專(zhuān)利名稱(chēng)：稻瘟病抗性基因Piym2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因的分離克隆與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要糧食。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的稻谷減產(chǎn)達(dá)10% 30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30% 50%，甚至顆粒無(wú)收。在我國(guó)稻瘟病常年發(fā)生面積在380萬(wàn)畝左右，造成數(shù)億公斤的稻谷損失，直接威脅著國(guó)家的糧食安全。培育和利用抗病品種一直被公認(rèn)為最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的稻瘟病防治措施。但是，由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加之其致病性易于發(fā)生變異，一些潛在的或新產(chǎn)生的致病小種的迅速繁殖，一個(gè)抗病品種往往推廣3-5年就發(fā)生感病化。廣泛挖掘抗病資源，鑒定和克隆抗病基因，培育廣譜、持久抗病新品種，是當(dāng)前水稻抗稻瘟病病育種研究工作的當(dāng)務(wù)之急O(jiān)隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，迄今至少已有70多個(gè)水稻抗稻瘟病主效基因被分子定位，分別位于除第3染色體以外的11條水稻染色體上，其中2/3以上位于第6、11和 12染色體，且成簇分布。在稻瘟病抗性基因克隆方面，正式報(bào)道的已有18個(gè)抗性基因，即 Pib, Pita、Pi9,Pi2, Piz~t、Pi_d2、Pi_d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik_m、Pik~p、Pi5、Pia、Pit、 Pish ,pi 21, Pb I。除Pid2編碼一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸受體類(lèi)激酶，編碼一個(gè)富含脯氨酸的蛋白，各自代表一種新的抗性基因類(lèi)型外，其余的已克隆的16個(gè)基因全都屬于NBS-LRR (Nucleotide binding site-Leucine rich repeat)基因家方矣。Pib (Wang et al.，1999)是第一個(gè)被克隆的稻瘟病抗性基因，克隆自日本粳稻品種TohokuIL9,位于水稻第2染色體的長(zhǎng)臂末端。它包含有4個(gè)內(nèi)含子,全長(zhǎng)cDNA由I 個(gè)5’非翻譯區(qū)(UTR)、1個(gè)的開(kāi)放閱讀框(ORF)和I個(gè)3’非翻譯區(qū)等組成。Pib編碼一個(gè)由1251個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，屬于典型的NBS-LRR類(lèi)抗病基因。環(huán)境條件(如溫度、 光照等)的變化可影響的表達(dá)。Pita (Bryan et al. , 2000)克隆自日本粳稻品種Yashiro-Mochi,位于水稻第 12染色體近著絲點(diǎn)區(qū)域。它包含2個(gè)外顯子和I個(gè)的內(nèi)含子，編碼一個(gè)由928個(gè)氨基酸組成的質(zhì)膜受體蛋白，包含NBS結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRD)抗感位點(diǎn)編碼的產(chǎn)物只有一個(gè)氨基酸的差異，即918位的丙氨酸變?yōu)榻z氨酸。Pi-ta介導(dǎo)的抗性可能是Pi-ta蛋白與AVR-Pita蛋白互作的結(jié)果，但需要一個(gè)與之共分離的單顯性基因產(chǎn)斤“)的參與(Jia et al. , 2008)。Pi9 (Qu et al. , 2006)、朽之和Piz-i (Zhou et al. , 2006)均位于第 6 染色體短臂近著絲粒區(qū)，都屬于NBS-LRR類(lèi)基因，但它們的2個(gè)內(nèi)含子分別位于NBS區(qū)之前和LRR 區(qū)之后，而不像其他NBS-LRR基因的內(nèi)含子位于NBS區(qū)的激酶2的N端。Pi 2與Pi z~t高度同源，兩者僅有八個(gè)氨基酸不同，分布在3個(gè)保守的LRR結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，顯示了 LRR結(jié)構(gòu)區(qū)與基因的小種專(zhuān)化性有關(guān)。Pi-d2 (Chen et al. , 2006)和朽-必(Shang et al. , 2009)都克隆自我國(guó)秈稻品種地谷。Pi-必位于第6染色體短臂近著絲粒區(qū)，編碼一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白受體激酶，其抗感差異由單堿基突變?cè)斐傻?，即?41氨基酸由異亮氨酸(I)突變?yōu)榧琢虬彼?M)。
