專利名稱：用于甲型肝炎病毒核酸捕捉、檢測(cè)和定量的寡核苷酸的鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒診斷領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及準(zhǔn)確診斷甲型肝炎病毒感染和檢測(cè)生物樣品中甲型肝炎病毒的核酸分析方法。
背景技術(shù)：
甲型肝炎是ー種腸道傳染病，可引起發(fā)熱、不適、食欲缺乏、惡心、腹部不適及黃疸。引起甲肝的原因是甲肝病毒感染，這是ー種小的無包膜的球形病毒，屬于小核糖核酸病毒科肝炎病毒屬。HAV基因組由一條單鏈線性RNA分子組成，長(zhǎng)度為7. 5kb，其編碼的多聚蛋白前體經(jīng)處理后形成結(jié)構(gòu)蛋白并具有病毒復(fù)制所需要的酶活性(Najarian等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2627-2632(1985))。HAV 在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)狀況差，產(chǎn)生的病毒數(shù)很少，不能引起細(xì)胞病變。雖然從病毒顆粒中提取的HAV RNA可以感染細(xì)胞培養(yǎng)物(Locarnini 等，J. Virol. 37 :216-225(1981)和 Siegl 等，J. Gen. Virol. 57 331-341 (1981))，但是直接對(duì)病毒基因組進(jìn)行操作比較困難，因?yàn)椴《净蚪M是由RNA構(gòu)成的。HAV編碼4種衣殼蛋白(A、B、C和D)，這些蛋白含有能被感染個(gè)體的抗體識(shí)別的主抗原性結(jié)構(gòu)域。除了衣殼蛋白以外，也有報(bào)道證明在結(jié)構(gòu)蛋白如2A和病毒編碼蛋白酶中也存在抗原性結(jié)構(gòu)域。其他重要的HAV抗原性結(jié)構(gòu)域位于衣殼蛋白前體Pl和2A之間的連接處。HAV通常是由糞-ロ途徑傳播的，通過人與人的接觸或攝入被污染的食物或水而感染。但是，輸入血漿產(chǎn)物也可能是HAV的傳播途徑。由于缺乏脂質(zhì)包膜，因此HAV很難通過物理化學(xué)方法滅活，而且能夠耐受常規(guī)的血制品加熱消毒。和細(xì)小病毒B19 —祥，HAV也可以通過輸入血漿衍生物進(jìn)行傳播。開發(fā)敏感的高特異診斷方法來鑒定感染個(gè)體內(nèi)HAV抗原和/或抗體的以及開發(fā)核酸檢測(cè)方法來檢測(cè)病毒血樣以避免其傳播是公共衛(wèi)生領(lǐng)域一大課題。Robertson等人的美國(guó)專利No. 5，290，677描述了利用抗體捕捉完整HAV病毒的方法。分離RNA，制備其cDNA。然后用根據(jù)HAV基因組上VPl和VP3衣殼區(qū)的引物PCR擴(kuò)增該cDNA，擴(kuò)增出的產(chǎn)物用根據(jù)基因組同一區(qū)的探針進(jìn)行檢測(cè)。引物和探針的選擇根據(jù)所要檢測(cè)的HAV的基因型來確定。目前，仍然需要開發(fā)出ー種可靠的診斷試驗(yàn)方法來檢測(cè)病毒血樣中的甲肝病毒，以避免病毒通過血液或血漿衍生物傳播，或者通過人與人之間的近距離接觸傳播。發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種靈敏可靠的核酸診斷方法用于檢測(cè)潛在感染個(gè)體、來源的生物樣品中的HAV。本文所描述的方法用樣品中提取的核酸作為模板通過PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)以及5’核酸酶法如TaqMan 技術(shù)來擴(kuò)增HAV序列上的保守基因組區(qū)。這些方法可檢測(cè)病毒血樣中的HAV。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明利用據(jù)HAV基因組5’ UTR區(qū)設(shè)計(jì)的引物和探針。另外，本發(fā)明的方法還可實(shí)現(xiàn)ー鍋化分析(one-pot analysis),即捕獲的樣品核酸可在ー個(gè)容器內(nèi)擴(kuò)增和檢測(cè)。利用本發(fā)明的方法可鑒定被感染的樣品，避免被感染的樣品被輸入以及避免這些感染的樣品被制成血液衍生物。 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中HAV感染的方法，該方法包括(a)在高離液鹽濃度下或適于固相支持物與靶核酸序列形成復(fù)合物的雜交條件下使生物樣品與固相支持物接觸；(b)從樣品中分離(a)步驟后的固相支持物；(c)擴(kuò)增可能存在的靶核酸序列；以及(d)檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列，其存在表明樣品中存在HAV。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物樣品中HAV感染的方法，該方法包括(a)在高離液鹽濃度下或適于固相支持物與靶核酸序列形成復(fù)合物的雜交條件下使生物樣品與固相支持物接觸；(b)從樣品中分離(a)步驟后中的固相支持物；以及(c)利用據(jù)HAV基因組5’ UTR設(shè)計(jì)的引物例如具有SEQ ID NOs :1和2所示的序列的引物，擴(kuò)增靶核酸鏈。在某些實(shí)施方式中，該方法還包括利用根據(jù)HAV基因組5’UTR的探針例如SEQ ID NOs :3所示探針檢測(cè)被擴(kuò)增的靶核苷酸以判斷樣品中是否存在HAV的步驟。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物樣品中HAV感染的方法，該方法包括從懷疑含有HAV的生物樣品中分離核酸；用至少兩個(gè)引物擴(kuò)增核酸，其中，(a)每個(gè)引物的長(zhǎng)度都不超過約60個(gè)核苷酸，弓I物之一含有SEQ ID NOs :1中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，另ー個(gè)引物含有SEQ ID N0s:2中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，或者，(b)引物序列與(a)所述核苷酸序列具有90%的一致性，其中兩個(gè)引物分別所述分離核酸的正義鏈和反義鏈的部分序列具有足夠的互補(bǔ)性以與之雜交；以及檢測(cè)擴(kuò)增的核酸，如有擴(kuò)增的核酸則表明樣品中存在HAV。在某些實(shí)施方式中，如下從生物樣品中分離核酸(a)使含捕捉核酸的固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及(b)從樣品中分離固相支持物。在另外的實(shí)施方式中，分離、擴(kuò)增和檢測(cè)是在ー個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行的。在另外ー個(gè)實(shí)施方式中，捕捉核酸含有ー種或多種寡核苷酸，其中姆種的長(zhǎng)度都不超過 60 個(gè)核苷酸并含有選自 SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7的序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
另ー實(shí)施方式中，捕捉核酸還包含長(zhǎng)度約為15-25個(gè)核苷酸的一段同聚物鏈，如聚A、聚T、聚G、聚C或聚U。在另外的實(shí)施方式中，擴(kuò)增方法包括PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)或TaqMan。在另外ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括利用標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟，探針的長(zhǎng)度不超過約60個(gè)核苷酸并含有SEQ ID NO :3所示序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。在某些實(shí)施方式中，探針在其5’末端和3’末端還含有可檢測(cè)的標(biāo)記物，如選自以下的熒光標(biāo)記物6_羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7- ニ氯熒光素(TET)。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物樣品中HAV感染的方法，該方 法包括(a)使固相支持物與含一種或多種寡核苷酸的捕捉核酸接觸，所述ー種或多種寡核苷酸含有選自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ IDNO 14的序列，接觸在能使捕捉核酸連接到固相支持物上的條件下進(jìn)行，(b)使固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使樣品中可能存在的HAV來源的靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及(C)從樣品中分離步驟(b)后的固相支持物；(d)用含SEQ ID NO 1的正向引物和含SEQ ID NO 2的反向引物擴(kuò)增核酸，其中正向引物和反向引物分別與分尚核酸的正義鏈部分和反義鏈的部分序列充分互補(bǔ)以與之雜交；以及(e)檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列以判斷樣品中是否存在HAV。在上述方法的某些實(shí)施方式中，固相支持物包括小珠，如磁珠，核酸的分離、擴(kuò)增和檢測(cè)在ー個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種寡核苷酸，該寡核苷酸包含任ー圖I所示的核苷酸序列。 在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)度不超過60個(gè)核苷酸的分離的寡核苷酸，該寡核苷酸包含(a)具有選自SEQ ID NOs :1、2和3的序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(b)與(a)所述核苷酸序列有90%—致性的核苷酸序列；或者(c) (a)和(b)的互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方式中，寡核苷酸是選自SEQ ID NOs :1、2和3的序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。在其他的實(shí)施方式中，寡核苷酸在其5’末端和3’末端還含有可檢測(cè)的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記物選自以下的熒光標(biāo)記物6_羧基熒光素出-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和 2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7-ニ氯熒光素(TET)。另外還有一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了ー種診斷檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括本文所描述的ー種或多種引物，診斷試驗(yàn)操作說明書。在某些實(shí)施方式中，試劑盒還包括ー種寡 核苷酸探針，該探針含有約10-50個(gè)核苷酸的連接有檢測(cè)標(biāo)記物的HAV特異性雜交序列。在另外ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物樣品中HAV的試劑盒。試劑盒包括含有一種或多種寡核苷酸的捕捉核酸，所述ー種或多種寡核苷酸含有選自SEQ IDNO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 的序列；引物含有SEQ ID NOs :1和2 ;寡核苷酸探針含有SEQ ID NO :3。在某些實(shí)施方式中，試劑盒還包括聚合酶和診斷試驗(yàn)操作說明書。