專利名稱：一種提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微載體的回收處理方法，具體涉及一種提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法。
背景技術(shù)：
大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類動物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法。近十?dāng)?shù)年來，人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求猛增。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞有雞胚、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞，例如 BHK-21 (倉鼠腎細(xì)胞)、MDCK、Marc-145等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、 豬瘟蘭耳病疫苗等產(chǎn)品?，F(xiàn)在，由于動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，因此人們對動物細(xì)胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)發(fā)生了改變。1967年，Van Wezel首次開發(fā)了微載體系統(tǒng)，創(chuàng)建了生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)細(xì)胞工藝， 使動物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入高密度培養(yǎng)階段。目前，Pharmacia公司生產(chǎn)的Cytodex系列應(yīng)用最為廣泛。雖然，微載體廣泛用于生物制品行業(yè)，但是由于我國微載體制造技術(shù)不成熟，還不能運(yùn)用于生物反應(yīng)器細(xì)胞高密度培養(yǎng)。國內(nèi)使用的微載體均為進(jìn)口產(chǎn)品，但是進(jìn)口微載體通常存在價格高的問題，給我國生物制品的發(fā)展帶來了極大的影響，尤其是獸用生物制品的發(fā)展。同時，這些進(jìn)口的微載體多數(shù)是一次性載體，只有少數(shù)微載體才能夠重復(fù)使用，但是重使用次數(shù)較少，例如GE Healthcare公司的產(chǎn)品說明書建議其微載體使用次數(shù)最多不超過4次，并且沒有給出有效的回收方法。目前，普遍采用的微載體回收工藝過于簡單，造成了微載體表面的殘留細(xì)胞碎片處理不干凈，影響微載體的重復(fù)利用；由于沒有形成有效的系統(tǒng)回收方法，大多數(shù)的微載體使用之后都沒有進(jìn)行回收再利用，造成了嚴(yán)重的浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其包括以下步驟
(1)篩選使用60-300目的篩網(wǎng)過濾除去溶液，回收微載體，并放置到容器中；
(2)溶劑稀釋向上述裝有微載體的容器中加入2-5倍于微載體體積的濃度為O.IM的并含有濃度為10-50mM的EDTA的PBS溶液，再用醫(yī)用酒精稀釋至載體的體積濃度至20% ；
(3)攪拌將上述溶液進(jìn)行中速攪拌；(4)過濾攪拌結(jié)束后，用篩網(wǎng)過濾回收微載體，同時從溶液中取出從微載體上脫落的的細(xì)胞碎片；
(5)氫氧化鈉處理將上述過濾后收集的微載體放入到容器中，然后加入1-2倍于微載體體積的濃度為O. I-IM氫氧化鈉溶液，加入同時攪拌，攪拌過程中用顯微鏡檢測微載體表面，至貼在微載體表面80-90%的細(xì)胞碎片脫落；
(6)調(diào)節(jié)pH值攪拌停止后用篩網(wǎng)回收載體，并用O.IM的PBS沖洗載體，至溶液的pH 值為 6. 5-7. 5 ；
(7)酶消化處理將上述微載體轉(zhuǎn)入到容器中，加入1-2倍于微載體體積的蛋白酶溶液進(jìn)行消化處理，消化期間不斷攪拌，并用顯微鏡觀察微載體表面，至微載體表面干凈后停止消化；
(8)沖洗將上述消化完成后的微載體用濃度為O.IM的PBS沖洗，直至PBS沖洗液中不再出現(xiàn)細(xì)胞碎片；
