專利名稱：調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的蛋白和基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー個(gè)調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的關(guān)鍵基因SbSnRKl a I及其應(yīng)用。該基因在調(diào)節(jié)低溫貯藏的馬鈴薯塊莖低溫糖化程度方面具有顯著的功能，可以在馬鈴薯貯藏后炸片加工方面進(jìn)行應(yīng)用。
背景技術(shù)：
馬鈴薯油炸加工對(duì)塊莖品質(zhì)的要求非常嚴(yán)格，除外觀品質(zhì)外，更主要的是要求塊莖高淀粉含量和低還原糖含量低于O. 25%(鮮重)并耐低溫貯藏。原因在于，在油炸過(guò)程中，塊莖內(nèi)的還原糖與氮化合物的α-氨基酸進(jìn)行“ Mai I lard Reaction”致使薯片或薯?xiàng)l表面顔色加深，從而嚴(yán)重影響加工品質(zhì)(屈冬玉等，2001)。為了延長(zhǎng)加工周期以及抑制常溫貯藏導(dǎo)致的塊莖品質(zhì)下降等現(xiàn)象，在馬鈴薯加工業(yè)中常將塊莖長(zhǎng)期貯藏在低溫下。然而，低溫加速塊莖內(nèi)淀粉裂解轉(zhuǎn)化還原糖(葡萄糖和果糖)，這種“低溫誘導(dǎo)的塊莖糖化”現(xiàn)象是大多數(shù)品種不適合加工的主要原因。因此，馬鈴薯塊莖低溫糖化的研究既有解釋低溫糖化代謝過(guò)程中的分子機(jī)理作用，又有對(duì)馬鈴薯低溫貯藏后加工的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值。馬鈴薯塊莖低溫糖化主要是由于低溫改變了塊莖內(nèi)淀粉-糖代謝的平衡，導(dǎo)致蔗糖在塊莖中累積，蔗糖又進(jìn)ー步轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖所致(Isherwood，1973)。研究表明，在此代謝途徑中轉(zhuǎn)化酶(Irwertase)是直接導(dǎo)致還原糖積累的關(guān)鍵酶。早在Uppal和Verma (1990)的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏期間轉(zhuǎn)化酶活性與還原糖含量呈極顯著相關(guān)(r=0.821)。后續(xù)大量的研究同樣表明，低溫貯藏塊莖中轉(zhuǎn)化酶活性與還原糖含量顯著相關(guān)(Richardson et al. 1990; Cheng et al. 2004; McKenzie et al. 2005)。SnRKl (sucrose non-fermenting-l-re lated protein kinase 植物鹿糖非發(fā)酵-I相關(guān)蛋白激酶)作為植物蛋白激酶家族中ー個(gè)重要家族，其與酵母中SNFl (sucrosenon-fermenting-1, SNFl)和哺乳動(dòng)物中的 AMPK(AMP_activated protein kinase, AMPK)同源并具有與它們相似和自身獨(dú)特的功能，在植物體內(nèi)普遍存在三個(gè)亞家族。SnRKl在植物體內(nèi)的研究今年來(lái)發(fā)展非常迅速，SnRK在植物的碳水化合物代謝和多種環(huán)境脅迫，ABA途徑，抗病抗逆，甚至產(chǎn)量和品質(zhì)都是關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)酶(Halford andHey 2009; Hey et al. 2010; Coello et al. 2011; Halford et al. 2011)。在馬鈴薯 中已經(jīng)克隆到α，β亞組分別為StubSNFl和Gal83，馬鈴薯SnRKl與塊莖的萌發(fā)(Halfordet al. 2003)，淀粉積累，葡萄糖的含量下(McKibbin et al. 2006)密切相關(guān)并影響著糖代謝途徑中多種酶例如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的表達(dá)(Tiessen et al. 2003)。而關(guān)于SnRKl的互作蛋白也在逐漸深入研究中(Beczner et al. 2010; Shen et al. 2011)。但是在低溫糖化代謝過(guò)程中的影響卻未見相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)，因此轉(zhuǎn)化酶，轉(zhuǎn)化酶抑制子與SnRKl各亞基蛋白之間的互作調(diào)控關(guān)系對(duì)低溫糖化的影響具有很好的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的SbSnRKl a I基因是以抗低溫糖化的野生種品系5 berthaultii的優(yōu)質(zhì)全長(zhǎng)cDNA酵母雙雜交文庫(kù)為基礎(chǔ)，以轉(zhuǎn)化酶為鉺蛋白雜交此文庫(kù)篩選獲得的潛在互作蛋白候選基因之一。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明SnRKl蛋白激酶a和0亞組(SbSnRKl a 1，StSnRKl^ I)和轉(zhuǎn)化酶，轉(zhuǎn)化酶抑制子之間存在一對(duì)一的特異選擇性互作關(guān)系，同時(shí)SbSnRKl a I對(duì)低溫糖化起到了極顯著的調(diào)節(jié)作用。該互作關(guān)系以及SbSnRKl a I對(duì)低溫糖化的影響在國(guó)內(nèi)外尚均未有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)。
鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的a 7基因和蛋白及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一個(gè)方面提供了一種SbSnRKl a I蛋白，它的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了編碼該SbSnRKl a I蛋白的多核苷酸序列；其中優(yōu)選的多核苷酸為SEQ ID NO: I。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了包含上述多核苷酸序列的表達(dá)載體；其中優(yōu)選的表達(dá)載體是pMD18-T載體或pBIC載體。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了包含上述表達(dá)載體的細(xì)胞；其中優(yōu)選的細(xì)胞是大腸桿菌DH5a或農(nóng)桿菌LBA4404。本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在不適宜低溫貯藏后炸片加工的馬鈴薯品系中超量表達(dá)SbSnRKl a I基因，可顯著提高該轉(zhuǎn)基因植株的抗低溫糖化的能力，降低低溫貯藏后的炸片色澤程度，使其4°C貯藏一個(gè)月后仍能基本達(dá)到商業(yè)加工的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)基因改良后的馬鈴薯品系，更加耐低溫貯藏，延長(zhǎng)了從采后到炸片加工的低溫可貯藏時(shí)間。特別適用于馬鈴薯的油炸加工，從而有利于加工品種的改良，新加工品種的創(chuàng)建，商業(yè)化生產(chǎn)成本的降低以及原材料利用率的提聞。因此，本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了上述的氨基酸序列SEQ ID N0:2或多核苷酸序列SEQ ID NO: I在馬鈴薯抗低溫糖化中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用克隆的a 7基因在馬鈴薯中超量表達(dá)，超量mk SbSnRKl a I基因后可極顯著提高馬鈴薯低溫貯藏過(guò)程中的抗低溫糖化的能力。本發(fā)明通過(guò)在馬鈴薯體內(nèi)超量表達(dá)該基因可以提高植物的抗低溫糖化能力，在馬鈴薯體內(nèi)干涉該基因的表達(dá)可以使植物對(duì)低溫糖化更敏感。


圖I -.SbSnRKl a I基因超量表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。圖2 pBIC載體結(jié)構(gòu)圖。圖3 ,SbSnRKl a I轉(zhuǎn)基因株系薯塊低溫4°C貯藏30天炸片色澤指數(shù)。圖4 ,SbSnRKl a I轉(zhuǎn)基因株系薯塊低溫4°C貯藏30天還原糖含量檢測(cè)。圖5 ,SbSnRKl a I轉(zhuǎn)基因株系薯塊低溫4°C貯藏30天轉(zhuǎn)化酶活性檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出更詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。 本發(fā)明克隆的基因被命名為5^免欣7 σ 2，可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法或其他轉(zhuǎn)基因方法把基因轉(zhuǎn)入植物中，通過(guò)篩選鑒定獲得的轉(zhuǎn)基因植株或株系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過(guò)在馬鈴薯體內(nèi)超量表達(dá)該基因可以提高植物的抗低溫糖化能力，在馬鈴薯體內(nèi)干涉該基因的表達(dá)可以使植物對(duì)低溫糖化更敏感，其在抗逆方面的應(yīng)用均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。I本發(fā)明SbSnRKl a I基因的克隆與序列分析
本發(fā)明中的基因是通過(guò)對(duì)構(gòu)建的馬鈴薯抗低溫糖化野生種品系
S.berthaultii全長(zhǎng)cDNA酵母雙雜交文庫(kù)以轉(zhuǎn)化酶為鉺蛋白分別進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)所獲得的，發(fā)現(xiàn)該基因與轉(zhuǎn)化酶存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系。文庫(kù)酵母雙雜以及鑒定篩選結(jié)果證明，SbSnRKl 〃 2基因的RD區(qū)與轉(zhuǎn)化酶在酵母體內(nèi)能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)互作并呈現(xiàn)很高的陽(yáng)性。設(shè)計(jì)擴(kuò)增SbSnRKl σ 2基因全長(zhǎng)cDNA序列引物
正向引物為5’ -ATGGACGGAACAGCAGTGCAAGGCA-3’
反向引物為5’ -AAGTACTCGAAGCTGAGCAAGAAAA-3，