在另外ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物樣品中HAV感染的試劑盒，該試劑盒包括含有一種或多種寡核苷酸的捕捉核酸，其中每種寡核苷酸的長(zhǎng)度都不超過約60個(gè)核苷酸并具有選自 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQID NO 14的序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸； 至少兩種引物，其中(a)每個(gè)引物的長(zhǎng)度不超過約60個(gè)核苷酸，引物之一含有SEQID NO :1中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，另ー個(gè)引物含有SEQ ID NO :2中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸；以及鑒定HAV感染的文字說明。在某些實(shí)施方式中，試劑盒還包括長(zhǎng)度不超過約60個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針，該探針含有SEQ ID NO 3中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。探針在其5’末端和3’末端還含有可檢測(cè)的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記物選自以下的熒光標(biāo)記物6_羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和 2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7-ニ氯熒光素(TET)。在某些實(shí)施方式中，上述試劑盒還包括聚合酶和緩沖液。本發(fā)明的這些方面及其他方面通過參考下面的詳細(xì)描述和附圖將變得更加清楚。另外，本文所引用的各種參考文獻(xiàn)對(duì)某些方法和組合物進(jìn)行了更為詳細(xì)的描述。附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1A_1B(SEQ ID NOs 1和2)例舉了用于擴(kuò)增分離的HAV核酸的引物。圖2(SEQ ID NO 3)描述了用于檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸以判斷HAV是否存在的探針，其中X是6-FAM(熒光素)，Z是接頭加上TAMRA (四甲基羅丹明)。圖3A_3F(SEQ ID NOs :10-15)例舉了用于分離生物樣品中HAV核酸的捕捉寡核苷酸。圖4A 描述了 HAV 野生型靶序列(SEQ ID N0:16)。圖 4B(SEQ ID NO :17)例舉了ー種捕捉和擴(kuò)增過程的內(nèi)對(duì)照序列。黑體字部分代表野生型序列與內(nèi)對(duì)照序列替換的差異部分。本發(fā)明的詳細(xì)描述除非另外說明，利用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和病毒學(xué)方法就可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。這些技術(shù)方法在文獻(xiàn)中已有詳細(xì)解釋。見《基礎(chǔ)病毒學(xué)》，第二版，卷I& II (B. N. Fields 和 D. M. Knipe 編輯)；A. L. Lehninger,《生物化學(xué)》(Worth Publishers,Inc.，Current Addition) ;Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)'》(第二版，1989)；《酶學(xué)方法》(S. Colowick和N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；《寡核苷酸合成技術(shù)》(N. Gait編輯，1984)；《分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(1984)。下面的氨基酸縮寫用于整篇文章中丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg (R)天冬酰胺Ash (N)天冬氨酸Asp (D)
半胱氨酸Cys (C) 谷氨酰胺=Gln(Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly (G)組氨酸HisOl)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys (K)蛋氨酸Met (M)苯丙氨酸Phe (F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸SeHS)蘇氨酸Thr (T)色氨酸Trp (W)酪氨酸Tyr(Y)纈氨酸Val (V) I.定義在描述本發(fā)明時(shí)使用了下列術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)的定義如下。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”是指氨基酸殘基的聚合物，并不限于最短的產(chǎn)物。因此，肽、寡肽、ニ聚物、聚合物等也包括在這個(gè)定義內(nèi)。全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)及其片段也包含在這個(gè)定義內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還包括多肽的表達(dá)后修飾產(chǎn)物，如糖基化、こ?；?、磷酸化等。另外，在用于本發(fā)明吋，“多肽”也指經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，如天然序列的缺失、添加和替代(一般是指保守的替代)，只要蛋白質(zhì)依然保持所需要的活性就可以。這些修飾可以是特異造成的，如通過位點(diǎn)特異性突變，也可以是偶發(fā)事件，如產(chǎn)生蛋白的宿主的突變或者由于PCR擴(kuò)增所造成的錯(cuò)誤所致。當(dāng)“分離的”用于修飾多肽時(shí)意味著該多肽分子與其天然所在的完整有機(jī)體分離，或基本上沒有其他同類生物大分子存在。術(shù)語(yǔ)“分離的”用于修飾寡聚核苷酸時(shí)意味著該核酸分子完全或部分去除了天然與其相連的序列；或者該核酸分子以其天然狀態(tài)存在但與之共存相連的是異源序列；或者從染色體上分離出的核酸分子。某序列“來源的”或“特異性的”聚核苷酸是指至少含有與所述某序列的某區(qū)域相應(yīng)、相同或互補(bǔ)的連續(xù)序列，該連續(xù)序列含約6個(gè)核苷酸以8個(gè)為佳，10-12個(gè)更好，15-20個(gè)還要好。所得到的聚核苷酸不一定是物理意義上的取自感興趣的核苷酸序列，而可化學(xué)合成方法、復(fù)制方法、反轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄等方法獲得，這些方法都是基于聚核苷酸來源區(qū)的堿基序列所提供的信息。因此，它可以代表原始聚核苷酸的正義方向，也可以代表反義方向?！巴础笔侵竷蓚€(gè)聚核苷酸或兩個(gè)多肽基序之間的一致性的百分率。兩個(gè)核酸或兩個(gè)多肽序列彼此“基本同源”是指兩個(gè)序列在指定長(zhǎng)度上的一致性至少約50%，優(yōu)選至少約75%，更優(yōu)選至少約80-85%,90%的序列一致性，最優(yōu)選至少95% -98%的序列一致性。本文所用的“基本同源”也指與特定核酸或多肽序列完全一致的序列。一般來說，“一致性”是指兩個(gè)聚核苷酸序列或兩個(gè)多肽序列的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸對(duì)應(yīng)性。一致性的百分率可通過直接比較其序列信息來確定將兩個(gè)分子的序列對(duì)齊，計(jì)算對(duì)齊后兩個(gè)序列之間精確匹配的數(shù)目，將該數(shù)目除以兩序列中較短的那個(gè)再乘以100?，F(xiàn)在已經(jīng)有ー些計(jì)算機(jī)程序可用于幫助分析同源性和一致性，如DayhofT，M. 0.在《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖 i普〉〉(M. 0. Dayhoff 編輯,5 Suppl. 3 :353-358, Nationalbiomedical Research Foundation, Washington, DC)中描述的 ALIGN 程序，該程序米用了Smith和Waterman在《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》2 :482-489,1981中所描述的局部同源性算法用于分析多肽序列。用于分析核苷酸序列同源性的程序有“Wisconsin序列分析包”，版本8 (來自Genetics Computer Group, Madison, WI),例如 BESTFIT、FASTA 和 GAP 程序，這些程序也米用了 Smith和Waterman算法。這些程序由于采用了廠家推薦的及上述Wisconsin序列分析包中所描述的默認(rèn)參數(shù)，因此使用非常方便。例如，可用Smith和Waterman同源性算法，采用默認(rèn)計(jì)分表和6核苷酸位置間隔補(bǔ)償來確定ー個(gè)特定核苷酸序列與參考序列同之間的源性百分率。本發(fā)明計(jì)算同源性百分率的其他方法還有MPSRCH程序包，該程序包的版權(quán)所有者是愛丁堡大學(xué)，是由 John F. Collins 和 Shane S. Sturrok 開發(fā)的，由 IntelliGenetics,Inc. (Mountain View, CA)進(jìn)行推廣。這套程序包也采用了 Smith-Waterman算法,默認(rèn)參數(shù)用于計(jì)分表(如間隔開放補(bǔ)償為12，間隔延伸補(bǔ)償為1，間隔為6)。從數(shù)據(jù)中所得到的“匹配”值反映了 “序列同源性”。其他適用的計(jì)算兩個(gè)序列一致性或同源性百分率的程序通常都是本領(lǐng)域所熟知的，如另外ー個(gè)排列程序是BLAST，采用默認(rèn)參數(shù)。例如，BLASTN和BLASTP 米用下列默認(rèn)參數(shù)genetic code = standard ；filter = none ；strand = both ；cutoff = 60 ；expect = 10 ；Matrix = BL0SUM62 !Descriptions = 50sequences ；sortby = HIGH SCORE !Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。這些程序的詳細(xì)內(nèi)容可在下列網(wǎng)址中查到http: //www. ncbi. nlm. gov/cgi_ipin/BIJVST0另外，同源性還可以通過下述方法確定在適于同源區(qū)形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下使聚核苷酸雜交，然后用單鏈特異性的核酶消化，確定消化所得片段的長(zhǎng)度?；就吹暮怂嵝蛄锌捎美缇吞囟ㄏ到y(tǒng)而言的嚴(yán)謹(jǐn)條件下的Southern雜交試驗(yàn)確定。確定合適的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，見上述文獻(xiàn)Sambrook等；((DNA克隆》；《核酸雜交》。本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組的”用于描述核酸分子時(shí)是指基因組聚核苷酸、cDNA、病毒聚核苷酸、半合成的聚核苷酸或合成的聚核苷酸因其來源或?qū)ζ洳僮鞑辉倥c其天然相關(guān)聚核苷酸的全部或部分相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“重組的”用于指蛋白質(zhì)或多肽時(shí)是指通過表達(dá)重組聚核苷酸而制備的多肽。通常是將目的基因克隆出來，然后轉(zhuǎn)化生物體而表達(dá)，這些方法將在下文進(jìn)ー步描述。生物體宿主在表達(dá)條件下表達(dá)外源基因并產(chǎn)生蛋白質(zhì)?！罢{(diào)控元件”是指幫助與其相連接的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的聚核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)包含啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止序列，上游調(diào)節(jié)區(qū)，聚腺苷酸化信號(hào)，包括5’ -UTRs和/或3’-UTRs的非翻譯區(qū)，前導(dǎo)序列和增強(qiáng)子，這些序列互相配合使編碼序列在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。