位于第6染色體長(zhǎng)臂的近著絲粒區(qū)，含有2個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由923氨基酸組成的蛋白，產(chǎn)物含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域和MHD基序。其抗感差異也是因一個(gè)單堿基突變?cè)斐傻?，即抗病品種的LRR結(jié)構(gòu)域的第2208位核苷酸處C在感病品種中突變?yōu)門(mén)，造成編碼蛋白的提前終止。Pi36 (Zhai et al. , 2011)克隆自秈稻品種Q61，位于第8染色體短臂上。它編碼1056個(gè)氨基酸，在基因組中為單拷貝，組成性表達(dá)，抗、感位點(diǎn)編碼的蛋白僅在第590個(gè)氨基酸的位置上存在一個(gè)氨基酸的差異(Asp - Ser) oPi37 (Zhai et al. , 2011)克隆自粳稻品種St. No. 1，位于第I染色體長(zhǎng)臂上。它編碼1290個(gè)氨基酸，也是組成型表達(dá)，其抗性的獲得是因第239位(丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸)和第247位氨基酸(蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?發(fā)生置換引起的。Pik (Zhai et al. , 2011) ^Pik~m (Ashikawa et al. , 2008)和(Yuan et al., 2011)，是位點(diǎn)上的3個(gè)等位基因，位于第11染色體長(zhǎng)臂近末端區(qū)域。這3個(gè)基因的抗性均由2個(gè)緊密連鎖的NBS-LRR類(lèi)互補(bǔ)基因提供。Pik的2個(gè)互補(bǔ)基因編碼的蛋白與和對(duì)應(yīng)的等位基因所編碼的蛋白有非常高的同源性。(Lee et al., 2009)和/ (Okuyama et al.，2011)也都包含 2 個(gè) NBS- LRR 類(lèi)基因。位于第 9 染色體近著絲粒短，其2個(gè)NBS- LRR類(lèi)基因分別編碼1025和1063個(gè)氨基酸，一個(gè)受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)，另一個(gè)組成性表達(dá)。Pia位于第11染色體短臂，其2個(gè)NBS- LRR類(lèi)基因雖然相鄰但方向相反。Pit (Hayashi and Yoshida, 2009)克隆自日本粳稻品種K59,位于第I染色體近末端區(qū)域。與感病Γ雄⑴不同的是，抗病化5到的啟動(dòng)子中插入了一個(gè)長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)座子，同時(shí)在NBS和LRR結(jié)構(gòu)域各有2個(gè)氨基酸替換。反轉(zhuǎn)座子激活了Pii基因的表達(dá)，對(duì)Pit 恢復(fù)抗性功能起到至關(guān)重要的作用。Pish (Takahashi et al.，2010)克隆自日本粳稻品種新2號(hào)，位于第I染色體長(zhǎng)臂上。它是利用反轉(zhuǎn)座子插入突變方法克隆的，與的氨基酸一致性大98%。pi21 (Fukuoka et al. , 2009)是第一個(gè)被克隆的隱性抗稻痕病基因，是位于第4 染色體上的一個(gè)主效QTL。與感病品種相比,抗病品種Owarihatamochi的基因中分別有21bp和48bp的缺失。感病等位基因編碼一個(gè)由266氨基酸組成的富含脯氨酸的蛋白，負(fù)調(diào)節(jié)抗病性。(Hayashi et al, 2010)是一個(gè)具有成株抗性和穗瘟抗性的基因，來(lái)自秈稻品種Modan，位于第11染色體長(zhǎng)臂上一個(gè)以60_kb為單位的串聯(lián)重復(fù)序列中。Pbl基因在NBS區(qū)域不包含P-Ioop結(jié)構(gòu)，其它一些基序也發(fā)生了退化。在含作2的品種中，作7基因的轉(zhuǎn)錄水平隨發(fā)育進(jìn)程而增加，其功能化是通過(guò)基因組重復(fù)在編碼序列上游安置一個(gè)啟動(dòng)子序列而激活“沉睡的”飽Pbl的結(jié)果。稻瘟病抗性基因的克隆及其功能分析，為人們理解水稻抗稻瘟病分子機(jī)理提供了一定的信息。首先，在已克隆的18個(gè)基因中有16個(gè)屬于NBS-LRR類(lèi)基因家族，有理由相信， 水稻中抗稻瘟病基因絕大多數(shù)應(yīng)該是NBS-LRR類(lèi)基因；其次，多數(shù)抗病基因成簇分布，且簇內(nèi)基因間同源性很高，暗示著水稻與病原菌協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中抗性基因有可能通過(guò)復(fù)制、重組、插入及堿基突變等方式產(chǎn)生不同的抗性基因；另外，在分子水平上證實(shí)了抗性基因與病原菌的無(wú)毒基因相互識(shí)別的“基因?qū)颉奔僬f(shuō)，相對(duì)于無(wú)毒基因的快速進(jìn)化，水稻需要不斷地產(chǎn)生新的抗性基因。