(9)滅菌處理將上述沖洗后的微載體進(jìn)行滅菌處理，之后用于細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明中氫氧化鈉的作用是除去微載體表面的蛋白，有助于提高微載體的回收效果O由于盛裝微載體的容器材質(zhì)不能與微載體發(fā)生相互吸引，否則會造成微載體的損失，因此，優(yōu)選的，本發(fā)明所述的裝微載體的容器為硅化玻璃容器。所述(3)攪拌步驟中，中速攪拌的速度為60-120轉(zhuǎn)/分，攪拌時間為2-4小時。另外本發(fā)明中其他地方所提到的中速攪拌時，攪拌速度均為60-120轉(zhuǎn)/分。本發(fā)明中，所采用的氫氧化鈉溶液優(yōu)選的濃度為O. 1-0. 5M。優(yōu)選的，本發(fā)明中，所述的(7)酶消化處理步驟中，攪拌速度為10-50轉(zhuǎn)/分。為了避免顆粒較小的微載體丟失和提高溶液中其它物質(zhì)例如細(xì)胞碎片過濾的效率，優(yōu)選的，本發(fā)明中所述的網(wǎng)篩為150-200目的不銹鋼網(wǎng)篩。本發(fā)明中所采用的蛋白酶溶液是質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶-EDTA溶液。本發(fā)明中，所述(7)酶消化處理步驟中，消化在室溫下進(jìn)行，消化時間為10_20h， 攪拌速度為10-120轉(zhuǎn)/分，在消化期間每隔1-2小時，使用顯微鏡觀察微載體表面I次。本發(fā)明所述的滅菌處理采用高壓滅菌。高壓滅菌多采用的高壓滅菌器為上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的智能型滅菌器LDZM-60KCS。
為了進(jìn)一步達(dá)到洗脫微載體上細(xì)胞碎片的目的，提高回收的微載體的使用次數(shù)，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，所述(3)攪拌步驟中，攪拌期間按照(2)步驟更換溶劑1-2次。本發(fā)明中所采用的顯微鏡的放大倍數(shù)為40X40倍。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法采用多個步驟結(jié)合，達(dá)到最佳的處理效果，其不僅明顯增加微載的使用次數(shù)，節(jié)約了使用成本；而且經(jīng)過多次處理后的微載體使用時對細(xì)胞在微載體上貼壁生長情況并沒出現(xiàn)明顯影響。本發(fā)明所述的處理方法可廣泛適用各種微載體的回收，如cellulose (纖維素微載體)、polystyrene (聚苯乙烯微載體)以及瑞典Pharmacia生技公司生產(chǎn)的 Cytodex系列等。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。



圖2 圖3 圖4 圖5 圖6 圖7 圖8
圖I為本發(fā)明中實(shí)施例I新微載體的顯微照片；
為本發(fā)明中實(shí)施例I微載體經(jīng)過第四次處理后的顯微照片為本發(fā)明中實(shí)施例I微載體經(jīng)過第八次處理后的顯微照片為本發(fā)明中實(shí)施例I微載體經(jīng)過第十次處理后的顯微照片為本發(fā)明中實(shí)施例I新的微載體培養(yǎng)細(xì)胞的效果的顯微照片；
為實(shí)施例I微載體經(jīng)過第四次處理后培養(yǎng)細(xì)胞的效果的顯微照片； 為實(shí)施例I微載體經(jīng)過第八次處理后培養(yǎng)細(xì)胞的效果的顯微照片； 為實(shí)施例I微載體經(jīng)過第十次處理后培養(yǎng)細(xì)胞的效果的顯微照片。
具體實(shí)施例方式以下具體的實(shí)施例是對本發(fā)明所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法的具體應(yīng)用。實(shí)施例I
I.載體Cytodex I源于Pharmacia (瑪法西亞)公司，其材質(zhì)為crosslink dextrin (交聯(lián)葡聚糖)，比表面積為270cm2/ml。2.實(shí)驗(yàn)具體操作如下