本文所用的“啟動(dòng)子”是指能與聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)與其存在下相連的下游(3’方向)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，啟動(dòng)子序列包括能啟動(dòng)感興趣的序列發(fā)生背景水平以上的可檢測(cè)水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最少數(shù)量的堿基或元件。啟動(dòng)子序列內(nèi)包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及負(fù)責(zé)RNA或DNA聚合酶結(jié)合的蛋白結(jié)合區(qū)(共有序列)。例如，啟動(dòng)子可以是能被DNA依賴性RNA聚合酶(“轉(zhuǎn)錄酶”)識(shí)別的核酸序列，聚合酶將其識(shí)別為與核酸結(jié)合并從特定位點(diǎn)開始RNA轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。這種轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合通常要求DNA其包含啟動(dòng)子序列及其互補(bǔ)序列的部分呈雙鏈；模板部分(待轉(zhuǎn)錄序列)則不一定要是雙鏈。不同的DNA依賴性RNA聚合酶各自識(shí)別多種不同的啟動(dòng)子序列，這些啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的效率大不相同。當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子序列上并起始轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子序列本身并不是要轉(zhuǎn)錄的部分。因此所產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物不包括啟動(dòng)子序列。
當(dāng)RNA或DNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子序列并轉(zhuǎn)錄其相鄰序列時(shí)就是所謂的調(diào)控序列“指導(dǎo)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄”?！癉NA依賴性DNA聚合酶”是能從DNA模板開始合成該模板的互補(bǔ)DNA拷貝的酶。如大腸桿菌來源的DNA聚合酶I和噬菌體I7DNA聚合酶。所有已知DNA依賴性DNA聚合酶都需要互補(bǔ)引物以啟動(dòng)合成。在適宜的條件下，DNA依賴性DNA聚合酶也可以由RNA模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝。“DNA依賴性RNA聚合酶”或“轉(zhuǎn)錄酶”是能從含有啟動(dòng)子序列(通常是雙鏈)的雙鏈或部分雙鏈DNA分子合成多個(gè)RNA拷貝的酶。RNA分子(“轉(zhuǎn)錄物”)從啟動(dòng)子下游的特異性位點(diǎn)開始按5’到3’方向合成。轉(zhuǎn)錄酶的例子有大腸桿菌來源的和噬菌體T7、T3和SP6來源的DNA依賴性RNA聚合酶?！癛NA依賴性DNA聚合酶”或“反轉(zhuǎn)錄酶”是能以RNA為模板合成互補(bǔ)DNA拷貝的酶。所有已知的反轉(zhuǎn)錄酶都能以DNA為模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝；因此它既是RNA依賴性DNA聚合酶，又是DNA依賴性DNA聚合酶。不論以RNA模板還是DNA模板進(jìn)行合成都需要引物?！?RNA酶H ”是可降解RNA: DNA雙螺旋中RNA部分的酶。這些酶可以是內(nèi)切酶，也可以是外切酶。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶除了具有聚合酶活性外還具有RNA酶H的活性。但是其他來源的RNA酶H沒有相關(guān)的聚合酶活性。降解可導(dǎo)致RNA從RNA = DNA雙螺旋上解離下來。另夕卜，RNA酶H還可以在各種位置上簡(jiǎn)單切割RNA，這樣RNA部分就可以被熔化掉或者使酶展開RNA部分。術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中包括任意長(zhǎng)度的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的聚合物形式。這些術(shù)語(yǔ)只指分子的ー級(jí)結(jié)構(gòu)。因此術(shù)語(yǔ)包括三鏈、雙鏈和單鏈DNA，也包括三鏈、雙鏈和單鏈RNA，還包括其修飾物，如通過甲基化和/或加帽而形成的修飾物，以及聚核苷酸的未修飾形式。更特殊的是，術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)，以及其他類型的聚核苷酸即嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的，以及其他含非核苷酸骨架的聚合物，如聚酰胺(即肽核酸(PNAs))和聚嗎啉代(polymorpholino)(Anti-virals, Inc. Corvl I is, Oregon的產(chǎn)品，商品名為Neugene)聚合物，以及其他含有核苷堿且其構(gòu)型能夠發(fā)生如DNA和RNA中所見堿基配對(duì)和堿基堆積的序列特異性合成核酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在長(zhǎng)度上是沒有區(qū)別的，這些術(shù)語(yǔ)可以互相替換。這些術(shù)語(yǔ)只指分子的ー級(jí)結(jié)構(gòu)。因此這些術(shù)語(yǔ)包括3’ -脫氧-2’，5’ -DNA,寡聚脫氧核糖核苷酸N3’ P5’氨基磷酸酷，2’ -0-烷基-替代的RNA，DNAiRNA雜交鏈，以及PNAs與DNA或RNA的雜交鏈，也包括已知類型的修飾物，如本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)記物、甲基化、“帽子”、類似物替代ー個(gè)或多個(gè)天然核苷酸，核苷酸內(nèi)修飾，如不帶電荷的連接(如磷酸甲酷，磷酸三酷、氨基磷酸酷、氨基甲酸酯等)、帶負(fù)電荷的連接(如硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酯等)以及帶正電荷的連接(如氨基烷基氨基磷酸酷、氨基烷基磷酸三酷)，含側(cè)鏈的修飾物，如蛋白質(zhì)(包括核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L賴氨酸等)，含嵌合劑的修飾物(如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)，含螯合劑的修飾物(如金屬、放射金屬、硼、氧化性金屬等)，含烷化劑的修飾物，含有修飾連接的修飾物(如核酸a端基異構(gòu)體等)，以及未經(jīng)修飾的聚核苷酸或寡核苷酸。DNA特指脫氧核糖核酸。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸區(qū)”或“靶核酸”是指具有待擴(kuò)增的“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是單鏈的也可以是雙鏈的，在靶序列旁邊還可以包含可能不被擴(kuò)增的其他序列。術(shù)語(yǔ)“靶序列”是指靶核酸上待被擴(kuò)增的特定核苷酸序列。靶序列可以包含探針雜交區(qū)，該雜交區(qū)位于靶分子內(nèi)，在適宜的條件下探針與該區(qū)可形成穩(wěn)定的雜交體?！鞍行蛄小币舶◤?fù)合序列，寡核苷酸引物與這樣的負(fù)復(fù)合序列結(jié)合并以靶序列為模板延長(zhǎng)。當(dāng)靶核酸原本是單鏈核酸吋，術(shù)語(yǔ)“靶序列”也指出現(xiàn)在靶核酸中的該“靶序列”的互補(bǔ)序列。如果“靶核酸”原本是雙鏈核酸，術(shù)語(yǔ)“靶序列”既指正⑴鏈也指負(fù)㈠鏈。術(shù)語(yǔ)“引物”或“寡核苷酸引物”用于本文中是指在誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件下啟動(dòng)互補(bǔ)核酸鏈合成的寡核苷酸，所述條件是指存在核苷酸和聚合誘導(dǎo)如DNA或RNA聚合酶，以及適宜的溫度、pH、金屬離子濃度和鹽濃度。引物優(yōu)選單鏈核酸以達(dá)到最大的擴(kuò)增效率，但也可以是雙鏈。如果是雙鏈，引物在使用前必須經(jīng)處理將雙連打開，然后用于制備延伸產(chǎn)物。這個(gè)變性步驟通常通過加熱來完成，但是也可以通過使用堿處理再中和來完成。因此，“引物”是與模板互補(bǔ)的，通過氫鍵與模板結(jié)合或雜交，形成引物/模板復(fù)合物以便于 聚合酶開始核酸的合成，在DNA合成過程中堿基與模板互補(bǔ)地共價(jià)連接到3’端從而使引物得以延伸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“探針”或“寡核苷酸探針”指由聚核苷酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，含有與靶核酸分析物中的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。探針的聚核苷酸區(qū)由DNAjP /或RNAjP /或合成的核苷酸類似物構(gòu)成?！肮押塑账崽结槨庇糜?’核酶分析試驗(yàn)如TaqMan 時(shí)，探針內(nèi)至少含有ー個(gè)熒光團(tuán)和ー個(gè)淬滅劑，淬滅劑可被反應(yīng)中所用的聚合酶的5’內(nèi)切核酸酶活性所消化以便于檢測(cè)靶核苷酸序列是否被擴(kuò)增。在這種情況下，寡核苷酸探針在其5’端應(yīng)有足夠數(shù)量的磷酸ニ酯鍵以便于5’到3’核酸酶活性能有效降解結(jié)合的探針從而使熒光團(tuán)和淬滅劑分離。當(dāng)寡核苷酸探針用于TMA技術(shù)時(shí)，探針應(yīng)當(dāng)用適宜的標(biāo)記物標(biāo)記，詳見后文。雜交序列并不一定要完全互補(bǔ)才能形成穩(wěn)定的雜交體。在許多情況下，四個(gè)或更多個(gè)核苷酸形成環(huán)結(jié)構(gòu)忽略不計(jì)時(shí)，堿基錯(cuò)配低于10%仍可以形成穩(wěn)定的雜交體。所以，本文所用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”是指在試驗(yàn)條件下與其“互補(bǔ)”序列可以形成穩(wěn)定的雙螺旋的寡核苷酸，此時(shí)的同源性約90%或更高。術(shù)語(yǔ)“雜交”是指兩個(gè)足夠互補(bǔ)的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對(duì)法則形成穩(wěn)定的復(fù)合物的過程。當(dāng)引物可與靶序列(模板)“雜交”，則所得復(fù)合物(或雜交體)的穩(wěn)定性足以保證其啟動(dòng)功能，例如DNA聚合酶啟動(dòng)DNA的合成。本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合對(duì)”是指能彼此特異性結(jié)合的第一和第二分子，如能形成核酸雙螺旋的互補(bǔ)聚核苷酸對(duì)。結(jié)合對(duì)中的第一成員與樣品中第二成員結(jié)合的親和カ和特異性比與樣品中其他組分結(jié)合的親和カ和特異性高說明第一成員與第二成員的結(jié)合是“特異性結(jié)合”，反之亦然。結(jié)合配對(duì)中的兩個(gè)成員之間的結(jié)合一般是非共價(jià)結(jié)合。除非明確說明，“親和分子”和“靶分析物”用于本文中分別指結(jié)合對(duì)中的第一成員和第二成員。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合的分子”和“親和分子”在本文中可以互換，是指通過化學(xué)的或物理的方式選擇性地與樣品中存在的可檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合的分子?！