通過(guò)PCR方法，從抗低溫糖化的馬鈴薯野生種品系5 berthaultii的塊莖cDNA中擴(kuò)增出SbSnRKl α I全長(zhǎng)cDNA序列。擴(kuò)增方法為先用試劑盒(購(gòu)自上海生エ公司，中國(guó))抽提馬鈴薯塊莖總RNA，具體過(guò)程參見說(shuō)明書，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司，日本)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為總cDNA，具體過(guò)程參見說(shuō)明書，再以此為模板用以上正反向引物用LA酶(購(gòu)自Takara公司，日本)擴(kuò)增SbSnRKl α I基因的全長(zhǎng)，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶后，用膠回收試劑盒(購(gòu)自上海生エ公司，中國(guó)，具體過(guò)程參見說(shuō)明書)回收目標(biāo)條帶，克隆至PMD18-T載體(購(gòu)自Takara公司，日本)，取5yL連接產(chǎn)物進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)(參照J(rèn).薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)，涂布于新配置的含有氨節(jié)青霉素/異丙基_β -D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3- Π引哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固體平板上，37で培養(yǎng)過(guò)夜，挑選白斑若干，于含Amp 50 mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，于37 0C 200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至渾濁，用引物PCR檢測(cè)菌液是否為陽(yáng)性，送三個(gè)陽(yáng)性克隆至華大基因生物技術(shù)公司完成測(cè)序工作。測(cè)序結(jié)果顯示，所克隆的SbSnRKl σ 7的cDNA全長(zhǎng)為1545bp (見序列表中SEQ IDNO: I所示),編碼514個(gè)氨基酸(SEQ ID N0:2所示)。用GenBank的Blastn分析顯示，與已知的馬鈴薯StubSNFl(U83797. 4)的cds區(qū)域序列相似性有99 %，有17個(gè)堿基的不同。該蛋白質(zhì)與馬鈴薯StubSNFl蛋白(NP_001233965. I)的氨基酸相似性同樣高達(dá)99 %，在分別在第286、334、438和462位有4個(gè)氨基酸的區(qū)別。預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)分子量為58. 881KD，等電點(diǎn)為8. 61,用SignalP預(yù)測(cè)沒(méi)有找到序列前導(dǎo)序列或特殊區(qū)室革巴蛋白信號(hào)，Expasy蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示無(wú)明顯跨膜區(qū)。 2 SbSnRKl a I基因的載體構(gòu)建
在擴(kuò)增的SbSnRKl a I基因的引物兩側(cè)分別加上及和feci酶切位點(diǎn)，隨后以已構(gòu)建的pMD18-T載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆重新至pMD18-T載體，具體步驟見本發(fā)明的SbSnRKl a I基因的克隆與序列分析部分。隨后以BernHl和feci雙酶切帶有目的基因全長(zhǎng)的PMD18-T載體，同時(shí)以及麗TI和5^1雙酶切以塊莖優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子CIPP替換了 35S啟動(dòng)子的PBI121載體pBIC，各自的酶切產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒(購(gòu)自上海生工公司，中國(guó))回收目標(biāo)條帶，并將目的基因片段與pBIC載體大片段以0.8:1的比例混合，加入T4DNA連接酶(購(gòu)自Takara公司)1U，I X反應(yīng)緩沖液，無(wú)菌水補(bǔ)充至10 ii L體系，16°C鏈接10小時(shí)，取5 ii L連接產(chǎn)物進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，涂布于新配置的卡那(Km) 50 mg/L抗性平皿上篩選陽(yáng)性克隆并酶切檢測(cè)。pBIC的載體圖以及超量表達(dá)載體構(gòu)建流程見圖I和圖2。對(duì)獲得的重組質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化儀在1800V的電壓下轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，用含利福平(Rif) 100mg/L，卡那(Km)50 mg/L的YEB固體抗性平皿篩選轉(zhuǎn)化陽(yáng)性斑，挑取若干個(gè)陽(yáng)性斑于含利福平(Rif)100mg/L，卡那(Km)50 mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中28°C，150r/min培養(yǎng)4小時(shí)，取I y L做模板進(jìn)行重組質(zhì)粒的PCR陽(yáng)性檢測(cè)，確認(rèn)為陽(yáng)性的菌株保存用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化。3遺傳轉(zhuǎn)化
