專利名稱：一種鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒及檢測方法，屬于動物醫(yī)學動物疫病分子生物學診斷技術領域。
背景技術：
豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，迄今仍是我國最重要的豬傳染病之一，每年引起豬只發(fā)病死亡的損失巨大，因此世界動物衛(wèi)生組織(World organization for animal health,OIE)將其列為16種A類法定傳染病之一，我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類傳染病。豬瘟是養(yǎng)豬業(yè)的一種毀滅性傳染病，幾乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外)，死亡率高達80% 90%。1954年，我國學者周泰沖等通過將CSFV強毒Shimen株連續(xù)在兔體傳代數(shù)百代后致弱，成功研制出了世界公認有良好免疫效果的豬瘟兔化弱毒疫苗，至今已應用了半個世紀，對我國豬瘟疫情的控制做出了積極貢獻。但是，弱毒疫苗的使用對豬瘟的診斷造成了很大干擾。鑒于以上弊端，西方發(fā)達國家對豬瘟采取不免疫，感染豬撲殺的策略進行凈化。但我國目前對撲殺的損失還難以承受，主要依賴于疫苗接種進行豬瘟的控制。我國使用的診斷豬瘟的血清學方法有瓊脂擴散試驗、熒光抗體試驗、間接血凝試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫膠體金技術，分子生物學方法有RT-PCR技術和核酸探針技術。現(xiàn)有的血清學檢測方法大多數(shù)是檢測抗體水平，在疫苗免疫效果的評價上有重要作用，但在豬瘟的定性診斷上尚需要依賴病原的檢測。在病原檢測上常用熒光抗體試驗和RT-PCR技術。由于我國多年一直采用疫苗預防為主的豬瘟防控策略，豬群疫苗免疫覆蓋率高，導致疫苗毒株在豬群中廣泛存在。常規(guī)熒光抗體試驗和RT-PCR技術不能區(qū)分疫苗毒株和豬瘟流行毒株，在診斷結(jié)果的判定上存在困難。目前，在國內(nèi)有學者嘗試建立相關的鑒別診斷方法，如趙耕等建立了RT-PCR和酶切的方法區(qū)分豬瘟強毒與疫苗弱毒，但該技術無法確診早期感染；趙建軍等建立了鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的復合熒光定量RT-PCR檢測方法，但成本較高，目前只應用于實驗室檢測。李艷等建立了鑒別豬瘟強毒和弱毒的RT-nPCR檢測方法，強毒出現(xiàn)I條 343bp的特異條帶,弱毒出現(xiàn)I條447bp的特異條帶,但是由于2條片段大小相近,在一次反應中不易做出準確判斷。李安等建立的鑒別方法擴增的極限為6. 5X 10_2pg ·Ι^，靈敏度較低，由于豬瘟病毒在組織病料中的拷貝數(shù)較低，靈敏度不夠可能會造成用組織病料診斷時的漏診。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的是目的在于提供一種用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒，該試劑盒操作簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高、特異性好的區(qū)分豬瘟流行毒株與疫苗毒株的診斷試劑盒。實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方案是一種用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴混合液、二擴混合液、陰性對照和陽性對照組成；所述反轉(zhuǎn)錄混合液由DEPC處理滅菌水、2. 5m mo I · L_1dNTP>5 X AMVBuffer> 25 μ mo I · L_1S2下游引物、5U/ μ L AMV反轉(zhuǎn)錄酶和40U/ μ L HPR I RNA酶抑制劑組成；每個反應體積比為10 4 4 I O. 5 O. 5，共計20 μ L，50個反應共計1000 μ L，裝成 I管；所述一擴混合液由滅菌三蒸水、10XPCRBuffer、2. 5m mo I · L_1dNTP> 25 μ mo I .L-1Sl上游引物、25 μ mol · 1742下游引物、5U/μ L rTaq DNA聚合酶組成，每個反應體積比為17 2. 5 2 0. 5 0. 5 0. 5，共計23 μ L，50個反應共計1150 μ L，裝成 I管；所述二擴混合液由滅菌三蒸水、10XPCR Buffer、2. 5m mo I · L_1dNTP> 25 μ mo I 上游引物、25μ θ1 · L-1S4 下游引物、25 μ mo I · L-1S5 下游引物、5U/μ LrTaq DNA聚合酶組成，每個反應體積比為16. 5 2. 5 2 0. 5 0. 5 0. 5，共計23 μ L，50 個反應共計1150 μ L，裝成I管； 所述陰性對照為正常細胞培養(yǎng)上清液，陽性對照為HCLV株細胞培養(yǎng)液；所述的引物SI 序列為5 ’ -GACACTAGYGCAGGCAAYA-3 ’所述的引物S2 序列為5’ -AGTGGGTTCCAGGARTAC-3’所述的引物S3 序列為5’ -CCACGGGGGTGCCCTACAA-3’所述的引物S4 序列為5’ -CCTGGCATGTAACTA-3’所述的引物S5 序列為5’ -CTCTCGGTGAGAAATTTG-3’。