斑x擇性結(jié)合”是指ー個(gè)分子優(yōu)先與靶序列結(jié)合，或者與目的靶序列結(jié)合的親和カ比與其他分子的高。例如，核酸分子與基本互補(bǔ)的序列結(jié)合而不與不相關(guān)的序列結(jié)合。雙鏈核酸分子的“解鏈溫度”或“Tm”定義為由于加熱或其他原因，如酸或堿處理等使堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂而導(dǎo)致的核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)丟失一半時(shí)的溫度。核酸分子的！'m取決于其長(zhǎng)度和堿基組成。富含GC堿基對(duì)的核酸分子的Tm要比富含AT堿基對(duì)的核酸分子的Tm高。當(dāng)溫度低于Tm吋，分開的互補(bǔ)核酸鏈可自然地從新結(jié)合或復(fù)性形成核酸雙螺旋。在Tm以下約25°C時(shí)核酸雜交的幾率最高。!可通過下面的公式進(jìn)行估算Tm = 69. 3+0. 41 (GC) %(Marmur 等，(1962) J. Mol. Biol. 5 :109-118)。本文中“生物樣品”是指從有機(jī)體中分離出的組織或液體樣品，通常包含有機(jī)體產(chǎn)生的抗體。常見的樣品包括而不限于血液、血漿、血清、糞便、尿液、骨髄、膽汁、脊髄液、淋巴液、皮膚樣品、皮膚、呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道分泌物、眼淚、唾液、乳汁、血細(xì)胞、器官、活組織，也包括體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分的樣品，其中包括而不限于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞和組織培養(yǎng)物后得到的條件培養(yǎng)基，如重組細(xì)胞和細(xì)胞組分。優(yōu)選的生物樣品是血液、血漿和血清。本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”和“可檢測(cè)的標(biāo)記物”是指能檢測(cè)到的分子，包括而不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生色團(tuán)、酶、酶的底物、酶的輔助因子、酶的抑制齊U、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(如生物素、親和素、鏈親和素或半抗原)等。術(shù)語(yǔ)“熒光團(tuán)”是指能在能夠發(fā)出可檢測(cè)到的熒光的物質(zhì)或其部分。本文所用的術(shù)語(yǔ)“固相支持物”是指固體表面，如磁珠、乳膠珠、微量滴定板孔、玻片、尼龍、瓊脂糖、丙烯酰胺等。II.本發(fā)明的實(shí)施方式在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不限于特定的制劑或過程參數(shù)，這些制劑或過程參數(shù)是可以改變的。還應(yīng)當(dāng)理解的是本文的用語(yǔ)只是為了描述本發(fā)明的特定實(shí)施方式，并不意味著對(duì)本發(fā)明作出限制。雖然也可以用那些與本文所述相似的或等同的組合物和方法來實(shí)施本發(fā)明，但是以下所述的是優(yōu)選的材料和方法。如上所述，本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了精確檢測(cè)生物樣品中甲肝病毒(HAV)的新型診斷方法。這些方法依賴于敏感的核酸檢測(cè)技術(shù)，樣品中即使含有極少量的病毒也可以用該技術(shù)鑒定樣品中的HAV靶核酸序列。更具體地說，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用HAV基因組的5’ UTR來源的序列可以快速而靈敏地檢測(cè)生物樣品中的HAV。許多HAV分離株中的HAV基因組序列，包括5’ UTR都是已知的。見NCBI登錄號(hào)K02990 ；AB020564 ；AB020565 ；AB020566 ；AB020567 ；AB020568 ；AB020569 ；AF268396 ；M16632 ；M14707 ；M20273 ；NC001489 ；X83302 ;Cohen等，J. Virol. (1987)61 :50_59。通過比較各種HAV分離株的序列，可以很容易地鑒定用于本發(fā)明的這些和其他5’ UTR序列。為了簡(jiǎn)便，本發(fā)明所用的各種核酸分子根據(jù)NCBIK02990來編號(hào)，NCBI K02990的5，UTR序列位于ト723位。在本發(fā)明的策略中，靶核酸是從非同源的DNA/RNA中分離的。本發(fā)明內(nèi)容之一中，靶核酸通過與固相支持物形成復(fù)合物來分離。另ー內(nèi)容中，靶核酸用固定在固相支持物上的捕捉寡核苷酸進(jìn)行分離，其中捕捉寡核苷酸是待檢測(cè)生物體特異性的。然后可用帶有報(bào)道基團(tuán)尾巴的寡核苷酸探針來檢測(cè)或擴(kuò)増分離的靶核酸。對(duì)于HAV來說，分離的靶核酸優(yōu)選用非翻譯區(qū)如5’UTR內(nèi)的引物來擴(kuò)增。代表性的這個(gè)區(qū)內(nèi)的引物是含SEQ ID NOs 1和2的引物(圖I)。 另外，可能含有靶核酸的生物樣品與固相支持物接觸，固相支持物上可以帶有捕捉寡核苷酸。捕捉寡核苷酸可以通過例如探針部分與固相支持物共價(jià)結(jié)合、通過親和カ結(jié)合、氫鍵結(jié)合或非特異性結(jié)合與固相支持物相連接。捕捉寡核苷酸包含約5到500個(gè)核苷酸，優(yōu)選包含約10到100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含10到60個(gè)核苷酸,或者這些范圍內(nèi)的任一整數(shù)數(shù)目的核苷酸,如包含目的核酸區(qū)上的18、19、20、21、22、23、24、25、26. 35. 40等個(gè)核苷酸。典型的捕捉寡核苷酸來源于HAV分離株的5，UTR序列，如本文圖3A-3F(SEQ ID NOs :10-15)所描述的序列。捕捉核酸可以通過各種方式連接到固相支持物上。例如，寡核苷酸可以通過捕捉寡核苷酸的3’或5’末端核苷酸連接到固相支持物上。更優(yōu)選的是捕捉寡核苷酸通過ー個(gè)接頭連接到固相支持物上，這些接頭可以使探針與固相支持物保持一定的距離。接頭的長(zhǎng)度通常為至少10-50個(gè)原子，更優(yōu)選的是至少10-30個(gè)原子。接頭所需要的長(zhǎng)度要根據(jù)所用的特定固相支持物而定。例如，當(dāng)用高交聯(lián)的聚苯こ烯作為固相支持物時(shí)6個(gè)原子的接頭就足夠了。本領(lǐng)域所熟知的多種接頭都可用于將捕捉寡核苷酸連接到固相支持物上。接頭可 以由各種化合物，只要它不明顯干擾靶序列與連接于固相支持物上的捕捉寡核苷酸雜交就可以。接頭可以是同源聚合的寡核苷酸，這樣的寡核苷酸可以很容易地通過自動(dòng)合成添加到接頭上。同源聚合物序列可以連接到病毒特異性序列的5’或3’上。本發(fā)明中，捕捉寡核苷酸可以與同源聚合物鏈相連，如聚A、聚T、聚G、聚C、聚U、聚dA、聚dT、聚dG、聚dC或聚dU，以便于其連接到固相支持物上。同源聚合物鏈可長(zhǎng)約10到40個(gè)核苷酸，優(yōu)選約12到25個(gè)核苷酸，或者這些范圍內(nèi)任意整數(shù)長(zhǎng)度，如10. . . 12. . . 16、17、18、19、20、21、22、23或24個(gè)核苷酸。典型的同源聚合物序列包括聚T或聚A序列。另外，聚合物如官能化的聚こニ醇也可以用作接頭。這種聚合物不會(huì)明顯干擾探針與寡核苷酸靶的雜交。連接的例子包括聚こニ醇、氨基甲酸酯和酰胺連接。固相支持物、接頭和捕捉寡核苷酸之間的連接以在高溫堿性條件下去除堿基保護(hù)基團(tuán)時(shí)不被裂解掉的為佳。捕捉寡核苷酸在其3’末端還可以被磷酸化以防止捕捉寡核苷酸的延伸。固相支持物可以是各種形式的，如硝酸纖維素顆粒，樣品培養(yǎng)基通過濾網(wǎng)時(shí)其中的此類支持物的可以被回收；含有磁性顆粒等的硝酸纖維素膜或材料，因此在加上磁場(chǎng)后可使硝酸纖維素膜在樣品培養(yǎng)基內(nèi)遷移；能被過濾或具有電磁特性的磁珠或顆粒；分配在水性介質(zhì)表面的聚苯こ烯小珠；以及磁化ニ氧化硅。優(yōu)選用于固定捕捉寡核苷酸的固相支持物包括調(diào)孔玻璃、玻片、聚苯こ烯、親和素包被的聚苯こ烯小珠、纖維素、尼龍、丙烯酰胺凝膠和活化的葡聚糖。本發(fā)明包括含磁化ニ氧化硅或磁珠的固相支持物，磁化ニ氧化硅或磁珠還可以含有伯胺官能團(tuán)以便于捕捉寡核苷酸與磁性支持顆粒共價(jià)結(jié)合或締合。或者，磁化ニ氧化硅或磁珠上已固定了同源聚合物，如聚T或聚A序列。利用含磁化ニ氧化硅或磁珠的固相支持物可以實(shí)現(xiàn)ー罐法分離、擴(kuò)增和檢測(cè)，因?yàn)楣滔嘀С治锟赏ㄟ^磁性方式從生物樣品中分離出來。磁珠或磁?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備或者購(gòu)買。磁珠或磁粒通常由磁性顆粒構(gòu)成，雖然也可以是其他磁性材料或金屬氧化物，可以是不純的材料、合金或組合物，只要這些材料具有ー個(gè)活性表面，能夠?qū)Υ艌?chǎng)起應(yīng)答就可以?？梢詥为?dú)使用或與鐵聯(lián)合使用的其他材料包括而不限于鈷、鎳和硅。適用于本發(fā)明的磁珠包括含聚dT基團(tuán)的磁珠，商品名為Sera-Mag 寡核苷酸磁珠,生產(chǎn)廠商為Seradyn, Indianopolis, IN。適用于本發(fā)明的磁性ニ氧化娃包括Novagen, Madison, WI的MagPrep 磁性ニ氧化娃。接種，通過使固相支持物與含捕捉寡核苷酸的介質(zhì)接觸來使捕捉寡核苷酸與固相支持物的結(jié)合以。一方面，含聚dT基團(tuán)的磁珠與靶序列雜交，靶序列含有與HAV基因組保守單鏈區(qū)的序列相鄰近的聚dA。捕捉寡核苷酸上的聚dA與固相支持物上的聚dT雜交因而可將捕捉寡核苷酸固定或結(jié)合到固相支持物上。另ー方面，磁珠可在其表面固定約10到75個(gè)核苷酸的核苷酸序列，優(yōu)選約含10到25個(gè)核苷酸的核苷酸序列，這些序列來源于美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/267，922所述的核苷酸序列，申請(qǐng)日為2002年12月9日。
固相支持物在高濃度高離液鹽條件或雜交條件下與生物樣品接觸。捕捉寡核苷酸與生物樣品中的靶核酸鏈雜交。一般來說，捕捉寡核苷酸與靶序列的雜交可在約15分鐘內(nèi)完成，但也可能長(zhǎng)到3-48小時(shí)。在另一方面，ニ氧化硅磁性顆粒在可促進(jìn)復(fù)合物形成的條件下與含靶序列的介質(zhì)接觸。復(fù)合物在ニ氧化硅磁性顆粒、介質(zhì)和離液鹽的混合物中更容易形成。高離液鹽是高離液離子鹽，在水溶液中是高度可溶的。此類鹽提供的高離液離子，當(dāng)其在蛋白質(zhì)或核酸水溶液中的濃度足夠高時(shí)可引起蛋白展開，如果是雙鏈核酸則可使雙鏈核酸失去ニ級(jí)結(jié)構(gòu)或熔解。高離液離子具有這種效應(yīng)被認(rèn)為是因?yàn)樗梢云茐脑谒行纬傻臍滏I網(wǎng)絡(luò)，從而使變性的蛋白和核酸比其正確折疊或具有正常構(gòu)象的結(jié)構(gòu)具有更高的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。代表性的高離液離子包括而不限于胍鹽、碘鹽、高氯酸鹽、三氯こ酸鹽。本發(fā)明優(yōu)選胍離子。高離液鹽包括而不限于鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉、高氯酸鈉和三氯こ酸鈉。優(yōu)選的是胍鹽，更優(yōu)選的是硫氰酸胍。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的高離液離子的濃度優(yōu)選約0. IM到7M之間，更優(yōu)選的是約