稻瘟病抗性基因的分離和獲得，為抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因育種提供了基因源。在已克隆的稻瘟病抗性基因中，除部分抗性基因和作7外，其他基因都表現(xiàn)完全抗性，其小種專(zhuān)化性強(qiáng)，抗性易于喪失.至子pi21和作2，雖然具備持久抗性的某些特征，但抗性程度弱，在稻瘟病大流行年份難以真正發(fā)揮作用。由于田間稻瘟病菌小種眾多且變異速度快，為了更好地應(yīng)對(duì)稻瘟病的危害，克隆更多的抗稻瘟病基因就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種稻瘟病抗性基因及其應(yīng)用，將所述基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物，特別是可以用雜交和轉(zhuǎn)化方法在植物中累加多個(gè)抗病基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中連鎖累贅問(wèn)題，并且可以縮短育種時(shí)間，提高品種選育效率。本發(fā)明的目的是提供一種水稻稻瘟病抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。該DNA序列編碼一種NBS- LRR類(lèi)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所列，結(jié)構(gòu)如圖 8所示。因而，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述抗稻瘟病基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于擴(kuò)增上述抗稻瘟病基因的特異性引物對(duì)，其正向引物如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO. 4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述抗稻瘟病基因的載體。本發(fā)明所分離、克隆的抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。該種蛋白包含兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域NBS和LRR區(qū)域,其中NBS結(jié)構(gòu)域含有保守的激酶la (kinase la) kinase la: GGAGKS,激酶 2 (kinase 2) :LLYLDDV 和激酶 3a (kinase 3a) :GSRVLVTSRQ。而該蛋白的C-末端為27個(gè)典型LRR重復(fù)，其亮氨酸含量為16. 4%。本發(fā)明同樣包括將抗性基因的主要結(jié)構(gòu)部分連接上合適的調(diào)節(jié)序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子如花椰菜花也病毒的35S啟動(dòng)子等連接，或者和一個(gè)組織/發(fā)育時(shí)期特異性表達(dá)的啟動(dòng)子或環(huán)境條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接。其中，組織和發(fā)育時(shí)期包括葉、果實(shí)、種子和花等，環(huán)境條件包擴(kuò)病原菌的攻擊、厭氧條件和光等。本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。將所述的基因編碼區(qū)序列連接到植物載體，導(dǎo)入到水稻或其他植物細(xì)胞，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品種，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所屬的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對(duì)所屬基因或其調(diào)控序列做適當(dāng)?shù)男揎?，也可以在其轉(zhuǎn)錄起始密碼子前用其他的啟動(dòng)子取代原有的自動(dòng)子，從而拓寬和增強(qiáng)對(duì)病原菌的抗性。本發(fā)明具有如下明顯的有益效果來(lái)源于我國(guó)云南粳稻品種YMG，是一個(gè)廣譜、持久抗性的地方品種?？寺?lái)源于 YMG的稻瘟病抗性基因，可以廣泛應(yīng)用于抗稻瘟病水稻的育種。將泛基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用雜交和轉(zhuǎn)化方法在植物中累加多個(gè)抗病基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中連鎖累贅問(wèn)題，并且可以縮短育種時(shí)間，提高品種選育效率；抗病基因的克隆是解決傳統(tǒng)育種中種間基因轉(zhuǎn)移存在障礙的基礎(chǔ)。


圖I為水稻稻瘟病抗性基因Piym2的遺傳和物理圖譜