本發(fā)明還有一個目的是提供上述試劑盒鑒別檢測豬瘟流行毒株和疫苗毒株的方法，包括以下步驟I) TRIzol Reagent試劑法提取待檢樣品總RNA，空氣中自然干燥；2)取反轉(zhuǎn)錄混合液20yL，充分吹吸溶解總RNA，42°C水浴反轉(zhuǎn)錄90min，取出置-20°C保存?zhèn)溆茫?)取一擴混合液23 μ L，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 45s，54。。50s, 72°C 50s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ；4)取二擴混合液23 μ L，加入一擴產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 30s,54°C 30s, 72°C 40s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ；5) IOg · Γ1瓊脂糖凝膠中電泳；6)結(jié)果分析陰性對照不出條帶，陽性對照出261bp、157bp兩個條帶，說明對照成立，樣品中出現(xiàn)261bp —個條帶，即為豬瘟流行毒株感染，樣品出261bp、157bp兩個條帶，即
為疫苗毒株。試劑盒的驗證性試驗①特異性試驗使用本發(fā)明的診斷試劑盒，提取HCLV、Shimen, SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV 和 PRRSV總RNA(SXYL2006、GX54和SD2002為本實驗室分離CSFV流行毒株，并進行了全基因測序)，按操作方法進行反轉(zhuǎn)錄-套式復合PCR ;按照DNAzol Reagent試劑說明提取PCV-2、 PRV、PPV等DNA病毒的DNA作為模板，用試劑盒的一擴混合液和二擴混合液進行套式復合PCR，擴增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示，HCLV株出現(xiàn)261bp、157bp兩個條帶，Shimen, SXYL2006、GX54 和 SD2002 出現(xiàn) 26 Ibp —個條帶，BVDV, PRRSV, PCV-2、PRV 和 PPV 均沒有出現(xiàn)條帶(見附圖I)。回收各陽性樣本的條帶，純化后連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細胞，取PCR鑒定為陽性得菌液，提取質(zhì)粒進行測序，將測得的序列與所用毒株基因序列進行比較，發(fā)現(xiàn)序列完全一致。結(jié)果證實本試劑盒及檢測方法具有很高的特異性，能準確擴增CSFV基因片段，并能直觀區(qū)分疫苗株和流行毒株。②靈敏度試驗使用本發(fā)明提供的診斷試劑盒，提取HCLV株總RNA，紫外分光光度計測定濃度為3. 4pg · L-1,按照10倍濃度梯度稀釋至10_9，用試劑盒提供的一擴混合液和二擴混合液進行套式復合PCR，擴增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒能檢測的極限為
3.4X 10-7pg · L—1，提示本方法靈敏度高(見附圖2)。③穩(wěn)定性試驗本發(fā)明提供的診斷試劑盒保存條件為-20°C，每月I次用HCLV、Shimen, SXYL2006 及對照進行檢測試驗，連續(xù)檢測6個月，檢測試劑盒存放的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，6個月內(nèi)試劑盒檢測結(jié)果完全一致，說明試劑盒有良好的穩(wěn)定性。④田間試驗采集了陜西省臨床疑似豬瘟組織病料116份，用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法進行診斷，同時以RT-nested PCR方法進行平行檢測試驗。結(jié)果本發(fā)明的檢出陽性率為 32% (37/116)，RT-nested PCR方法檢出陽性率為28 % (33/116)，兩種方法符合率96% (112/116)。提示兩種方法符合率高，且本發(fā)明靈敏度更高(見附圖3)。本發(fā)明將反轉(zhuǎn)錄步驟和第一次PCR擴增分開進行，目的是保證反應充分有效，采用套式PCR擴增，且目的片段較小，保證了反應的高靈敏度。檢測總時間控制在4小時左右，達到了快速檢測的目的。本發(fā)明能徹底解決豬瘟流行毒株和疫苗毒株鑒別診斷問題，快速、靈敏，特異性好，非常適合豬瘟疫情的大面積快速檢測普查，適用于各實驗室、動物疫病預防控制中心以及條件具備的大中型養(yǎng)殖場。