0.5M到5M之間?；旌衔镏懈唠x液離子的濃度必須足夠高以使生物靶材料粘附到混合物中的ニ氧化硅磁性顆粒上同時(shí)不能使靶材料發(fā)生變性、降解或從混合物中沉淀出來。蛋白質(zhì)和雙鏈核酸大分子如病毒核酸在0. 5-2M的高離液鹽中是穩(wěn)定的，但是當(dāng)離液鹽的濃度超過約2M時(shí)就會(huì)沉淀。在本發(fā)明的ー個(gè)方面中，孵育上述所形成的復(fù)合物直到至少有ー些核酸粘附到ニ氧化硅磁性顆粒上形成復(fù)合物。這個(gè)孵育步驟的溫度至少約0°c，優(yōu)選至少約4°C，更優(yōu)選的是至少約20°C，但是孵育溫度最好不要超過約75°C。因此，孵育溫度的范圍為0°C到75°C，優(yōu)選4°C到50°C，最優(yōu)選的是約15°C到約35°C，或者這些范圍內(nèi)任意整數(shù)溫度。孵育步驟的溫度最好低于ニ氧化硅磁性顆粒開始失去結(jié)合核酸材料的能力的溫度，孵育可以在室溫下(約25°C)進(jìn)行。然后通過過濾、濾柱或通過磁性方式將固相支持物從生物樣品中分離出來。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，選擇何種分離方法要根據(jù)所選的固相支持物的類型而定。由于靶序列與固定在固相支持物上的捕捉核酸雜交，因此與樣品中的雜質(zhì)分離開來。在某些情況下，無關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞碎片以及其他雜質(zhì)也可能結(jié)合到支持物上，但其濃度比在生物樣品中的原濃度低的多。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，那些無關(guān)物質(zhì)可以通過洗滌支持物而被去除。較好的是，從生物樣品中分離固相支持物可除去樣品中至少約70%的非靶核酸，更優(yōu)選的是至少除去約90%、95%的非靶核酸。
本發(fā)明的方法也包括擴(kuò)增捕獲的靶核酸以獲得擴(kuò)增的核酸。擴(kuò)增靶核酸是用核酸聚合酶產(chǎn)生寡核苷酸靶或其片段的多個(gè)拷貝。適用于本發(fā)明的擴(kuò)增技術(shù)都是本領(lǐng)域所熟知的，如轉(zhuǎn)錄相關(guān)的擴(kuò)增，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增以及連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。本發(fā)明的方法所用的引物優(yōu)選具有被檢測(cè)生物體特異性。這樣，為了檢測(cè)例如HAV，引物就來源于HAV非翻譯區(qū)的保守區(qū)，如圖I所示。用于本發(fā)明方法的引物和捕捉寡核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法可以很容易地制備，如通過磷酸酰亞胺化學(xué)固相合成技術(shù)，見于美國(guó)專利Nos. 4, 458, 066和4，415, 732 ；Beaucage等，(1992)Tetrahedron 48:2223-2311;以及 Applied Biosystems User BulletinNo. 13 (1987年8月I日)。其他化學(xué)合成方法包括磷酸三酷法，見于Narang等，Meth.Enzymol. (1979)68 :90 和憐酸ニ酯法，見于 Brown 等，Meth. Enzymol. (1979)68:109。利用上述方法還可將聚(A)、聚(C)或其他非互補(bǔ)核苷酸延伸物插入到探針內(nèi)。通過本領(lǐng)域所熟知的方法可以將六環(huán)氧こ烷延伸物偶聯(lián)到探針上。見Cload等，(1991) J. Am. Chem. Soc. 113 :6324-6326 ；Levenson 等的美國(guó)專利 No. 4, 914, 210 ；Durand 等，(1990)NucleicAcids Res. 18 :6353-6359 ;以及 Horn 等，(1986) Tet. Lett. 27 :4705_4708。一般來說，引物的長(zhǎng)度在10-75個(gè)核苷酸之間，如15-60、20-40等，更常見的是18-40個(gè)核苷酸之間，以及上述范圍內(nèi)的任意長(zhǎng)度的核苷酸。典型的探針長(zhǎng)度在10-50個(gè)核苷酸之間，如15-40、18-30等，以及上述范圍內(nèi)的任意長(zhǎng)度的核苷酸。另外，探針還可以連接上標(biāo)記物以便于檢測(cè)?，F(xiàn)在已知有幾種方式可使寡核苷酸衍生為具有反應(yīng)性官能度，從而可連接上標(biāo)記物。例如，有幾種方法可使探針生物素化，這樣放射性的、熒光的、化學(xué)發(fā)光的、酶的或高電子密度的標(biāo)記物可通過親和素連接到探針上。見 G.，Broken 等，Nucl. Acids Res. (1978) 5 :363_384，其中描述了使用鐵蛋白-親和素-生物素標(biāo)記物的方法；以及Chollet等，Nucl. Acids Res. (1985) 13 :1529_1541，其中描述了通過ー個(gè)氨基烷基磷酸酰胺連接臂將寡核苷酸5’末端生物素化的方法。另外還有幾種方法可用于合成氨基化的寡核苷酸，這種寡核苷酸很容易被熒光團(tuán)或其他類型的氨基活性基團(tuán)衍生的化合物標(biāo)記，如異硫氰酸鹽、N輕基琥拍酸亞胺等,見Connolly (1987)Nucl.Acids Res. 15 :3131_3139，Gibson 等，(1987) Nucl. Acids Res. 15 :6455-6467 以及Miyoshi等人的美國(guó)專利No. 4，605，735。還有ー些方法可用于合成寡核苷酸巰基衍生物，這些寡核苷酸衍生物可與硫醇特異性的標(biāo)記物反應(yīng)，見Fung等人的美國(guó)專利NO. 4，757，141，Connolly 等,(1985)Nucl. Acids Res. 13 :4485-4502 以及 Spoat 等，(1987)Nucl. AcidsRes. 15 :4837-4848。標(biāo)記核酸片段的方法學(xué)的全面論述可參見Matthews等，Anal.Biochem. (1988) 169 :1_25。例如，探針可在其非連接端連接上一個(gè)熒光分子而被熒光標(biāo)記。選擇合適的熒光標(biāo)記物的方法見 Smith 等，Meth. Enzymol. (1987) 155 :260-301 ；Karger 等，Nucl. AcidsRes. (1991) 19 :4955-4962 ；Haugland(1989)《熒光探針和研究化學(xué)手冊(cè)》(Handbook ofFluorescent Probes ana Research しhemicals) (Molecular Probes, Inc. , Eugene,OR)。優(yōu)選的熒光標(biāo)記物包括熒光素及其衍生物，如美國(guó)專利No. 4，318，846和Lee等，Cytometry (1989) 10 :151-164 所描述的，以及 6_FAM(熒光素)、J0E(2，，7，- ニ 甲氧基-4，，5，- ニ氯熒光素)、TAMRA(四甲基羅丹明)>R0X(rhodaniine X)、HEX_1、HEX-2、Z0E、TET_1、NAN-2 等。另外，探針還可以用吖啶酯(AE)通過以下方法標(biāo)記?，F(xiàn)有的技術(shù)可將AE標(biāo)記物置于探針內(nèi)的任何位置上。見Nelson等，(1995)，《非同位素探針、雜交及測(cè)序》中的“根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)B丫唳酷”，Kricka L. J.(編輯)Academic Press, San Diego, CA ;Nelson等，(1994)，《聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》中的“雜交保護(hù)分析(HPA)用于PCR”，Mullis等(編輯)Birkhauser,Boston, MA ；ffeeks 等，Clin. Chem. (1983)29 :1474-1479 ；Berry 等，Clin. Chem. (1988)34 2087-2090。AE分子可用非核苷酸連接臂直接連接到探針上，這個(gè)連接臂可使AE分子放置到探針的任何位置上。見美國(guó)專利Nos. 5，585，481和5，185，439。在某些實(shí)施方式中，加入了內(nèi)對(duì)照(IC)或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)作為靶序列捕捉和擴(kuò)增的對(duì)照。IC最好含有與靶序列不同的序列，該序列可與從樣品中分離生物體特異性的寡核苷酸所用的探針序列雜交，并可以被擴(kuò)增。使用內(nèi)對(duì)照可控制分離過程、擴(kuò)增過程以及檢測(cè)系統(tǒng)，并可以監(jiān)測(cè)試驗(yàn)是否成功以及可對(duì)樣品定量。IC可在任何適當(dāng)?shù)倪^程點(diǎn)添加，比如添加到裂解緩沖液中。在一個(gè)實(shí)施方式中，IC包含具有HAV的部分核苷酸序列的RNA并具有能與探針雜交的獨(dú)特序列。因此，在某些實(shí)施方式中，IC包含HAV基因組的部分序列，其中有5-30個(gè)核苷酸，如6. . . 9. . . 12. . . 15. . . 20等或更多個(gè)堿基被其他堿基替代而修飾。替代堿基可在全長(zhǎng)靶序列上分布，其中只有2個(gè)或3個(gè)連續(xù)核苷酸被替代。HAV的代表性IC見圖4B所示，它含有HAV基因組5’UTR來源的721 bps。圖4B中的大寫黑體字母代表與野生型序列(見圖4A)相比被取代的堿基。試驗(yàn)中還可以包括內(nèi)標(biāo)特異性探針(IC探針)。代表性的IC序列的探針在實(shí)施例中有詳細(xì)描述，即SEQ ID NOs 18和19。IC探針還可以偶聯(lián)與靶序列上不同的可檢測(cè)標(biāo)記物。在可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光團(tuán)的實(shí)施方式中，IC可通過分光光度法及檢測(cè)極限研究來定量。一般來說，IC的拷貝數(shù)對(duì)靶序列的檢測(cè)沒有影響，IC的拷貝數(shù)可通過用固定IU/拷貝/PFU的靶序列滴定IC來確定，優(yōu)選取低端值，然后通過稀釋國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)樣品來作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，如本文所描述，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法將IC連接到從樣品中分離出的RNA上。然后用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA?？蓪⒃揷DNA序列用標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增(如通過PCR方法)。分離擴(kuò)增產(chǎn)物，通常用電泳方法分離，測(cè)定所摻入的標(biāo)記物的量(與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比)。然后通過與已知標(biāo)準(zhǔn)所產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行比較計(jì)算出樣品中mRNA的量。上面所描述的引物和探針可用于以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的方法來檢測(cè)生物樣品中的HAV感染。PCR是用于擴(kuò)增核酸分子或分子混合物中靶核酸序列的技術(shù)。在PCR中，需使用過量的引物對(duì)與靶核酸的互補(bǔ)鏈雜交。聚合酶以靶核酸為模板將引物延伸。延伸產(chǎn)物與原來的靶核酸鏈解離后其本身又變成靶序列。然后新引物與之雜交并被聚合酶延伸，隨著循環(huán)次數(shù)的増加，靶序列分子的數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。擴(kuò)增樣品中靶核酸序列的PCR方法是本領(lǐng)域所熟知的,描述于Innis等(編輯)《PCR手塒》(Academic Press,NY 1990) ； Taylor (1991)《PCR :操作方法》中的“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基本原理及自動(dòng)化”，Mcpherson 等(編輯)，Irl Press, Oxford ;Saiki 等，(1986)Nature 324 :163 ;以及美國(guó)專利 Nos. 4，683，195,4, 683，202 和 4，889，818。具體地說，PCR使用相對(duì)較短的寡核苷酸引物，引物位于所要擴(kuò)增的靶核苷酸序、列兩側(cè)，兩個(gè)引物的3’末端彼此相對(duì)，每個(gè)引物都朝向另ー個(gè)引物延伸。