圖2為Piym2引物從抗感親本DNA里擴(kuò)增出的目的片段瓊脂糖凝膠電泳圖其中M1: 15kb DNA分子量標(biāo)記；M2: 2kb DNA分子量標(biāo)記圖3為互補(bǔ)載體pCAMBIA1305. I結(jié)構(gòu)4為過(guò)表達(dá)載體pCUbil390結(jié)構(gòu)圖
圖5為水稻稻瘟病抗性基因泛基因組互補(bǔ)轉(zhuǎn)化T1植株的稻瘟病抗性鑒定圖其中，I YMG ；2 Fujisaka5 ;3_14分別表示12個(gè)以Fujisaka5為背景的轉(zhuǎn)基因單株。R 代表抗病，S代表感病。A.各T1單株的稻瘟病抗性表型；B.各T1單株的潮霉素標(biāo)記基因型，PCR反應(yīng)體系如下10μ I 2XPCR Buffer for KOD FX,4y I dNTPs (2mM each), I μ I 引物(10 μ M, F+R)，0.4y I KOD FX 酶(lU/μ 1，Τ0Υ0Β0)，I μ I DNA 模板(IOOng/μ I )，加 ddH20 至 20μ I ;擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C 2 min ；98°C 10s — 55°C 30s ^ 68°C 50s，35 個(gè)循環(huán) —68°C 5 min, 16°C保存。圖6為水稻稻瘟病抗性基因Piym2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化T1植株的稻瘟病抗性鑒定圖其中，I YMG ；2 Fujisaka5 ;3_12分別表示10個(gè)以Fujisaka5為背景的轉(zhuǎn)基因單
株。R代表抗病，S代表感病。A.各T1單株的稻瘟病抗性表型；B.各T1單株的潮霉素標(biāo)記基因型，PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增反應(yīng)條件同圖5B。圖7為水稻稻瘟病抗性基因Piym2基因的結(jié)構(gòu)圖8為水稻稻瘟病抗性基因編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)其中，N端帶單下劃線字母為組成推定的2個(gè)CC (coil-coil)結(jié)構(gòu)域；中間帶單下劃線并加粗傾斜的字母位NBS的3個(gè)保守區(qū)域；該蛋白的C-末端的590-1288個(gè)氨基酸為27 個(gè)LRR重復(fù)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法(例如山崎義人、 高坂淖爾編著.稻瘟病與抗病育種(凌忠專(zhuān)、孫昌其譯).農(nóng)業(yè)出版社，1990 ;路鐵鋼等編著.分子遺傳學(xué).高等教育出版社，2008)。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I :水稻稻瘟病抗性基因Piym2的遺傳分析及初步定位
為了發(fā)掘和鑒定稻瘟病新抗性基因，對(duì)不攜帶任何主效抗稻瘟病基因的感病粳稻地方品種麗江新團(tuán)黑谷(Lijiangxintuanheigu,簡(jiǎn)稱(chēng)LTH)與云南地方粳稻品種羊毛谷 (Yangmaogu,簡(jiǎn)稱(chēng)YMG)配制雜交組合，采用F1' F2及F3群體對(duì)YMG的稻瘟病抗性遺傳進(jìn)行了深入的研究，鑒定和定位了 Piyml和Piym2兩個(gè)主效抗性基因。其中對(duì)來(lái)自我國(guó)秈稻區(qū)的稻瘟病菌株CH43表現(xiàn)抗性，被定位在水稻第I染色體長(zhǎng)臂上(圖I)。實(shí)施例2 :稻瘟病抗性基因Piym2的精細(xì)定位與候選基因預(yù)測(cè)
本發(fā)明利用圖位克隆和生物信息學(xué)方法克隆抗性基因Α>^ 。為精細(xì)定位該基因，利用從LTH /YMG F2群體中分離出來(lái)的對(duì)稻瘟病鑒別菌株表現(xiàn)極端感病單株1990個(gè)，及表現(xiàn)極端抗病的單株1060個(gè)，通過(guò)用連鎖標(biāo)記以及F3后代表型驗(yàn)證，洛Piym2定位在標(biāo)記CAPS2 和dCAPS5之間。在日本晴參考序列中，該區(qū)間為78. 8 Kb，包含10個(gè)候選基因，其中4個(gè)基因i0s01g57270、0s01g57280、0s01g57310和)是與抗病相關(guān)的NBS-LRR結(jié)構(gòu)的基因，都聚集于克隆81100010上，跨越52.0103的區(qū)間。測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在YMG中該區(qū)間大約為43 Kb, 利用 FGENESH 軟件(http://linuxl. softberry. com/berry, phtml)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),這 43 Kb序列含有7個(gè)基因，其中2個(gè)為NBS-LRR類(lèi)基因(圖I)。通過(guò)下述實(shí)驗(yàn)確定第二個(gè) NBS-LRR類(lèi)基因(候選基因)即為目標(biāo)基因Piym20
實(shí)施例3 :稻瘟病抗性基因Ρ ,2候選基因的分離及載體的構(gòu)建
