專利名稱：改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術、病毒檢測和醫(yī)學領域，具體涉及病毒分子檢測技術領域。涉及一種準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法，本發(fā)明還涉及到多重熒光PCR反應中引物設計的方法，以及同時檢測多種病毒的反應體系參數和程序參數。本發(fā)明為多重熒光PCR的研究提供了便利，同時具有廣泛的科研價值和應用前景。
背景技術：
實時熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的ー種新的實時定量檢測特定核酸技術，與普通PCR相比，具有定量準確、快速、靈敏度高和特異性強等特點，它已被廣泛地應用于生命科學研究的各個領域，如單細胞或活細胞中RNA的定量、細胞因子的研究、單核苷酸多態(tài)性的檢測、病毒篩選、細菌病原體檢測等。從原理上講有兩大類熒光模式第一種為熒光雜交 探針，如Taqman、分子信標等，基于能量共振轉移的原理(FRET);第二種為DNA結合染料，主要為Sybr Green I。前面ー種方法特異性好，除需要合成序列特異引物外，還需要合成高成本的熒光探針，成本較高；后ー種方法經濟，只需合成序列特異引物，但特異性相對較差，受引物ニ聚體的影響。實時熒光染料法檢測擴增產物的代表是Sybr Green I熒光染料，新型熒光染料EvaGreen也能用于熒光PCR技術。EvaGreen只與DNA雙鏈結合，插入DNA雙鏈時發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時釋放出來，熒光信號急劇減弱。在加入了熒光染料的體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。相對于Sybr Green I來說消除了“染料重分布”的缺陷，且對PCR擴增的抑制作用很小。目前發(fā)展起來的多重實時熒光染料PCR技術可以在同一個PCR反應中，通過Tm值分析來區(qū)分不同的核酸片段。多重實時熒光PCR技術因具有高效快捷、高產率、高度特異敏感、能降低實驗成本以及加速實驗進程等優(yōu)點而得到廣泛的應用。研究證明升溫速率在O. I0C /s-0. 2V /s時熔解曲線可以區(qū)分Tm值差距2°C左右的不同擴增產物，這給引物設計增加一定困難的同時，也限制了部分達不到標準升溫速率的實驗儀器的應用。因此，在現有較為普遍的實驗環(huán)境條件下，建立一種準確、快速改變產物Tm值達到多重實時熒光PCR的方法，具有廣泛的科研價值和應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種準確、快速改變PCR產物TM值達到多重熒光PCR的方法，使不同PCR產物的Tm值差距至少大于2°C，采用該方法能夠在不同型號的實時熒光定量PCR儀器上有效的區(qū)分不同的產物。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法；在原有不同擴增片段Tm值的基礎上，選擇性地挑選至少I種目的片段小的產物，并在所述產物原有上下游引物5’端基于引物設計原則有針對性地添加堿基，當期望產物TM值變大則相應地多增加堿基GC，當期望產物Tm值變小則相應地多增加堿基AT，從而改變整個擴增片段GC%的比值，以致達到期望的擴增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效的區(qū)分不同擴增片段。作為本發(fā)明的準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法的改進I)、PCR 引物設計；2)、樣品總RNA的(少量)抽提；3)、反轉錄合成cDNA ；4)、多重熒光PCR擴增；5)、根據多重熒光PCR擴增結果調整步驟I)中的PCR引物，調整規(guī)則如下當任意2種擴增片段的Tm值的差<2時，選取其中ー個進行改變；改變規(guī)則為在該擴增片段所對應的原有上下游引物5’端基于引物設計原則有針對性地添加堿基當期 望產物Tm值變大則相應地多增加堿基GC，當期望產物Tm值變小則相應地多增加堿基AT。作為本發(fā)明的準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法的進ー步改進多重熒光PCR 反應體系為5μ I 的 10XPCR buffer, 5 μ I 的 25mM MgCl2,4 μ I 的dNTP(10mM，每種 2. 5mM), 2. 5 μ I 的 EvaGreen, O. 5 μ I 的 DNA 聚合酶，2 μ I 步驟 3)合成的cDNA以及步驟I)所設計的引物(為引物對，包括上、下游引物)中的至少2種(即任意兩種組合、任意三種的組合、或任意四種的組合等等)，每種引物各O. 1-1 μ Μ，反應體系總體積 50 μ I (dd H2O 補足)；所用儀器為ABI 7000熒光定量PCR儀，熒光PCR擴增程序為95 V 3min ；95°C 15s ；58°C 30s ；72°C 30s，熔解曲線程序為 95°C 15s, 60°C 30s, 95°C 15s ;從60で開始