(1)載體回收將新購買的CytodexI微載體經(jīng)過一次使用后用200目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾除去溶液，并放置到容器中，加入2倍于微載體體積的濃度為O. IM并含有濃度為IOmM 的EDTA的PBS溶液，再用醫(yī)用酒精稀釋至載體的體積濃度至20%，進(jìn)行中速攪拌，攪拌過程中過濾去掉溶劑并更換O. IM并含有濃度為IOmM的EDTA的PBS溶液一次，繼續(xù)攪拌，攪拌結(jié)束后，用300目的篩網(wǎng)過濾回收微載體，同時從溶液中取出從微載體上脫落的的細(xì)胞碎片；過濾后收集的微載體放入到容器中，然后加入I倍于微載體體積的濃度為O. IM氫氧化鈉溶液，加入同時攪拌，攪拌過程中每隔15分鐘用顯微鏡檢測微載體表面,至貼在微載體表面絕大多數(shù)細(xì)胞碎片都脫落；停止攪拌，再用300目的篩網(wǎng)回收微載體，并用O. IM的PBS 沖洗載體，至溶液的PH值為7，之后將微載體轉(zhuǎn)入到容器中，加入2倍于微載體體積的質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶-EDTA溶液進(jìn)行消化處理，消化期間不斷攪拌，并用顯微鏡觀察微載體表面，20小時后，微載體表面干凈，停止消化并用濃度為O. IM的PBS溶液沖洗，直至PBS沖洗液中不再出現(xiàn)細(xì)胞碎片，然后對微載體進(jìn)行滅菌處理；
(2)細(xì)胞培養(yǎng)將上述滅菌處理后的微載體放入T75細(xì)胞瓶，以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基+10% 胎牛血清培養(yǎng)為溶液，細(xì)胞接種的密度為2X IO5個/毫升，接種時溶液體積為15毫升，微載體的最終密度為I. Omg/ml，培養(yǎng)條件為37°C，在加入細(xì)胞后，每間隔3分鐘晃動混勻微載體與細(xì)胞，持續(xù)2小時后，掉到細(xì)胞液，然后加入新的含有10%的Hyclone胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，微載體在處理后和培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行顯微鏡觀察并且拍照；
(3)重復(fù)試驗(yàn)重復(fù)上述(I)和(2)步驟十次，每次重復(fù)后的微載體在處理后和培養(yǎng)結(jié)束后用40X40倍的顯微鏡觀察并且拍照。實(shí)施例2
I.載體Mica來源于Anawa公司，其材質(zhì)為Polyacrylate (聚丙烯酸酯)，比表面積為 130 cm2/ml。2.實(shí)驗(yàn)具體操作如下
(1)載體回收將新購買的Mica微載體經(jīng)過一次使用后用200目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾除去溶液，并放置到容器中，加入3倍于微載體體積的濃度為O. IM并含有濃度為50mM的EDTA 的PBS溶液，再用醫(yī)用酒精稀釋至載體的體積濃度至20%，進(jìn)行中速攪拌，攪拌過程中過濾去掉溶劑并更換O. IM并含有濃度為50mM的EDTA的PBS溶液一次，繼續(xù)攪拌，攪拌結(jié)束后， 用300目的篩網(wǎng)過濾回收微載體，同時從溶液中取出從微載體上脫落的的細(xì)胞碎片；過濾后收集的微載體放入到容器中，然后加入I倍于微載體體積的濃度為O. 5M氫氧化鈉溶液， 加入同時攪拌，攪拌過程中每隔15分鐘用顯微鏡檢測微載體表面,至貼在微載體表面絕大多數(shù)細(xì)胞碎片都脫落；停止攪拌，再用300目的篩網(wǎng)回收微載體，并用O. IM的PBS沖洗載體，至溶液的PH值為7，之后將微載體轉(zhuǎn)入到容器中，加入I倍于微載體體積的質(zhì)量濃度為
O.25%的胰酶-EDTA溶液進(jìn)行消化處理，消化期間不斷攪拌，并用顯微鏡觀察微載體表面， 50小時后，微載體表面干凈，停止消化并用濃度為O. IM的PBS溶液沖洗，直至PBS沖洗液中不再出現(xiàn)細(xì)胞碎片，然后對微載體進(jìn)行滅菌處理；