為了分離出Α>^ ，根據(jù)已經(jīng)獲得的序列，通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)候選基因的特異性引物，通過(guò)高保真KOD酶(Τ0Υ0Β0)用PCR方法將候選基因分離出來(lái)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到PCAMBIA1305. I和pCUbil390載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌TranslO (TransGen Biotech)中保存。連接產(chǎn)物經(jīng)酶切驗(yàn)證的陽(yáng)性質(zhì)粒送往北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序 (Biomed)。一、PCR 擴(kuò)增
根據(jù)已經(jīng)獲得的序列，通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)候選基因的特異性引物，其中引物序列分別為
1305F: CCATGATTACGAArrCTTTCATTAGGTGCACCCACCCACAAG (SEQ ID NO. 3)
1305R: TACCGAGCTCGAATTaQkkQkTQQQCQkTQQQkQTCkTQT (SEQ ID NO. 4)
1390F: TTACTTCTGCACTAGGTACCQTQTTkTKCkkTQQCQQkQQTQQTQCTk (SEQ ID NO. 5) 1390R: TCCGTCGACCTGCAGGTACCkkQCkCkmCkTCTQkmCCTTCCkQCQ (SEQ ID NO. 6) 通過(guò)高保真KOD酶用PCR方法以抗病親本YMG的DNA為模板，利用引物1390F (SEQ ID NO. 5)和 1390R (SEQ ID NO. 6)擴(kuò)增/ 泛的編碼區(qū)片段 3867bp，利用 1305F (SEQ ID 勵(lì).3)和 13051 (SEQ ID NO. 4)擴(kuò)增/ 泛的全長(zhǎng)基因組片段 7006bp (SEQ ID NO. I) oPCR 反應(yīng)體系如下2X PCR Buffer for KOD FX 25μ 1,10μ I dNTPs (2mM each), 2μ1 弓丨物 (lOpmol, F+R), I μ I KOD FX 酶(lU/μΙ, Τ0Υ0Β0),2μ I DNA 模板(IOOng/μ I )，加 ddH20 至5(^1。擴(kuò)增反應(yīng)條件941 2 min ；98°C 10 s — 60°C 30s — 68°C 10 min，35 個(gè)循環(huán)； 68°C 5 min，16°C保存。二、PCR產(chǎn)物及質(zhì)?；厥张c純化
PCR產(chǎn)物在I. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為I X TAE,當(dāng)電泳指示劑溴酚藍(lán)遷移至可以分離DNA片段時(shí)(160V, 20min),關(guān)閉電源。在凝膠圖像分析儀上記錄結(jié)果，電泳圖如圖2所示。在紫外燈下切下目的條帶，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生物技術(shù)公司) 回收，利用試劑盒(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)提取質(zhì)粒，用及酶切pCAMBIA1305. I 載體，用KpnI酶切pCUbil390載體后回收備用。三、候選基因的連接轉(zhuǎn)化利用 Clonetech In-fusion PCR Cloning system (TaKaRa)對(duì)純化后的的全長(zhǎng)基因組片段(7006bp)和編碼區(qū)片段(3867bp，詳見(jiàn)SEQ ID NO. I中第1598位至5464位) 分別重組到PCAMBIA1305. I載體的酶切位點(diǎn)，和pCUbil390載體的命酶切位點(diǎn)， 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TranslO (TransGen Biotech)中。載體示意圖如圖3和圖4所示。重組反應(yīng)程序
線性質(zhì)粒(100-200 ng/μ I)3 μ I
純化的 PCR 產(chǎn)物(100-200 ng/μ I)I μ I
5 X in-fusion HD Enzyme PremixI μ I
反應(yīng)程序50。C 60 min，4° C 30min 四、酶切驗(yàn)證與測(cè)序
轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶&0似或酶切驗(yàn)證后，連接上的陽(yáng)性質(zhì)粒送往北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序(Biomed)。實(shí)施例4 :稻瘟病抗性基因Pi,2的遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定