聚核苷酸樣品提取后經(jīng)變性，優(yōu)選通過加熱變性，然后與過量的第一引物和第二引物雜交。在4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPS-ATP，dGTP，dCTP和dTTP)存在的條件下用引物-和模板-依賴性聚核苷酸聚合劑如各種能產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的酶催化聚合反應(yīng)，聚合酶包括大腸桿菌的DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、從Thermus aquaticus分離出的熱穩(wěn)定的聚合酶(Taq)、各種商品酶(Perkin Elmer)、Thermus thermophiIus (Unitedbtates Biochemicals)、Bacillus stereothermophilus(Bio-Rad)或 ThermococcusLitoralis (;/ Vent"聚合酶，New England Biolabs)。聚合反應(yīng)產(chǎn)物為兩個(gè)“長(zhǎng)產(chǎn)物”，兩個(gè)產(chǎn)物的5’端各自包含相應(yīng)的引物，其后共價(jià)連接者新合成的原始鏈的互補(bǔ)鏈。然后將反應(yīng)混合物從新置于聚合反應(yīng)條件下，例如降低溫度、滅活變性劑或者増加聚合酶，第二個(gè)循環(huán)于是開始。第二個(gè)循環(huán)有兩個(gè)原始鏈、兩個(gè)第一循環(huán)的長(zhǎng)產(chǎn)物和從長(zhǎng)產(chǎn)物復(fù)制出的兩個(gè)“短產(chǎn)物”。短產(chǎn)物具有靶序列的序列，并在兩個(gè)末端各帶ー個(gè)引物。每ー個(gè)循環(huán)增加兩個(gè)長(zhǎng)產(chǎn)物和許多短產(chǎn)物，短產(chǎn)物的數(shù)目等于長(zhǎng)產(chǎn)物的數(shù)目加上上一循環(huán)結(jié)束時(shí)留下的短產(chǎn)物數(shù)目。因此，含靶序列的短產(chǎn)物的數(shù)目隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。PCR最好用市售熱循環(huán) 儀進(jìn)行，如 Perkin Elmer0RNA可通過將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA然后按照上述方法進(jìn)行PCR(RT-PCR)來擴(kuò)增?；蛘?，美國(guó)專利No. 5，322，770所述，這兩個(gè)步驟可使用同一個(gè)酶。還可以將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行不對(duì)稱間隙連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-AGLCR)，就如Marshall等，(1994) PCR Meth.App. 4 80-84 所述。熒光5’核酸酶分析即TaqMan 分析(Perkin-Elmer)是ー個(gè)高效且多效的以PCR為基礎(chǔ)的核算目標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)。因此，可將來源于本文所描述的HAV基因組的引物和探針用于TaqMan 分析以檢測(cè)生物樣品中是否有HAV感染。該試驗(yàn)與熱循環(huán)聯(lián)用，監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的產(chǎn)生情況。該分析系統(tǒng)不需要進(jìn)行凝膠電泳，并且能定量檢測(cè)靶序列的拷貝數(shù)。利用AmpliTaq Gold DNA聚合酶可以很方便地進(jìn)行突光5’核酸酶分析,該酶具有5’核酸內(nèi)切酶活性，該酶消化同時(shí)以有熒光報(bào)道染料和淬滅劑標(biāo)記的內(nèi)部寡核苷酸探針(見 Holland 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991) 88 :7276-7280 ；以及 Lee 等，Nucl. AcidsRes. (1993)21 :3761-3766)。通過測(cè)定擴(kuò)增循環(huán)中熒光強(qiáng)度的變化就可以得到分析結(jié)果，因?yàn)閿U(kuò)增循環(huán)中，熒光探針被消化后，染料標(biāo)記與淬滅劑標(biāo)記解離引起熒光信號(hào)增強(qiáng)。擴(kuò)增產(chǎn)物可在溶液中檢測(cè)或者用固相支持物檢測(cè)。這種方法中，TaqMan 探針應(yīng)設(shè)計(jì)為可與PCR產(chǎn)物內(nèi)的靶序列雜交。TaqMan 探針的5’端含熒光報(bào)道染料，其3’端被封閉以避免探針延伸并含有一個(gè)可淬滅5’熒光團(tuán)所發(fā)熒光的染料。在隨后的擴(kuò)增過程中，如果反應(yīng)液中的聚合酶具有5’外切酶活性就會(huì)將5’熒光標(biāo)記物切下，由此導(dǎo)致檢測(cè)到熒光增強(qiáng)。所以，本發(fā)明內(nèi)容之一涉及采用具有5’到3’外切酶活性的核酸聚合酶、能與HAV靶序列雜交的一個(gè)或多個(gè)引物以及能與位于引物3’端的HAV靶序列雜交的寡核苷酸探針來擴(kuò)增靶HAV核苷酸序列的方法。在擴(kuò)增過程中，寡核苷酸探針與靶序列雜交后被聚合酶消化，使得報(bào)道分子與淬滅分子分離。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，可逐漸檢測(cè)到報(bào)道分子的熒光，這樣的熒光表征了核酸的擴(kuò)增。報(bào)道分子優(yōu)選熒光素染料，淬滅分子優(yōu)選羅丹明染料。引物和探針的長(zhǎng)度可以改變，探針序列應(yīng)該具有比引物序列更高的解鏈溫度。探針序列所預(yù)計(jì)的解鏈溫度最好比擴(kuò)增引物序列的解鏈溫度高出約10°C。所以，引物通常比探針短。一般來說，引物的長(zhǎng)度為10-75個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是20-45個(gè)核苷酸。探針的長(zhǎng)度通常在10-50個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選的是15-40個(gè)核苷酸之間。
對(duì)TaqMan 分析及其所用試劑和反應(yīng)條件的詳細(xì)描述見Holland等，Proc.Natl. Acad. Sci，U.S.A. (1991)88 :7276-7280 ；美國(guó)專利 Nos. 5，538，848、5，723，591 和5，876，930。本文所描述的HAV序列也可作為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。TMA是ー種檢測(cè)生物樣品中極少量靶核酸序列的方法。如此含量的序列用直接檢測(cè)方法很難或不可能檢測(cè)到。具體地說，TMA是ー種等溫自催化核酸靶序列擴(kuò)增系統(tǒng)，可以擴(kuò)增出10億以上靶序列的RNA拷貝。該方法可以是定性的，即精確地檢測(cè)生物樣品中是否存在靶序列。該方法也可以在幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)定量檢測(cè)靶序列。TMA可自催化合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝而不用重復(fù)調(diào)整如溫度、離子強(qiáng)度和PH等反應(yīng)條件。一般來說，TMA包括以下步驟(a)從懷疑被HAV感染的感興趣的生物樣品中分離核酸，包括RNA;以及(b)制備含下列物質(zhì)的反應(yīng)混合物(i)分離的核酸，(ii)第一和第二寡核苷酸引物，第一引物具有與可能存在的RNA靶序列(如⑴鏈)3’端部分足夠互補(bǔ)從而可的與之形成復(fù)合物的復(fù)合序列，第二引物具有與可能存在互補(bǔ)RNA靶序列(如(-)鏈)3’端部分足夠互補(bǔ)從而可的與之形成復(fù)合物的的復(fù)合序列，其中第一寡核苷酸引物在所述復(fù)合序列的5’端還含有一段帶啟動(dòng)子的序列，(iii)反轉(zhuǎn)錄酶或RNA和DNA依賴性DNA聚合酶，(iv)選擇性降解RNA-DNA復(fù)合物中RNA鏈的酶(如RNA酶H)，以及(v)能識(shí)別啟動(dòng)子的RNA聚合酶。反應(yīng)混合物中的各組分可先后混合也可以一次混合。反應(yīng)混合物在能形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物的條件下孵育足夠的時(shí)間以獲得靶序列的大量拷貝，所述條件包括核酸轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和核酸合成條件(包括核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸)。反應(yīng)條件最好保持反應(yīng)組分如酶的穩(wěn)定并且無需在擴(kuò)增反應(yīng)過程進(jìn)行修改或調(diào)整。因此，反應(yīng)條件可以是基本恒溫，且離子強(qiáng)度和pH也基本恒定。該反應(yīng)不需要通過變性來將第一輪DNA延伸反應(yīng)中產(chǎn)生的RNA-DNA復(fù)合物分離。適宜的DNA聚合酶包括反轉(zhuǎn)錄酶，如禽髓母細(xì)胞過多癥病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶(可從Seikagaku America, Inc.購(gòu)買)和Moloney鼠白血病病韋(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶(可從Bethesda Research Laboratories 購(gòu)頭)。適于摻入到引物內(nèi)的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子序列是能被RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄由此獲得RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸序列(天然的、合成的或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物)。該序列可以比RNA聚合酶實(shí)際識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)，這樣可以增加穩(wěn)定性或?qū)到膺^程的敏感性或提高轉(zhuǎn)錄效率?？捎玫膯?dòng)子的例子包括能被某些噬菌體聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，如那些噬菌體T3、I7或SP6來源的啟動(dòng)子或大腸桿菌的啟動(dòng)子。這些RNA聚合酶很容易購(gòu)買到，如從 New England Biolabs 和 Epicentre 購(gòu)買。適用于本發(fā)明方法的反轉(zhuǎn)錄酶有些具有RNA酶H活性，如AMV反轉(zhuǎn)錄酶。然而，SP使用的是AMV反轉(zhuǎn)錄酶，最好還是采用外源RNA酶H，如大腸桿菌的RNA酶H。RNA酶H很容易買到，如從 Bethesda Research Laboratories 購(gòu)買。利用這些方法制備的RNA轉(zhuǎn)錄物可作為模板通過上述機(jī)制制備更多的靶序列拷貝。該系統(tǒng)是自催化性的，不需要重復(fù)修改或調(diào)整反應(yīng)條件如溫度、pH、離子強(qiáng)度等就可以自動(dòng)催化進(jìn)行擴(kuò)増。檢測(cè)的方法多種多樣，其中包括直接測(cè)序、用序列特異性的寡聚物雜交、凝膠電泳以及質(zhì)譜法。這些方法可采用異質(zhì)形式或同質(zhì)形式，可以用放射性標(biāo)記物，也可以用非放射性標(biāo)記物，或者根本不用標(biāo)記物。優(yōu)選檢測(cè)方法之ー是利用上述靶序列特異性的寡核苷酸探針?？蓪⑻结樣糜陔s交保護(hù)分析(HPA)。在這個(gè)實(shí)施方式中，探針以吖啶酯(AE)標(biāo)記，AE是ー個(gè)高強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光分子。