(2)細(xì)胞培養(yǎng)將上述滅菌處理后的微載體放入T75細(xì)胞瓶，，以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基+10% 胎牛血清培養(yǎng)為溶液，細(xì)胞接種的密度為2 X IO5個/毫升，接種時溶液體積為15毫升，微載體的最終密度為I. Omg/ml，培養(yǎng)條件為37°C，在加入細(xì)胞后，每間隔3分鐘晃動混勻微載體與細(xì)胞，持續(xù)3小時后，掉到細(xì)胞液，然后加入新的含有10%的Hyclone胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，微載體在處理后和培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行顯微鏡觀察并且拍照；
(3)重復(fù)試驗(yàn)重復(fù)上述(I)和(2)步驟十次，每次重復(fù)后的微載體在處理后和培養(yǎng)結(jié)束后用40X40倍的顯微鏡觀察并且拍照。實(shí)施例3
I.載體Biosilon,來源于Nunc公司，其材質(zhì)為Polystyrene (聚苯乙烯)，比表面積為 160 cm2/ml。2.實(shí)驗(yàn)具體操作如下
(I)載體回收將新購買的Biosilon微載體經(jīng)過一次使用后用100目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾除去溶液，并放置到容器中，加入2倍于微載體體積的濃度為O. IM并含有濃度為IOmM的 EDTA的PBS溶液，再用醫(yī)用酒精稀釋至載體的體積濃度至20%，進(jìn)行中速攪拌，攪拌過程中過濾去掉溶劑并更換O. IM并含有濃度為IOmM的EDTA的PBS溶液一次，繼續(xù)攪拌，攪拌結(jié)束后，用200目的篩網(wǎng)過濾回收微載體，同時從溶液中取出從微載體上脫落的的細(xì)胞碎片； 過濾后收集的微載體放入到容器中，然后加入I倍于微載體體積的濃度為IM氫氧化鈉溶液，加入同時攪拌，攪拌過程中每隔15分鐘用顯微鏡檢測微載體表面,至貼在微載體表面絕大多數(shù)細(xì)胞碎片都脫落；停止攪拌，再用200目的篩網(wǎng)回收微載體，并用O. IM的PBS沖洗載體，至溶液的PH值為7，之后將微載體轉(zhuǎn)入到容器中，加入2倍于微載體體積的質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶-EDTA溶液進(jìn)行消化處理，消化期間不斷攪拌，并用顯微鏡觀察微載體表面，20小時后，微載體表面干凈，停止消化并用濃度為O. IM的PBS溶液沖洗，直至PBS沖洗液中不再出現(xiàn)細(xì)胞碎片，然后對微載體進(jìn)行滅菌處理；
6(2)細(xì)胞培養(yǎng)將上述滅菌處理后的微載體放入T75細(xì)胞瓶，以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基+10% 胎牛血清培養(yǎng)為溶液，細(xì)胞接種的密度為2 X IO5個/毫升，接種時溶液體積為15毫升，微載體的最終密度為I. Omg/ml，培養(yǎng)條件為37°C，在加入細(xì)胞后，每間隔4分鐘晃動混勻微載體與細(xì)胞，持續(xù)3小時后，掉到細(xì)胞液，然后加入新的含有10%的Hyclone胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，微載體在處理后和培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行顯微鏡觀察并且拍照；
(3)重復(fù)試驗(yàn)重復(fù)上述(I)和(2)步驟十次，每次重復(fù)后的微載體在處理后和培養(yǎng)結(jié)束后用40X40倍的顯微鏡觀察并且拍照。本發(fā)明分別對新載體、第四次、第八次、第十次處理后的載體和其相應(yīng)培養(yǎng)后細(xì)胞在載體上生長情況的顯微鏡照來說明這種微載體處理方法對微載體處理的效果及其對細(xì)胞在微載體上生長的影響。圖1-8是本發(fā)明實(shí)施例2中對應(yīng)的顯微鏡照片，顯微鏡照片結(jié)果顯示微載體在經(jīng)過四次處理后沒有明顯的損壞，還可以繼續(xù)使用，當(dāng)經(jīng)過8次回收處理之后，開始出現(xiàn)裂縫和穿洞，之后可以繼續(xù)使用，效果不佳，到第10次時已經(jīng)不能在繼續(xù)使用了 ；因此本發(fā)明的處理方法處理后的微載體可以使用8次左右。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其架構(gòu)形式能夠靈活多變，可以派生系列產(chǎn)品。