專利名稱：一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列，更具體涉及一種從腐爛經(jīng)線蟲中篩選出的一個新基因FAD (Fatty Acid Desaturase)的氨基酸序列,本發(fā)明還涉及該基因的用途。
背景技術(shù)：
脂肪酸去飽和酶是細胞膜的主要成分，對生物膜的生化活性及維系細胞的生物學(xué)功能起重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸去飽和酶在秀麗小桿線蟲(C.elegans)抗寒過程中作用非常關(guān)鍵，尤其硬脂酰-CoA去飽和酶，該酶在與輔酶A相結(jié)合的飽和脂肪酸的A-9引入雙鍵形成單不飽和脂肪酸，在生物體內(nèi)的脂類代謝以及能量消耗過程中起著關(guān)鍵作用。目前秀麗小桿線蟲共克隆得到7條脂肪酸去飽和酶基因FAT-I到FAT-7。其中FAT-5、FAT-6、FAT-7都編碼A-9脂肪酸去飽和酶，F(xiàn)AT-5編碼A-9脂肪酸去飽和酶可以催化軟脂酸變成棕櫚油酸，F(xiàn)AT-6(FAT-7)編碼A-9脂肪酸去飽和酶可以催化硬脂酸形成油酸。腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor Thorne)墊刃目(Tylenchida),?？?Anguinidae) , 線蟲屬(Ditylenchus Filip jev),是一類重要的植物病原線蟲,主要為害寄主植物的地下部，種類多，分布廣，危害重。目前已報道的腐爛莖線蟲寄主植物達90多種，主要寄生為害甘薯。我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，馬鈴薯腐爛莖線蟲引起的甘薯莖線蟲病已經(jīng)成為危害我國甘薯生產(chǎn)的重要病害，嚴(yán)重者發(fā)病率可高達80%，發(fā)病地塊一般減產(chǎn)20-30 %，嚴(yán)重者達50 %以上，甚至絕產(chǎn)。該病不僅在田間為害直接造成減產(chǎn)，而且還引起儲藏后期爛窖。目前甘薯莖線蟲病在我國的北京、天津、山東、河北、河南、江蘇、浙江、福建、遼寧、甘肅等省市均有發(fā)生。該病害的防治難點就是該線蟲具有很強的抗逆性，土壤中越冬蟲量的存活情況直接影響甘薯的產(chǎn)量。該線蟲具有很強的抗低溫能力，有研究結(jié)果表明，植物組織中的馬鈴薯腐爛莖線蟲在_2°C情況下能存活，但在-4. 5°C條件下死亡。但是林茂松等從_6°C至_7°C的病土塊分離得到大量的腐爛莖線蟲。本研究小組也對該線蟲的耐低溫能力進行了研究，將保存在40%甘油的染病薯塊，分別存放在-20°C和_70°C的低溫下，180天后該線蟲存活率仍然可以達到80%以上。目前，對該病害的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、致病機制以及品種抗病性和防治措施等方面，而對該線蟲的抗低溫機制研究甚少。雖然對線蟲耐寒性的生理、生化機制研究近些年來也雖然取得了一些的進展，但是目前線蟲的耐寒機制還不是很清楚。Brock發(fā)現(xiàn)把秀麗小桿線蟲FAT-6和FAT-7基因同時沉默，突變體在10°C低溫處理，存活率不到1%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施本發(fā)明所述的基因FAD是從腐爛莖線蟲中克隆到的一個新基因，其cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列如下。該基因cDNA全長1183bp，自IlObp至1108bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼333個氨基酸，5’非編碼區(qū)長109bp，3’非編碼區(qū)長75bp,有多聚核苷酸尾巴。FAD基因編碼蛋白的氨基酸序列如下MSTTVTQTVTVDPTIKEQFLSADLDDMEQLRESAKKVNFKPQIVWRNVILFIALHAGALVGLYQFAFTAKWLTCVWCVVCffVISGVGITAGAHRLffSHKSYKAKLPLKIILVAMNCVSFQNDIIEffSRDHRCHHKWTDTDADPHNVNRGFFFSHMGWLLTKKHPKIKEMGAKLDMSDLTSDPVLAFQRKFYLPLVVLGCFLFPTAVPVWGWGENAffIAFYTAALFRYAFTLHATffFINSAAHTFGYRPYDVNISPAES
VWTTVTAFGEGGHNYHHTFPQDYRTSEMSAMFNFTKLFIDFFAKIGWAYDLRTMDDASIERQMG
KQLGQLKLKGH通過RNAi技術(shù)沉默該基因，降低植物線蟲耐低溫能力，從而壓低越冬蟲源，為進一歩控制該病害的流行發(fā)生提供新的防治策略。鑒于該基因在植物寄生線蟲中首次報道，目前人類對此基因的認(rèn)識和了解僅限于本發(fā)明所作的科學(xué)工作研究。由于該基因為致病性基因，從而可以應(yīng)用于抗線蟲轉(zhuǎn)基因作物的研究，為培育抗線蟲植物提供了ー種新的途徑和策略。本發(fā)明的優(yōu)點通過該馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列，來研究該基因在線蟲抗低溫中的作用，進而采取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。