見Nelson等，(1995)《非同位素探針、雜交和測(cè)序》中的“根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)吖啶酷”，Kricka L. J.(編輯)Academic Press, San Diego, CA ;Nelson 等，(1994),《聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》中的“雜交保護(hù)分析(HPA)用于PCR”,Mullis等(編輯)Birkhauser,Boston,MA ;Weeks等，Clin. Chem. (1983)29 :1474-1479 ;Berry 等，Clin. Chem. (1988)34:2087-2090。ー個(gè) AE分子通過非核苷酸連接臂直接連接到探針上，這個(gè)連接臂可使標(biāo)記物放置到探針的任何位置上。見美國(guó)專利Nos. 5，585，481和5，185，439?；瘜W(xué)發(fā)光可通過與堿性過氧化氫的反應(yīng)來激發(fā)，反應(yīng)產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)N-甲基吖啶酮，它回復(fù)基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)出ー個(gè)光子。當(dāng)AE分子共價(jià)連接到核酸探針上時(shí)，其在弱堿性條件下很快水解。如果AE標(biāo)記的探針與靶核酸完全互補(bǔ)，則AE水解的速率大大降低。因此，雜交的和未雜交的AE標(biāo)記的探針不需要通過物理方法就可以直接在溶液中測(cè)知。HPA 一般由下列步驟組成(a) AE標(biāo)記的探針與靶核酸在溶液中雜交約15到30分鐘。然后加入弱堿溶液，未雜交探針上偶聯(lián)的AE被水解。該反應(yīng)大約需要5到10分鐘。檢測(cè)留下的與雜交體偶聯(lián)的AE作為靶核酸的量。這個(gè)步驟大約需要2到5秒。差異水解步驟優(yōu)選采用與雜交步驟相同的溫度，一般為50-70°C。或者，可在室溫下進(jìn)行第二次差異水解。這次可使用較高的PH，如pHlO-11，這樣雜交的和未雜交的AE標(biāo)記探針之間水解速率的差異就會(huì)擴(kuò)大。關(guān)于HPA的描述見美國(guó)專利N0S. 6，004，745 ;5，948，899515以及5，283，174。有關(guān)TMA的描述見美國(guó)專利NO. 5，399，491。在ー標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施例中，分離出的懷疑含有HAV靶序列的核酸樣品與緩沖濃縮物混合，緩沖濃縮物中含有緩沖劑、鹽、鎂、核苷三磷酸、引物、ニ硫蘇糖醇及亞精胺。反應(yīng)可在約100°C孵育約2分鐘使各種ニ級(jí)結(jié)構(gòu)變性。冷卻到室溫后，加入反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶和RNA酶H，混合物在37°C孵育2-4小吋。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，即將產(chǎn)物變性，加入探針溶液，60°C孵育20分鐘，加入特異性水解未雜交的探針的溶液，60°C孵育6分鐘，在光度計(jì)上測(cè)定留下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。很容易理解的是，本文所描述的試驗(yàn)方法可以做出大量的修改，這些修改都是本領(lǐng)域所熟知的。上面的說明書只是作為一個(gè)指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)很容易對(duì)本文描述的方法做出修改。上面所描述的試驗(yàn)用試劑，包括引物、探針、結(jié)合有探針的固相支持物以及其他檢測(cè)試劑可以試劑盒的形式提供，再配以說明書和其他必需的試劑，這樣就可以進(jìn)行上述的試驗(yàn)。試劑盒通常包括裝在各自容器內(nèi)的以下試劑引物和探針(已經(jīng)結(jié)合在固相基質(zhì)上，或者另有將其固定到基質(zhì)上的試劑)、對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照和/或陰性對(duì)照)、試驗(yàn)可能需要的標(biāo)記試劑以及如果標(biāo)記物不能直接產(chǎn)生信號(hào)時(shí)的信號(hào)產(chǎn)生試劑(如酶底物)通常還包括 指導(dǎo)如何進(jìn)行試驗(yàn)操作的說明書(書寫的、打印的、VCR、CD-R0M等)。根據(jù)所進(jìn)行的試驗(yàn)的不同，試劑盒還可以包含其他試劑和材料(如洗滌緩沖液等)。如上面所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法可用這些試劑盒進(jìn)行。III.試驗(yàn)下面所描述的是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
的實(shí)施例。實(shí)施例只是用于說明，而不意味著以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍作出限制。我們已經(jīng)盡了最大努力確保所使用數(shù)字的準(zhǔn)確性(如數(shù)量、溫度等)，但是某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差仍在所難免。在下面的實(shí)施例中，所用的酶都是購(gòu)買的，并按照廠商的說明書來使用。硝酸纖維素濾膜等也是購(gòu)買的。在分離RNA和DNA片段吋，除非特別指出，所有有關(guān)RNA和DNA的操作都是按標(biāo)準(zhǔn) 程序進(jìn)行的。見上述的Sambrook等。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、大腸桿菌DNA聚合酶
I、Klenow片段及其他生物試劑均可從生產(chǎn)廠家買到并按照廠商的說明書來使用。雙鏈核酸片段以瓊脂糖電泳上分開。實(shí)施例I從生物樣品中提取HAV RNAHAV核酸陽(yáng)性血清購(gòu)自BioClinical Partners (Berkeley, CA)。用兩種方法從樣品中分離核酸。具體地說，通過(a)結(jié)合到ニ氧化硅上；(b)與靶-特異性寡核苷酸復(fù)性來提取RNA。(a)通過結(jié)合到ニ氧化硅上分離核酸利用Boom, R.等，(1990)“純化核酸的快速而簡(jiǎn)單的方法”,J. Clin. Microbiol. 28,495-503所描述的方法通過結(jié)合到ニ氧化硅上來提取RM。在存在高濃度的高離液鹽如異硫氰酸鹽胍的情況下，核酸可以結(jié)合到ニ氧化硅上。小的核酸在酸性PH條件下結(jié)合ニ氧化硅的效率更高。結(jié)合的核酸在低鹽、堿性PH緩沖液、高溫條件下很容易被洗脫下來。利用磁化ニ氧化硅代替普通ニ氧化硅可大大促進(jìn)核酸分離中洗滌和洗脫。用磁性底來捕捉結(jié)合了核酸的ニ氧化硅顆粒，這樣就無需沉淀普通ニ氧化硅顆粒所必需的離心。所用的裂解緩沖液購(gòu)自O(shè)rganon-Teknika (Durham, NC)。這種裂解緩沖液所含有的異硫氰酸鹽胍可溶解蛋白和滅活RNA酶和DNA酶。去污劑Triton X-100可促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和核蛋白的溶解和分解從而釋放出核酸。裂解試劑被酸化后可增強(qiáng)核酸的結(jié)合，用50 Ul堿性洗脫緩沖液洗脫結(jié)合的核酸。用預(yù)先分裝好的9. Oml裂解劑從2. Oml HAV IgM陽(yáng)性血衆(zhòng)中提取核酸。用磁化ニ氧化娃(MagPrep顆粒,購(gòu)自Novagen,Madison, WI)捕捉結(jié)合了核酸的ニ氧化硅顆粒，這樣就無需沉淀普通ニ氧化硅顆粒所必需的離心。結(jié)合的核酸在50 U I含ImM EDTA、pH為9. 0的IOmM Tris中洗脫。分離出核酸以后，通過下述TaqMan PCR確定HAV是否存在。(b)通過與靶-特異性的寡核苷酸復(fù)性來分離核酸雖然利用磁化ニ氧化硅加快并簡(jiǎn)化了洗滌和洗脫步驟，但是分離核酸仍然費(fèi)カ費(fèi)吋。因此可以用磁珠從血漿或血清中一步分離出特定靶核酸。為了使這種方法可適用于各種病毒核酸捕捉試驗(yàn)故采用偶聯(lián)寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(寡聚dT)的通用磁珠。帶有約14bp寡聚dT的Sera-Mag磁性寡聚(dT)磁珠(Seradyn, Indianapolis, IN)與捕捉寡核苷酸聯(lián)合使用，捕捉寡核苷酸在其3’末端含有ー個(gè)于HAV特異性序列相連的聚A尾巴(位于下述特異性序列的末端)。磁珠懸浮于0. 4ml無引物的TMA裂解緩沖液(GenProbe,San Diego, CA)中，分別加入或一起加入捕捉引物進(jìn)行試驗(yàn)。捕獲以后，用洗滌緩沖液洗滌磁珠三次，洗滌緩沖液是含
0.3M NaCl 的 IOmM Hepes ( pH 7. 5)、0. 5% NP-40。捕獲了核酸的磁珠懸浮在 100 U I TaqManー步RT-PCR試劑中，然后轉(zhuǎn)移到TaqMan RT-PCR微量滴定板上進(jìn)行以下TaqMan PCR檢測(cè)。TaqMan 分析結(jié)果表明，幾種寡核苷酸組合物可有效捕獲HAV。所用的捕捉寡核苷酸如下(序列后的數(shù)字對(duì)應(yīng)于該序列在HAV基因組內(nèi)的位置，所述HAV基因座為NCBI登錄號(hào)K02990。捕捉序列是所示位置的反向互補(bǔ)序列，因?yàn)镠AV是正鏈RNA病毒)CGGCGTTGAATGGTTTTTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(nt483-503，加上ー個(gè) 22bp 聚 A 尾巴，p =磷酸化的)(SEQID NO 4)TCACCAATATCCGCCGCTGTTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(nt451-474，加上ー個(gè) 22bp 聚 A 尾巴，p =磷酸化的)(SEQID NO 5)AATTTAGACTCCTACAGCTCCATGCTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(nt291-319，加上ー個(gè) 22bp 聚 A 尾巴，p =磷酸化的)(SEQ ID NO 6)TTGACCCCGCCGGGCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(264-280，加上ー個(gè) 22bp 聚 A 尾巴，p =磷酸化的)(SEQ ID NO 7)GAGCCTAGGGCAAGGGGAGAGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(233-255，加上ー個(gè) 22bp 聚 A 尾巴，p =磷酸化的)(SEQ ID NO 8)AGCCTATAGCCTAGGCAAACGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp(73-95，加上ー個(gè) 22bp 聚 A 尾巴，p =磷酸化的)(SEQ ID NO 9)實(shí)施例2通過TaqMan 檢測(cè) HAV RNA用TaqMan 技術(shù)擴(kuò)增捕獲的靶RNA。為此設(shè)計(jì)了幾個(gè)HAV特異性的寡核苷酸擴(kuò)增引物。引物如下5’非翻譯區(qū)的擴(kuò)增引物和探針VHAV1-GGAITGAITGTCAGGGCTGTC(正向引物-nt538-558) (Seq ID No. 1)VHAV2-CCCTCTCACAGGATCCCAITT (反向引物-nt612-632，反向互補(bǔ))(Seq ID No.2)VHAV3-XCCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACCATTTZ (探針-nt576-605) (Seq ID No. 3)其中X = 6-FAM(熒光素)，Z =接頭+TAMRA (四甲基羅丹明)。將實(shí)施例I的核酸稀釋成約100IU/20iil。TaqMan分析所用的試劑來自AppliedBiosystems,Foster City, CA。TaqMan 反應(yīng)混合物的終體積為 50ml,含25ml TaqMan 一步RT-PCR混合物，每種擴(kuò)增引物0. 5pmol,0. 2pmol探針。反應(yīng)條件為48°C進(jìn)行30分鐘RT反應(yīng)，10分鐘96°C的酶活化，然后在95°C進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行30秒，最后在ABI7900序列檢測(cè)儀上60 V反應(yīng)30秒。使用正向PCR擴(kuò)增弓丨物VHAVl、反向引物VHAV2和探針VHAV3。制備721nts的內(nèi)對(duì)照轉(zhuǎn)錄物，圖4B(SEQ ID NO : 17)，該轉(zhuǎn)錄物可被捕獲和擴(kuò)增，但其探針結(jié)合序列被改變。圖4B所示序列中的黑體字代表IC中代替靶序列(圖4A，SEQID NO :16)相應(yīng)部分的序列。IC的探針序列示例是xCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz(SEQ ID NO:18)或 xCCCAGTGACATGCA GGTCTAGCTz (SEQ ID NO :19)，其中 x = TET, z =接頭 +TAMRA。實(shí)施例3檢測(cè)擴(kuò)增的效率和捕捉寡核苷酸組合根據(jù)NCBI K02990的序列合成HAV的5’UTR核苷酸序列。將這個(gè)序列克隆到M13質(zhì)粒中得到單鏈DNA，純化所得單鏈DNA。(a)擴(kuò)增效率