圖I為本發(fā)明試劑盒及方法特異性試驗電泳中M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標準，I為HCLV疫苗毒株，2為Shimen毒株，3為 SXYL2006毒株，4為GX54毒株，5為SD2002毒株，6為BVDV毒株，7為PRRSV毒株，8為PCV-2 毒株，9為PRV毒株，10為PPV毒株。圖2為本發(fā)明試劑盒及方法靈敏度試驗電泳中M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標準，I 9為HCLV株總RNA梯度稀釋，濃度范圍為 3. 4 X KT1Pg · L-1 3. 4 X l(T9pg · L'圖3為本發(fā)明試劑盒及方法對部分臨床樣品檢測結(jié)果圖中M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標準，Pl為陽性對照，P2為Shimen毒株，N為陰性對照，I 20為部分組織病料，1、2、5、6、8、13、16、17為檢測陰性結(jié)果，3、4、7、9、10、11、12、14、15、18、19、20為豬瘟流行毒株感染陽性結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施案例對本發(fā)明進行詳細敘述。實施例II.引物的設計與制備參考GenBank上公布的30多個CSFV、BVDV全基因組序列，結(jié)合本課題組數(shù)年研究測定的CSFV全基因序列，用DNAStar生物軟件綜合分析比對，篩選出了 CSFV疫苗毒株和其他流行毒株以及BVDV的差異位點，針對NS5B基因差異位點設計了 5條引物SI、S2、S3、
S4 和 S5,引物SI、S2、S3、S4和S5的序列如下
SI 5，-GACACTAGYGCAGGCAAYA-3，
S2 5，-AGTGGGTTCCAGGARTAC-3，
S3 5，-CCACGGGGGTGCCCTACAA-3’
S4 5，-CCTGGCATGTAACTA-3’
S5 5’ -CTCTCGGTGAGAAATTTG-3’
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。2.陰、陽性對照的制備陰性對照為本實驗室培養(yǎng)的正常PK-15細胞上清液，陽性對照為HCLV疫苗株的 PK-15細胞培養(yǎng)液。3.試劑盒的制備本試劑盒由以下組分組成①反轉(zhuǎn)錄混合液由DEPC 處理滅菌水、dNTP(2. 5m mo I Γ1)、5XAMVBuffer、S2 下游引物(25 μ mo I · L-1)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/ μ L)和HPR I RNA酶抑制劑(40U/ μ L)組成。 每個反應體積比為10 4 4 I O. 5 O. 5，共計20 μ L，50個反應共計1000 μ L，裝
成I管。②一擴混合液由超純水、10XPCRBuffer、dNTP (2. 5m mo I · Γ1)、SI 上游引物 (25 μ mo I · L-1)、S2 下游引物(25 μ mo I · Γ1)、rTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)組成，每個反應體積比為17 2. 5 2 0. 5 0. 5 0. 5，共計23 μ L，50個反應共計1150yL，裝成I管。③二擴混合液:由超純水、10XPCRBuffer、dNTP (2. 5m mo I · Γ1)、S3 上游引物 (25 μ mo I · L-1)、S4 下游引物(25 μ mo I · L-1)、S5 下游引物(25 μ mo I · L-1)、rTaq DNA 聚合酶(5U/μ L)組成，每個反應體積比為16. 5 2. 5 2 0. 5 0. 5 0. 5，共計23 μ L，50 個反應共計1150 μ L，裝成I管。④陰性對照為正常ΡΚ-15細胞培養(yǎng)上清液，每個反應需對照250 μ L，50個反應共計12500 μ L,分裝10管，每管1250 μ L。⑤陽性對照為HCLV株ΡΚ-15細胞培養(yǎng)液，每個反應需對照250 μ L，50個反應共計12500 μ L,分裝10管，每管1250 μ L。本發(fā)明試劑盒保存條件為_20°C。實施例2
I.引物的設計與制備同實施例I。2.組織病料樣品的處理與RNA提?、偃∫伤曝i瘟組織病料3 5g，剪碎成糊狀，加5倍無菌PBS，用組織研磨器充分研磨，收集懸液，4°C、12000r/min離心15min,取上清液250 μ L加入到無菌無RNA酶的EP 管，同時做試劑盒中提供的陰、陽性對照，給以上各管中加入750 μ L TRIzol Reagent，顛倒混勻后于4°C靜置5min。②加入200 μ L預冷的氯仿(4°C保存)，充分振蕩至乳化均勻，4°C靜置15min。③于4°C、12000r/min離心15min，取出EP管，輕輕吸取上層水相約450 μ L轉(zhuǎn)移入