將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，即含泛全長(zhǎng)基因組的互補(bǔ)載體PCAMBIA1305. I和含編碼區(qū)的過(guò)表達(dá)載體pCUbi 1390，通過(guò)電擊分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，并轉(zhuǎn)化感病水稻品種 Fujisaka5。利用潮霉素標(biāo)記 HygF (GGAGCATATACGCCCGGAGT, SEQ ID NO. 7) 和HygR (CTGCCCGCTGTCTAC AACC, SEQ ID NO. 8)檢測(cè)轉(zhuǎn)互補(bǔ)載體和過(guò)表達(dá)載體的Ttl代，篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株并插植。在水稻分蘗盛期，利用稻瘟病鑒別菌株進(jìn)行注射接種鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在33個(gè)轉(zhuǎn)互補(bǔ)載體的Ttl代植株中，有29株表現(xiàn)抗病反應(yīng)，4株表現(xiàn)感病反應(yīng)；在48 個(gè)轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)載體的Ttl代植株中，有21株表現(xiàn)抗性抗病反應(yīng)，27個(gè)表現(xiàn)感病反應(yīng)(表I)。對(duì) T1株系進(jìn)行噴霧接種鑒定，發(fā)現(xiàn)所有由感病Ttl單株衍生的T1株系都表現(xiàn)純合感病，而由抗病Ttl單株衍生的T1株系表現(xiàn)抗病或抗感分離(表I)。這些結(jié)果表明，泛轉(zhuǎn)基因可以互補(bǔ)對(duì)供試稻瘟病株的抗性。圖5和圖6給出部分T1代植株葉片病斑圖，其中，水稻稻瘟病抗性測(cè)定按0-5級(jí)分級(jí)0-3級(jí)為抗病R，4-5為感病S。以上結(jié)果也說(shuō)明，/ 泛轉(zhuǎn)基因是可以穩(wěn)定遺傳的，可以直接利用Pi,2基因轉(zhuǎn)化水稻感病品種，獲得含有該基因的抗稻瘟病水稻新種質(zhì)，也可以利用有性雜交轉(zhuǎn)移抗性轉(zhuǎn)化體中的基因來(lái)改良其他粳稻水稻品種，還可以利用有性雜交將該基因直接應(yīng)用于水稻育種。 表I基因的遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種水稻稻瘟病抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述的基因的cDNA。
3.權(quán)利要求I所述的基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是其氨基酸序列如SEQID NO. 2所/Jn ο
4.含有權(quán)利要求I所述的基因或權(quán)利要求2所述的cDNA的表達(dá)盒。
5.含有權(quán)利要求I所述的基因或權(quán)利要求2所述的cDNA的表達(dá)載體。
6.一種制備抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求I所述基因或權(quán)利要求2所述的cDNA轉(zhuǎn)化水稻，在轉(zhuǎn)基因植株中選擇出抗性增強(qiáng)的植株。
7.獲得權(quán)利要求I所述的基因的引物對(duì)，其正向引物如SEQID NO. 3所示，反向引物如 SEQ ID NO. 4 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻稻瘟病抗性基因Piym2及其應(yīng)用，提供了所述的水稻抗稻瘟病基因Piym2的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列，該基因?qū)儆贑C-NBS-LRR抗性基因家族的成員。本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增水稻抗稻瘟病基因Piym2的引物，以及該基因在轉(zhuǎn)化水稻或其他植物培育抗病品種方面的應(yīng)用。將本發(fā)明所述基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用雜交和轉(zhuǎn)化方法在植物中累加多個(gè)抗病基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中連鎖累贅問(wèn)題，并且可以縮短育種時(shí)間，提高品種選育效率。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102604974SQ20121007381
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者萬(wàn)建民, 張欣, 王久林, 程治軍, 許興濤, 郭秀平, 雷財(cái)林, 馬建 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所