guó)的原創(chuàng)一類新藥，是一種療效顯著的新型抗心律失常藥物。關(guān)附庚素是關(guān)白附中的主要活性成分之，是關(guān)附甲素的單乙酯產(chǎn)物，其對(duì)氯仿誘發(fā)的小鼠室顫，烏頭堿誘發(fā)的大鼠室性心律失常有明顯的對(duì)抗作用，其抗心律失常作用優(yōu)于關(guān)附甲素。由于關(guān)附庚素的自然來源十分有限，限制了其在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。關(guān)附胺醇也是關(guān)白附中的主要化學(xué)成分之一，其含量在藥材中數(shù)倍于關(guān)附甲素與關(guān)附庚素。由于關(guān)附胺醇沒有抗心律失常等藥理活性，在關(guān)附甲素的提取過程中獲得的大量副產(chǎn)品關(guān)附胺醇被棄之不用，造成了極大的資源浪費(fèi)。為了有效利用植物資源并提高天然微量活性成分關(guān)附庚素的來源，我們發(fā)明了一種非水相體系中生物轉(zhuǎn)化關(guān)附胺醇制備關(guān)附庚素的方法。該方法具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好、反應(yīng)具有高度選擇性和可控性、反應(yīng)過程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品易于分離、催化劑脂肪酶可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，具有積極的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備微量活性天然產(chǎn)物關(guān)附庚素的非水相酶催化方法，它是一種在非水相有機(jī)溶劑中酶法催化關(guān)附胺醇生產(chǎn)關(guān)附庚素的技術(shù)，該技術(shù)具有高度的立體選擇性，操作簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境友好。本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)I)將關(guān)附胺醇、乙?；w在非水相介質(zhì)中混合，加入分子篩去除微量水分，然后加入脂肪酶催化反應(yīng)2-48小時(shí)；2)將步驟I所得反應(yīng)液，過濾去除脂肪酶和未溶解的關(guān)附胺醇，回收的脂肪酶和底物可重復(fù)利用，所得濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)去除溶劑；3)將步驟2所得剩余物以硅膠柱層析分離，結(jié)晶即可獲得產(chǎn)品關(guān)附庚素；所述關(guān)附胺醇與?；w的摩爾比為I : 1-15，脂肪酶的用量為關(guān)附胺醇重量的
O.1-5%,分子篩用量為O. l_5g/L，攪拌或搖床振蕩速度50-200rpm，反應(yīng)時(shí)間2_48小時(shí)，反應(yīng)溫度20-60°C。所述的非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征為所述的有機(jī)相溶劑是甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、正己烷、環(huán)己酮、乙酸乙烯酯、環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四氫呋喃、吡唳、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、叔丁醇中的其中一種物質(zhì)或幾種物質(zhì)的混合物。
所述的非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征為所述的脂肪酶催化劑為 Candida antarctica lipase B、Porcine pancreas、Rhizopus niveus、Asperyillusniger、Penicillium camemberti、Mucor javanicus>Burkholderia cepacia 其中一種或幾種物質(zhì)的混合物。所述的非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征為酰基供體為乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯其中一種或幾種物質(zhì)的混合物。本發(fā)明的有益效果是I.本發(fā)明將沒有抗心律失常等生物活性的天然產(chǎn)物關(guān)附胺醇轉(zhuǎn)化為具有良好抗心律失常活性的關(guān)附庚素，充分利用并保護(hù)了自然資源。開拓了天然微量活性成分關(guān)附庚素的新來源。2.酶促催化立體選擇性好，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。3.催化及脂肪酶可以重復(fù)利用，工藝成本低廉。


圖I脂肪酶在非水介質(zhì)中選擇性催化關(guān)附胺醇合成關(guān)附庚素
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例的制備方法僅僅用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明催化制備關(guān)附庚素的構(gòu)思前提下，類似的制備方法都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I :取關(guān)附胺醇60微摩爾加入到50毫升的磨口具塞三角瓶中，再將20毫升甲醇、O. 6毫升乙酸乙烯酯、30毫克分子篩、40毫克Candida antarctica lipase B酶加入到該磨口具塞三角瓶中，瓶口密封后放置到恒溫?fù)u床中，搖床轉(zhuǎn)數(shù)50轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度20°C，反應(yīng)時(shí)間15小時(shí)，反應(yīng)完成后過濾除酶，濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇。HPLC檢測(cè)關(guān)附胺醇轉(zhuǎn)化生成關(guān)附庚素產(chǎn)率為32%。實(shí)施例2:取關(guān)附胺醇30微摩爾加入到50毫升的磨口具塞三角瓶中，再將20毫升環(huán)己酮、