另一 EP管。④加入等體積的冰冷異丙醇(_20°C保存)，顛倒混勻后置_20°C過夜，充分沉淀核酸。⑤于4°C、12000r/min離心IOmin,取出EP管，棄去上清液,加入ImL冰冷的75% 乙醇(_20°C保存)，顛倒數(shù)次洗滌核酸。⑥于4°C、12000r/min離心5min，取出EP管，棄去上清液，倒置EP管干燥核酸。3.用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測CSFV①吸取反轉(zhuǎn)錄混合液20 μ L，反復吹打離心管管底核酸，充分溶解后瞬間離心，置于42°C水浴反轉(zhuǎn)錄90min，取出備用；②吸取一擴混合液23 μ L，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為95°C預變性5min，94°C 45s, 54°C 50s, 72°C 50s共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸 IOmin ；③吸取二擴混合液23 μ L，加入一擴產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 30s，54。。30s, 72°C 40s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ； 即得到擴增產(chǎn)物。實施例3I.引物的設計與制備同實施例I。2.血清樣品的處理與RNA提?、偃》蛛x得到待檢豬血清250 μ L加入到無菌無RNA酶的EP管，同時做試劑盒中提供的陰、陽性對照，給以上各管中加入750 μ L TRIzol Reagent，顛倒混勻后于4°C靜置 5min。②加入200 μ L預冷的氯仿(4°C保存)，充分振蕩至乳化均勻，4°C靜置15min。③于4°C、12000r/min離心15min，取出EP管，輕輕吸取上層水相約450 μ L轉(zhuǎn)移入
另一 EP管。④加入等體積的冰冷異丙醇(_20°C保存)，顛倒混勻后置_20°C過夜，充分沉淀核酸。⑤于4°C、12000r/min離心lOmin，取出EP管，棄去上清液，加入ImL冰冷的75% 乙醇(_20°C保存)，顛倒數(shù)次洗滌核酸。⑥于4°C、12000r/min離心5min，取出EP管，棄去上清液，倒置EP管干燥核酸。
3.用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測CSFV①吸取反轉(zhuǎn)錄混合液20 μ L，反復吹打離心管管底核酸，充分溶解后瞬間離心，置于42°C水浴反轉(zhuǎn)錄90min，取出備用；②吸取一擴混合液23 μ L，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為95°C預變性5min，94°C 45s, 54°C 50s, 72°C 50s共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸 IOmin ；③吸取二擴混合液23 μ L，加入一擴產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 30s，54。。30s, 72°C 40s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ； 即得到擴增產(chǎn)物。實施例4I.引物的設計與制備同實施例I。2.全血樣品的處理與RNA提?、偃〈龣z豬全血250 μ L加入到無菌無RNA酶的EP管，同時做試劑盒中提供的陰、 陽性對照，給以上各管中加入750 μ L TRIzol Reagent,顛倒混勻后于4°C靜置5min。②加入200 μ L預冷的氯仿(4°C保存)，充分振蕩至乳化均勻，4°C靜置15min。③于4°C、12000r/min離心15min，取出EP管，輕輕吸取上層水相約450 μ L轉(zhuǎn)移入
另一 EP管。④加入等體積的冰冷異丙醇(_20°C保存)，顛倒混勻后置_20°C過夜，充分沉淀核酸。⑤于4°C、12000r/min離心IOmin,取出EP管，棄去上清液,加入ImL冰冷的75% 乙醇(_20°C保存)，顛倒數(shù)次洗滌核酸。⑥于4°C、12000r/min離心5min，取出EP管，棄去上清液，倒置EP管干燥核酸。3.用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測CSFV①吸取反轉(zhuǎn)錄混合液20 μ L，反復吹打離心管管底核酸，充分溶解后瞬間離心，置于42°C水浴反轉(zhuǎn)錄90min，取出備用；②吸取一擴混合液23 μ L，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為95°C預變性5min，94°C 45s, 54°C 50s, 72°C 50s共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸 IOmin ；③吸取二擴混合液23 μ L，加入一擴產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 30s，54。。30s, 72°C 40s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ； 即得到擴增產(chǎn)物。結(jié)果判定I.稱取I. Og瓊脂糖，加入IOOmL I XTAE緩沖液中，微波爐中加熱融化，加入 5 μ L(100mg/mL)溴化乙錠，混勻，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為5mm，待冷卻凝固后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入IXTAE緩沖液淹沒膠面；2.分別取5 μ L上述實施例2 4所得PCR擴增產(chǎn)物和上樣緩沖液混勻，加入加樣孔中，同時加5 μ L DL2000 DNA分子量標準；3.電壓 80V 100V,或電流 40mA 50mA,電泳 30min ；