圖I脂肪酸去飽和酶基因擴增結(jié)果的電泳圖(M為標(biāo)準(zhǔn)分子量)。具體實施方法I. Trizol法提取線蟲總RNA參照TRIzol Reagents (康為世紀(jì))使用說明，提取樣品總RNA。取IOOmg線蟲，液氮研磨，加入Iml Trizol勻衆(zhòng),室溫靜置5min,加入200 μ I的氯仿,室溫靜置5min,12，OOOXg離心15min。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，室溫靜置IOmin, 12, OOOXg離心IOmin0向沉淀中加入Iml的75%こ醇清洗沉淀，12, OOOXg于4°C離心5min。棄上清保留沉淀，干燥，用DEPC處理水溶解附著于管底的總RNA。取兩份I μ I分別用分光光度計電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。2. RT-PCR 擴增取線蟲RNA 3μ 1，合成第一鏈cDNA :加入Random 6引物I μ 1，DEPC處理水6μ 1，70°C保溫5min后，冰上速冷2min ;然后在終體積為10 μ I的反應(yīng)體系中，加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/LTris-HCl, ρΗ8· 3 ；375mmol/L KCl ；30mmol/L MgCl2) 3 μ I、dNTP(10mmol/L)0. 5 μ I、RNase Inhibitor (40U/μ 1)0. 5μ I 和 RNase M-MLV (200U/ul)0. 5μ I, DEPC 處理水 0· 5 μ 1，42°C 保溫 lh，70°C IOmin 合成第一鏈 cDNA。取 2μ I 第一鏈cDNA加入dNTP O. 5 μ 1、PCR引物O. 5 μ I、反應(yīng)緩沖液2. 5 μ I和Taq DNA聚合酶O. 5 μ I于25 μ I反應(yīng)體系中進行如下PCR循環(huán)95°C預(yù)變性4min后，以94 °C 40s,60 °C lmin、72 °C Imin反應(yīng)30個循環(huán)后，72 °C延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取8μ I電泳檢測。合成的cDNA連入pMD18-T載體中(TaKaRa)并轉(zhuǎn)化入T0P-10感受態(tài)細胞中。鋪平板(內(nèi)含Amp)，37 °C培養(yǎng)過夜。3.測序及序列分析該基因cDNA全長1183bp，自IlObp至1108bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼333個氨基酸，5’非編碼區(qū)長109bp，3’非編碼區(qū)長75bp，有多聚核苷酸尾巴。測序結(jié)果通過tBLASTx比對分析表明秀麗隱桿線蟲肪酸去飽和酶基因 FAT-5，F(xiàn)AT-6和FAT-7氨基酸序列序列的同源性分別達到62%、64%和64%。
權(quán)利要求
1.一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列，其特征在于FAD基因CDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列，該基因cDNA全長1183bp，自IlObp至1108bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼333個氨基酸，5’非編碼區(qū)長109bp，3’非編碼區(qū)長75bp，有多聚核苷酸尾巴。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種線蟲耐寒機制相關(guān)因子的基因序列，其特征在于FAD基因編碼蛋白的氨基酸序列MSTTVTQTVTVDPTIKEQFLSADLDDMEQLRESAKKVNFKPQIVWRNVILFIALHAGALVGLYQFAFTAKWLTCVWCVVCffVISGVGITAGAHRLffSHKSYKAKLPLKIILVAMNCVSFQNDIIEWSRDHRCHHKWTDTDADPHNVNRGFFFSHMGWLLTKKHPKIKEMGAKLDMSDLTSDPVLAFQRKFYLPLVVLGCFLFPTAVPVffGWGENAWIAFYTAALFRYAFTLHATffFINSAAHTFGYRPYDVNISPAESVWTTVTAFGEGGHNYHHTFPQDYRTSEMSAMFNFTKLFIDFFAKIGWAYDLRTMDDASIERQMGKQLGQLKLKGH。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列在基因RNAi防治線蟲病害中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列在把飽和脂肪酸催化合成不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列在抗線蟲轉(zhuǎn)基因作物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因序列，該基因cDNA全長1183bp，自110bp至1108bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼333個氨基酸，5’非編碼區(qū)長109bp，3’非編碼區(qū)長75bp，有多聚核苷酸尾巴，該基因在線蟲耐寒作用機制中起作用，同時還在抗線蟲轉(zhuǎn)基因作物方面應(yīng)用。
文檔編號C12N15/53GK102634526SQ20121007565
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者萬景旺, 張紅艷, 趙雷, 邵穎, 魏利輝 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院