O.3毫升丙酸乙烯酯、40毫克分子篩和80毫克Rhizopus niveus酶加入到該磨口具塞三角瓶中，將瓶口密封后放置到恒溫?fù)u床中，搖床轉(zhuǎn)數(shù)150轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度35 V，反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)，反應(yīng)完成后過濾除酶，濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去環(huán)己酮。HPLC檢測(cè)關(guān)附胺醇轉(zhuǎn)化生成關(guān)附庚素產(chǎn)率為69%。實(shí)施例3 取關(guān)附胺醇60微摩爾加入到50毫升的磨口具塞三角瓶中，再將20毫升正丁醇、50毫克分子篩、O. 9毫升乙酸乙烯酯和100毫克Asperyillus niger酶加入到該磨口具塞三角瓶中，將瓶口密封后放置到恒溫?fù)u床中，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度50°C，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，反應(yīng)完成后過濾除酶，濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇。HPLC檢測(cè)關(guān)附胺醇轉(zhuǎn)化生成關(guān)附庚素產(chǎn)率為68%。
實(shí)施例4 取關(guān)附胺醇180微摩爾加入到50毫升的磨口具塞三角瓶中，再將20毫升DMS0、40毫克分子篩、I毫升乙酸乙烯酯和100毫克Pseudomonas fIvoreseens酶加入到該磨口具塞三角瓶中，將瓶口密封后放置到恒溫?fù)u床中，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度30°C，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，反應(yīng)完 成后過濾除酶，濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙烯酯。HPLC檢測(cè)關(guān)附胺醇轉(zhuǎn)化生成關(guān)附庚素產(chǎn)率為43%。實(shí)施例5 取關(guān)附胺醇180微摩爾加入到50毫升的磨口具塞三角瓶中，再將20毫升丙酮甲醇為I : I的溶劑、10毫升丁酸乙烯酯和100毫克Pseudomonas flvoreseens酶加入到該磨口具塞三角瓶中，將瓶口密封后放置到恒溫?fù)u床中，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度30°C，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，反應(yīng)完成后過濾除酶，濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙烯酯。HPLC檢測(cè)關(guān)附胺醇轉(zhuǎn)化生成關(guān)附庚素產(chǎn)率為33%。
權(quán)利要求
1.一種非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征在于所述非水相酶促合成關(guān)附庚素的方法包括以下步驟 1)將關(guān)附胺醇、乙酰基供體在非水相介質(zhì)中混合，加入分子篩去除微量水分，然后加入脂肪酶催化反應(yīng)2-48小時(shí)； 2)將步驟I所得反應(yīng)液，過濾去除脂肪酶和未溶解的關(guān)附胺醇，回收的脂肪酶和底物可重復(fù)利用，所得濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)去除溶劑； 3)將步驟2所得剩余物以硅膠柱層析分離，結(jié)晶即可獲得產(chǎn)品關(guān)附庚素； 所述關(guān)附胺醇與?；w的摩爾比為I : 1-15，脂肪酶的用量為關(guān)附胺醇重量的O.1-5%,分子篩用量為O. l_5g/L，攪拌或搖床振蕩速度50-200rpm，反應(yīng)時(shí)間2_48小時(shí)，反應(yīng)溫度20-60°C。
2.如權(quán)利要求I所述的非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征為所述的有機(jī)相溶劑是甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、正己烷、環(huán)己酮、乙酸乙烯酯、環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四氫呋喃、吡唳、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、叔丁醇中的其中一種物質(zhì)或幾種物質(zhì)的混合物。
3.如權(quán)利要求I所述的非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征為所述的月旨肪酶催化劑為 Candida antarctica lipase B、Porcine pancreas、Rhizopus niveus、Asperyillus niger、Penicillium camemberti、Mucor javanicus、Burkholderia cepacia其中一種或幾種物質(zhì)的混合物。
4.如權(quán)利要求I所述的非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，其特征為?；w為乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯其中一種或幾種物質(zhì)的混合物。
全文摘要
一種非水相體系中生物轉(zhuǎn)化制備關(guān)附庚素的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明為在沸水想體系中采用脂肪酶催化生產(chǎn)關(guān)附庚素的方法，包括如下步驟1)以分子篩除去非水反應(yīng)介質(zhì)中所含的微量的水份，將反應(yīng)底物關(guān)附胺醇、酰基供體在非水介質(zhì)中混合，然后加入脂肪酶催化反應(yīng)2-48小時(shí)；2)將步驟1所得反應(yīng)液過濾去除脂肪酶，所得濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)去除溶劑；3)將步驟2所得剩余物以硅膠柱層析分離，獲得產(chǎn)品關(guān)附庚素。本發(fā)明為非水相酶促催化合成關(guān)附庚素，具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好、反應(yīng)具有高度選擇性和可控性、反應(yīng)過程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品易于分離等優(yōu)點(diǎn)，具有積極的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102618596SQ201210072970
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者余伯陽, 劉吉華, 劉靜涵, 夏燁 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)