將生長(zhǎng)7-9周、直徑0.5 cm左右的試管薯切成1-2 mm厚的薄片，在含有相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10 min。浸染結(jié)束后取出薯片，用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液。轉(zhuǎn)入灌有共培養(yǎng)培養(yǎng)基 A1(MS 基本培養(yǎng)基+3% 蔗糖+1 mg/L IAA+0. 2 mg/L GA3+0. 5 mg/L BA+2 mg/L ZT)的培養(yǎng)皿中，于24°C暗培養(yǎng)2 d。暗培養(yǎng)后，薯片再轉(zhuǎn)到灌有再生培養(yǎng)基A2 (Al+ 75 mg/LKam+400 mg/L Cef)的培養(yǎng)皿中，置于光照強(qiáng)度2000 lux,光周期16 h/d,溫度24°C的條件下培養(yǎng)直到抗性芽再生。待抗性芽長(zhǎng)出達(dá)0.5-1 cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基A3(MS基本培養(yǎng)基+3%蔗糖+50 mg/L Kam+200 mg/L Cef，pH 5. 8)，轉(zhuǎn)化成功的小芽因?yàn)橛蠯am抗性，能在A3上生根。4 SbSnRKl a I基因的功能鑒定
SbSnRKl a I基因在馬鈴薯抗低溫糖化方面的功能，申請(qǐng)人將13個(gè)超量基因轉(zhuǎn)基因株系(PS株系)和對(duì)照植株栽培種鄂馬鈴薯3號(hào)(Ep3)同時(shí)于2011下半年種植于華中蔬菜分中心基地同一個(gè)大棚中，每個(gè)株系種植24盆，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，薯塊成熟度高，轉(zhuǎn)基因株系在田間農(nóng)業(yè)形狀上與對(duì)照并無(wú)顯著差異。取各轉(zhuǎn)基因株系單薯重>50g無(wú)病斑無(wú)機(jī)械損傷的塊莖分別在常溫20°C和低溫4°C下貯藏30天，進(jìn)行油炸薯片和還原糖，轉(zhuǎn)化酶酶活等測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)不同溫度不同貯藏時(shí)間下各超量表達(dá)株系與對(duì)照之間的的炸片色澤指數(shù)做比較，直觀的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，，對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系之間20°C貯藏30天炸片色澤均無(wú)明顯差別。但是4°C貯藏下，各轉(zhuǎn)基因株系的炸片色澤均明顯低于對(duì)照株系Ep3，其中PS3，PS8，PS15表現(xiàn)尤 為明顯(圖3)。此結(jié)果表明超量表達(dá)a 7對(duì)低溫糖化均起到了非常明顯的抑制作用，使得原本不適用于低溫貯藏后炸片加工的栽培種Ep3獲得了貯藏I個(gè)月后仍能達(dá)炸片色澤指數(shù)較低的能力。
還原糖的含量測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系與対照的差異更為顯著，與對(duì)照相比，低溫貯藏下超量株系的各株系大多比對(duì)照明顯低(圖4)，其中PS3表現(xiàn)最為明顯，4°C 30天貯藏時(shí)還原糖含量下降程度超過(guò)90%，即低溫下轉(zhuǎn)基因株系中還原糖的積累速率非常慢，這也是炸片色澤很低的主要直接原因。同樣轉(zhuǎn)化酶酶活水平也顯示出來(lái)同樣的趨勢(shì)，4°C貯藏 過(guò)程中在超量株系中轉(zhuǎn)化酶的酶活極顯著低于對(duì)照(圖5)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果證明，轉(zhuǎn)％免欣7ひ7基因的馬鈴薯在抗低溫糖化方面效果極其顯著，是ー個(gè)在馬鈴薯抗低溫糖化應(yīng)用上非常有潛力的功能基因。
權(quán)利要求
1.StSnRKl α蛋白，它的氣基酸序列為序列表SEQ ID NO:2所不。
2.編碼StSnRKla蛋白的多核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于該序列為SEQID NO: I。
4.包含權(quán)利要求2或3所述多核苷酸序列的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于它是PMD18-T載體或pBIC載體。
6.包含權(quán)利要求4或5所述表達(dá)載體的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其特征在于它是大腸桿菌DH5a或農(nóng)桿菌LBA4404。
8.權(quán)利要求I所述的氨基酸序列SEQID N0:2在馬鈴薯抗低溫糖化中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸序列SEQID NO: I在馬鈴薯抗低溫糖化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一個(gè)調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的關(guān)鍵基因StSnRK1α及其應(yīng)用。克隆到與馬鈴薯低溫糖化顯著相關(guān)的基因StSnRK1α，該基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示。生物學(xué)功能驗(yàn)證和轉(zhuǎn)基因株系表型證明，本發(fā)明的StSnRK1α基因在馬鈴薯抗低溫糖化中有顯著功效，為馬鈴薯抗低溫糖化的機(jī)理研究以及現(xiàn)有品種的改良提供了新的有效途徑。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102634497SQ201210077910
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者劉勛, 宋波濤, 林原, 柳俊, 謝從華 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)