只是做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于其包括以下步驟(1)篩選使用60-300目的篩網(wǎng)過濾除去溶液，回收微載體，并放置到容器中；(2)溶劑稀釋向上述裝有微載體的容器中加入2-5倍于微載體體積的濃度為O.IM的并含有濃度為10-50mM的EDTA的PBS溶液，再用醫(yī)用酒精稀釋至載體的體積濃度至20% ；(3)攪拌將上述溶液進(jìn)行中速攪拌；(4)過濾攪拌結(jié)束后，用篩網(wǎng)過濾回收微載體，同時從溶液中取出從微載體上脫落的的細(xì)胞碎片；(5)氫氧化鈉處理將上述過濾后收集的微載體放入到容器中，然后加入1-2倍于微載體體積的濃度為O. I-IM氫氧化鈉溶液，加入同時攪拌，攪拌過程中用顯微鏡檢測微載體表面，至貼在微載體表面80-90%細(xì)胞碎片脫落，停止攪拌；(6)調(diào)節(jié)pH值攪拌停止后用篩網(wǎng)回收微載體，并用O.IM的PBS沖洗載體，至溶液的 pH 值為 6. 5-7. 5 ；(7)酶消化處理將上述微載體轉(zhuǎn)入到容器中，加入1-2倍于微載體體積的蛋白酶溶液進(jìn)行消化處理，消化期間不斷攪拌，并用顯微鏡觀察微載體表面，至微載體表面干凈后停止消化；(8)沖洗將上述消化完成后的微載體用濃度為O.IM的PBS沖洗，直至PBS沖洗液中不再出現(xiàn)細(xì)胞碎片；(9)滅菌處理將上述沖洗后的微載體進(jìn)行滅菌處理，之后用于細(xì)胞培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述裝微載體的容器為娃化玻璃容器。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述(3)步驟中，中速攪拌的速度為60-120轉(zhuǎn)/分，攪拌時間為2-4小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述(7)步驟中，攪拌速度為10-50轉(zhuǎn)/分。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述網(wǎng)篩為150-200目的不銹鋼網(wǎng)篩。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述蛋白酶溶液為質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶-EDTA溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述(7)步驟中，消化在室溫下進(jìn)行，消化時間為10-20h，攪拌速度為10-120轉(zhuǎn)/分，在消化期間每隔1-2小時用顯微鏡觀察微載體表面I次。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述滅菌處理采用高壓滅菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法，其特征在于所述(3)步驟中，攪拌期間過濾并按照(2)步驟更換溶劑1-2次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微載體的回收處理方法，具體涉及一種提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法；其包括篩選、溶劑稀釋、攪拌、過濾、氫氧化鈉處理、調(diào)節(jié)pH值、酶消化處理、沖洗及滅菌處理步驟。本發(fā)明所述的提高微載體重復(fù)使用次數(shù)的回收處理方法采用多個步驟結(jié)合，達(dá)到最佳的處理效果，其不僅明顯增加微載的使用次數(shù)，節(jié)約了使用成本；而且經(jīng)過多次處理后的微載體使用時對細(xì)胞在微載體上貼壁生長情況并沒出現(xiàn)明顯影響。本發(fā)明所述的處理方法可廣泛適用各種微載體的回收。
文檔編號C12N5/071GK102586173SQ201210075589
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者張東霞, 徐家華, 施維松, 湯欽, 陳瑞愛 申請人:廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司