克隆的及純化后的DNA的濃度通過分光光度法測(cè)定，以10，000到0. 5Cps的DNA稀釋液進(jìn)行各次TaqMan擴(kuò)增，所用的方法、引物和探針如前所述。一般來說，在45個(gè)循環(huán)以內(nèi)樣品的信號(hào)閾值大于0. 2就認(rèn)為是陽(yáng)性。表I顯示了詳細(xì)的試驗(yàn)結(jié)果。表I
cps/rxncycie45
一0. 5cp _0. 157663 —
Icp0.299065
5cp0.8231
IOcp _I. 115975 __
_50cp _I. 34539__100cp _I. 13805_
_500cp _2. 361416 __
IOOOcp __2. 478576 __
_5000cp _2. 815369 __
lOOOOcp _2. 887422 一
陰性 _0. 072094 __
陰性0.04076(b)捕捉寡核苷酸混合物捕捉/引物混合物的效率用25Cps/反應(yīng)的ssDNA來檢測(cè)。含SEQ ID NOs :4、5、
6、7、8和9序列的摘捉募核昔酸的混合物效率最尚。以上描述了新的HAV序列和利用這些序列進(jìn)行檢測(cè)的方法。根據(jù)前面的描述，雖然本文為了說明本發(fā)明已經(jīng)描述了本發(fā)明的ー些具體實(shí)施方式
，但是本發(fā)明的精神和范圍還包括各種修改形式。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)度不超過60個(gè)核苷酸的游離寡核苷酸，包含 (a)具有選自SEQID NOs :1、2和3的序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列； (b)與(a)的核苷酸序列有90%—致性的核苷酸序列；或者 (c)(a)和(b)的互補(bǔ)序列。
2.如權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中的寡核苷酸是具有選自SEQID N0s:l、2和3的序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQID N0:1。
4.如權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQID N0:2。
5.如權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQID NO :3。
6.如權(quán)利要求5所述的寡核苷酸，該寡核苷酸在其5’和/或3’末端還含有可檢測(cè)標(biāo)記物。
7.如權(quán)利要求6所述的寡核苷酸，其中的可檢測(cè)標(biāo)記物是選自下列一組的熒光標(biāo)記物6_羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯_4_7_ 二氯熒光素(TET)。
8.用于擴(kuò)增甲型肝炎病毒核酸的一對(duì)引物，所述的引物對(duì)分別由含SEQIDNO :1和SEQID NO 2的引物構(gòu)成。
9.一種檢測(cè)生物樣品中甲型肝炎病毒(HAV)的方法，該方法包括 從懷疑含有HAV的生物樣品中分離核酸； 用至少兩個(gè)來源于HAV基因組5’ UTR區(qū)的引物擴(kuò)增所述分離核酸，其中每個(gè)引物的長(zhǎng)度為10-60bp，并且分別與所述分離核酸的正義鏈和反義鏈的部分序列具有足夠的互補(bǔ)性以與之雜交；以及 檢測(cè)擴(kuò)增的核酸，如有擴(kuò)增的核酸則表明樣品中存在HAV。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，(a)引物之一含有SEQID NO 1中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，另一個(gè)引物含有SEQ ID NOs :2中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，或者(b)引物序列與(a)所述核苷酸序列具有90%的一致性；以及 檢測(cè)擴(kuò)增的核酸，如有擴(kuò)增的核酸則表明樣品中存在HAV。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，將核酸從生物樣品中分離的方法包括 (a)使結(jié)合了含捕捉核酸的固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及 (b)從樣品中分離固相支持物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中的固相支持物包含小珠。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中的小珠是磁珠。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中分離、擴(kuò)增和檢測(cè)在一個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中的捕捉核酸含有一種或多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸的長(zhǎng)度都不超過60個(gè)核苷酸并含有選自SEQ ID NO 10, SEQ IDNO =IUSEQ ID NO.12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中的捕捉核酸在其3’或5’端還含有一個(gè)約15-25個(gè)核苷酸的同聚物鏈，所述同聚物鏈選自 聚A、聚T、聚G、聚C和聚U。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中的同聚物鏈?zhǔn)蔷跘鏈。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，其中擴(kuò)增方法包括PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TM)或TaqMan0
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中擴(kuò)增方法包括TMA。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，該方法還包括利用含可檢測(cè)標(biāo)記物的寡核苷酸探針檢測(cè)擴(kuò)增序列的步驟，其中寡核苷酸探針的長(zhǎng)度不超過約60個(gè)核苷酸并含有SEQ ID NO:3中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中探針在其5’末端和3’末端含有可檢測(cè)標(biāo)記物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)記物是選自下列一組的熒光標(biāo)記物6-羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯_4_7_ 二氯熒光素(TET)。
23.—種檢測(cè)生物樣品中甲型肝炎病毒(HAV)感染的方法，該方法包括 (a)使固相支持物與含一種或多種寡核苷酸的捕捉核酸接觸,所述一種或多種寡核苷酸具有選自 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO : 13 和 SEQ ID NO 14的序列，接觸在能使捕捉核酸連接到固相支持物上的條件下進(jìn)行， (b)使步驟(a)后的固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使樣品中可能存在的HAV來源的靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及 (c)將步驟(b)后的固相支持物與樣品分開； (d)用含SEQID NO :1的正向引物和含SEQ ID NO :2的反向引物擴(kuò)增核酸，其中正向引物和反向引物分別與分尚核酸的正義鏈部分和反義鏈的部分序列充分互補(bǔ)以與之雜交；以及 (e)檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列，如有擴(kuò)增的靶核酸序列則表明樣品中存在HAV。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中的固相支持物包含小珠。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中的小珠是磁珠。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中分離、擴(kuò)增和檢測(cè)是在一個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行。
27.一種檢測(cè)生物樣品中是否存在甲型肝炎病毒(HAV)的試劑盒，該試劑盒包括； 含有一種或多種寡核苷酸的捕捉核酸，其中每種寡核苷酸的長(zhǎng)度都不超過約60個(gè)核苷酸并具有選自 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDNO 14的序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸； 至少兩個(gè)引物，其中(a)每個(gè)引物的長(zhǎng)度不超過約60個(gè)核苷酸，引物之一含有SEQ IDNO :1中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，另一個(gè)引物含有SEQ ID NO :2中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸；以及 鑒定HAV感染的文字說明。
28.如權(quán)利要求27所述的試劑盒，該試劑盒還包括聚合酶和緩沖液。
29.如權(quán)利要求27所述的試劑盒，該試劑盒還包括寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度不超過約60個(gè)核苷酸并含有SEQ ID NO :3中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，所述探針在其5’末端和3’末端還含有可檢測(cè)標(biāo)記物。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，所述可檢測(cè)標(biāo)記物是選自下列一組的熒光標(biāo)記物6-羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯_4_7_ 二氯熒光素(TET)。
全文摘要
本發(fā)明公開了甲型肝炎病毒基因組保守區(qū)來源的甲型肝炎病毒特異性的引物和探針。本發(fā)明還公開了利用捕捉寡核苷酸、引物和探針的核酸分析方法。
文檔編號(hào)C12N15/51GK102660539SQ20121007956
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月12日
發(fā)明者V·石亞馬拉 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷公司