收集突光信號。本發(fā)明還同時提供了利用上述方法所得的改變PCR產物Tm值的用途準確、快速的達到多重實時熒光PCR。本發(fā)明的目的在于解決以下問題(I)、多重實時熒光PCR引物設計要求條件較高，每ー對引物都要在保守區(qū)域內設計，擴增片段在200bp以下，且無非特異性擴增和引物ニ聚體的生成，另外多種引物對在ー個體系內也必須無相互干擾，無引物ニ聚體生成。往往滿足這些嚴格的要求之后，每種擴增產物相互之間Tm差值難以有效區(qū)分開。(2)、多重實時熒光PCR熔解曲線的制作對實時熒光定量儀器要求的條件較高，有研究證明升溫速率在O. l°C/s-0.2°C/s時，熔解曲線可以區(qū)分Tm值差距2°C左右的不同擴增產物，反之較大的升降溫速率則容易使相鄰的兩種擴增產物的熔解曲線峰發(fā)生融合，但是目前普遍使用的熒光定量儀都達不到O. I0C /s-0. 2V /s的升溫速率，例如ABI 7300熒光定量儀的升溫速率就高達I. I0C /S。因此建立一種準確、快速改變產物Tm值達到多重實時熒光PCR的方法可使多重實時熒光PCR發(fā)揮更大的應用價值。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是對多重熒光PCR產物中某種或者某幾種產物進行簡便有效地調節(jié)產物Tm值。在反應體系離子濃度一定的條件下，Tm值主要由產物長度，GC含量及GC分布結構決定的。在不改變原有產物的基礎上，結合引物設計原則在上游引物和下游引物的5’端添加若干堿基，改變整個擴增產物的GC%，期望產物TM值變大則相應地增加GC堿基，期望產物Tm值變小則相應地増加AT堿基，改變整個擴增片段GC%的比值，以致達到期望的擴增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效地區(qū)分不同擴增片段。且若擴增片段越短那么在引物上人為增加一些堿基對整個擴增片段的Tm值影響越顯著，從而達到改變整個擴增產物Tm值的目的。本發(fā)明具體可通過以下技術方案實現第一歩PCR引物設計本發(fā)明以4種馬鈴薯病毒馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)，馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY),馬鈴薯卷葉病毒(Potato virus, PLRV)及馬鈴薯 A 病毒(Potatovirus, PVA)為試驗對象。從NCBI中下載目前已登記的馬鈴薯病毒PVX、PVY、PLRV和PVA所有的序列，應用引物設計軟件分別設計引物，選擇各病毒擴增產物理論Tm值相差2°C左右的引物對組合，根據下述實驗測得的4種病毒擴增產物Tm值，利用上述設計原則，即有針對性地添加堿基，進行調整，最終設計出可以有效區(qū)分4種病毒擴增產物Tm值(形成不同熔解曲線峰)的引物對組合，設計引物的時候注意擴增片段長短以及引物自身和引物間ニ聚體的問題。
注表I中的PVX、PLRV-1、PVY、PVA-1所選用的引物，根據形成的引物對所對應的擴增產物理論Tm值，選擇各病毒擴增產物Tm值差距2 °C左右的引物對。表I本發(fā)明中所設計的PCR弓丨物
權利要求
1.準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法；其特征是在原有不同擴增片段Tm值的基礎上，選擇性地挑選至少I種目的片段小的產物，并在所述產物原有上下游引物5’端基于引物設計原則有針對性地添加堿基，當期望產物TM值變大則相應地多增加堿基GC，當期望產物Tm值變小則相應地多增加堿基AT，從而改變整個擴增片段GC%的比值，以致達到期望的擴增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效的區(qū)分不同擴增片段。
2.根據權利要求I所述的準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法，其特征是包括以下步驟 1)、PCR引物設計； 2)、樣品總RNA的抽提； 3)、反轉錄合成cDNA； 4)、多重熒光PCR擴增； 5)、根據多重熒光PCR擴增結果調整步驟I)中的PCR引物，調整規(guī)則如下 當任意2種擴增片段的Tm值的差<2時，選取其中一個進行改變；改變規(guī)則為在該擴增片段所對應的原有上下游引物5’端基于引物設計原則有針對性地添加堿基當期望產物Tm值變大則相應地多增加堿基GC，當期望產物Tm值變小則相應地多增加堿基AT。
3.根據權利要求2所述的準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法，其特征是所述多重熒光PCR反應體系為5μ I的IOXPCR buffer,5y I的25mM MgCl2,4y I的 dNTP (IOmM)，2. 5 μ I 的 EvaGreen，O. 5 μ I 的 DNA 聚合酶，2 μ I 步驟 3)合成的 cDNA 以及步驟I)所設計的引物中的至少2種，每種引物各O. 1-1 μ M，反應體系總體積50μ I ; 所用儀器為ABI 7000熒光定量PCR儀，熒光PCR擴增程序為95°C 3min ;95°C 15s ；58°C 30s ；72°C 30s，熔解曲線程序為95°C 15s，60°C 30s, 95°C 15s ;從60°C開始收集熒光信號。
4.如權利要求I 3任一方法所得的改變PCR產物Tm值的用途是準確、快速的達到多重實時熒光PCR。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種準確、快速改變PCR產物Tm值達到多重熒光PCR的方法；在原有不同擴增片段Tm值的基礎上，選擇性地挑選至少1種目的片段小的產物，并在所述產物原有上下游引物5’端基于引物設計原則有針對性地添加堿基，當期望產物TM值變大則相應地多增加堿基GC，當期望產物Tm值變小則相應地多增加堿基AT，從而改變整個擴增片段GC％的比值，以致達到期望的擴增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效的區(qū)分不同擴增片段。利用上述方法所得的改變PCR產物Tm值的用途是準確、快速的達到多重實時熒光PCR。
文檔編號C12Q1/68GK102827924SQ20121008235
公開日2012年12月19日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權日2012年3月26日
發(fā)明者姜永厚, 程菊會, 董沁芳, 郭江峰, 丁先鋒 申請人:浙江理工大學