4.取出凝膠，置入紫外分析儀中觀察，或置入凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相；5.以DL2000 DNA分子質(zhì)量標準作為參照，陰性對照不出條帶，陽性對照出261bp、 157bp兩個條帶，說明對照成立，樣品中出現(xiàn)26 Ibp —個條帶，S卩為豬瘟流行毒株感染，樣品出261bp、157bp兩個條帶，即為疫苗毒株。
權利要求
1.一種用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應試劑盒， 其特征在于，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴混合液、二擴混合液、陰性對照和陽性對照組成；所述反轉(zhuǎn)錄混合液由DEPC處理滅菌水、2. 5m mo I · L_1dNTP > 5 X AMVBuf f er > 25 μ mo I · L_1S2下游引物、5U/ μ L AMV反轉(zhuǎn)錄酶和40U/ μ L HPR I RNA酶抑制劑組成；每個反應體積比為10 4 4 I O. 5 O. 5，共計20 μ L，50個反應共計1000 μ L，裝成 I管；所述一擴混合液由滅菌三蒸水、10XPCR Buffer>2. 5m mol · L ΜΝΤΡ、25 μ mol · L 1Sl 上游引物、25μπιο1 · 1742下游引物、5U/yL rTaq DNA聚合酶組成，每個反應體積比為 17 2. 5 2 O. 5 O. 5 O. 5，共計 23 μ L，50 個反應共計 1150 μ L，裝成 I 管；所述二擴混合液由滅菌三蒸水、10XPCR Buffer, 2. 5m mo I · L_1dNTP,25 μ mol · L_1S3 上游引物、25ymol · I^S4下游引物、25ymol · 1/45下游引物、5U/μ LrTaq DNA聚合酶組成，每個反應體積比為16. 5 2. 5 2 0. 5 0. 5 0. 5，共計23 μ L，50個反應共計 1150yL，裝成I管；所述陰性對照為正常細胞培養(yǎng)上清液，陽性對照為HCLV株細胞培養(yǎng)液；所述的引物 SI 序列為5’ -GACACTAGYGCAGGCAAYA-3’所述的引物 S2 序列為5’ -AGTGGGTTCCAGGARTAC-3’所述的引物 S3 序列為5’ -CCACGGGGGTGCCCTACAA-3’所述的引物S4序列為5’ -CCTGGCATGTAACTA-3’所述的引物 S5 序列為5’ -CTCTCGGTGAGAAATTTG-3’。
2.權利要求I所述用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟1)TRIzol Reagent試劑法提取待檢樣品總RNA，空氣中自然干燥；2)取反轉(zhuǎn)錄混合液20μ L，充分吹吸溶解總RNA，42°C水浴反轉(zhuǎn)錄90min，取出置_20°C 保存?zhèn)溆茫?)取一擴混合液23μ L，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 45s，54°C 50s, 72°C 50s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ；4)取二擴混合液23μ L，加入一擴產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為95°C 預變性 5min，94°C 30s，54。。30s, 72°C 40s 共進行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ；5)IOg · Γ1瓊脂糖凝膠中電泳；6)結(jié)果分析陰性對照不出條帶，陽性對照出261bp、157bp兩個條帶，說明對照成立， 樣品中出現(xiàn)261bp —個條帶，即為豬瘟流行毒株感染，樣品出261bp、157bp兩個條帶，即為疫苗毒株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒，由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴混合液、二擴混合液、陰性對照和陽性對照組成。還公開了該試劑盒的檢測方法。該方法針對豬瘟病毒NS5B基因設計5條引物，S1、S2為疫苗毒株與流行毒株外擴通用引物，S3、S4為疫苗毒株與流行毒株內(nèi)擴通用引物，S5為疫苗株內(nèi)擴特異性引物。經(jīng)過引物濃度、聚合酶濃度、退火溫度等優(yōu)化，建立了鑒別診斷方法。本發(fā)明方法靈敏度高，特異性好，既能檢測出流行毒株感染，又能判斷是否是疫苗接種陽性，結(jié)果直觀準確，適用于大范圍豬瘟疫情普查診斷，避免誤診造成的損失。
文檔編號C12Q1/68GK102605105SQ20121007315
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權日2012年3月19日
發(fā)明者吳旭錦, 徐德乾, 朱小甫 申請人:咸陽職業(yè)技術學院