專利名稱：適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用螺旋藻品系的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于螺旋藻開發(fā)應(yīng)用的技術(shù)，特別涉及一種適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用螺旋藻品系的篩選方法。
背景技術(shù)：
螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋的原核絲狀微藻，系藍(lán)藻門 (Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個(gè)屬[武漢植物學(xué)研究，1997，15(4) =369-374]。因富含優(yōu)質(zhì)蛋白和多種生物活性物質(zhì)而受到國內(nèi)外的極大關(guān)注，并已在大量研究的基礎(chǔ)上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，成為目前全球研究開發(fā)規(guī)模最大，應(yīng)用前景最廣泛的經(jīng)濟(jì)微藻。值得指出的是，眾多的實(shí)驗(yàn)研究與長期的生產(chǎn)實(shí)踐表明，螺旋藻不同品種(系)，對(duì)溫度、光質(zhì)、光照強(qiáng)度，以及培養(yǎng)液的鹽度、PH和營養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要求與適應(yīng)性存在顯著差異，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益也相差甚遠(yuǎn)[水生生物學(xué)報(bào)， 1999,23(1) 59-64] 0所以，與其它農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)一樣，選育品性兼優(yōu)的品種(系) 是有效提升當(dāng)前螺旋藻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益、切實(shí)解決生產(chǎn)實(shí)際問題，最直接而重要的途徑之一。目前國內(nèi)外篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)螺旋藻品種(系)的一般常規(guī)方法如下1、對(duì)新分離到的品種(系)進(jìn)行編號(hào)；2、在實(shí)驗(yàn)室條件下作多種環(huán)境因子的交叉組合培養(yǎng)試驗(yàn)，并根據(jù)所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標(biāo)作初步篩選；3、對(duì)實(shí)驗(yàn)室初篩到有生產(chǎn)養(yǎng)殖潛力的候選品種(系)在不同季節(jié)、氣候及營養(yǎng)條件下進(jìn)行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗(yàn)，再篩選出目標(biāo)品種(系)。這一方法雖然實(shí)用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。因此，迫切需要建立簡單、快速、有效的評(píng)價(jià)與篩選方法，以滿足當(dāng)前國內(nèi)外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的實(shí)際需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡單、快速、低成本有效的一種適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用螺旋藻品系的篩選方法。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是提供一種適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用螺旋藻品系的篩選方法，是將候選品系的基因組 DNA經(jīng)特定引物HIPS-TG擴(kuò)增，并在電泳分析后采用NTSYSpc2. I軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖； 若候選品系具有1050bp和760bp的特異DNA電泳條帶，且能與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則候選品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若候選品系具有1520bp、950bp、 720bp、700bp和500bp的特異DNA電泳條帶，且與已知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；所述特定引物HIPS-TG的序列為5’ -GCGATCGCTG-3 ’ ；所述生產(chǎn)性狀好的品系是:ZJU0103、ZJUO104,ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJU0116 ;所述生產(chǎn)性狀差的品系是ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、 ZJUOl10、ZJUOl13 和 ZJUOI14ο
該方法具體包括下述步驟(I)選用14種螺旋藻品系作為對(duì)比樣本，即ZJU0101、ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、 ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13、ZJUOl14、ZJUOl15 和 ZJUO116 ；(2)試劑和儀器TaqDNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、 RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純；序列擴(kuò)增用美國Hybaid公司的 Thermal Cycler PCR 儀;(3) PCR 擴(kuò)增將候選品系及14種對(duì)比樣本的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-TG擴(kuò)增；在25 μ L PCR反應(yīng)體系中，含10倍的PCR緩沖液2. 5 μ L，4種dNTP各I μ mol/L, 特定引物 HIPS-TG :5，-GCGATCGCTG-3，O. 5 μ mol/L, I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因組 DNA，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin ；(4)電泳分析和觀察將擴(kuò)增產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓8. 5V/cm。電泳結(jié)束后用銀染方法染色，再在VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad觀察并照相， 經(jīng)過觀察比對(duì)被篩選的螺旋藻品系用引物HIPS-TG擴(kuò)增出條帶的分子量；(5)聚類圖的構(gòu)建對(duì)上述候選品系及14種對(duì)比樣本的電泳結(jié)果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權(quán)平均法進(jìn)行分析和構(gòu)建藻株間的聚類圖，并根據(jù)聚類情況進(jìn)行判斷。本發(fā)明的有益效果是 本發(fā)明所建立的鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀優(yōu)良品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單、快速、有效，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。


圖I為14株螺旋藻品系中擴(kuò)增條帶的電泳圖；其中M :標(biāo)準(zhǔn)分子量；CK :陰性對(duì)照；I 14 :依次對(duì)應(yīng) ZJUO10 K ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108、ZJUO109/RH、ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115 和 ZJUO116。圖2為14株用于構(gòu)建生產(chǎn)性狀鑒別標(biāo)準(zhǔn)的螺旋藻品系的聚類圖。圖3為被鑒別藻株ZJUOl 17和ZJUOl 18的電泳圖；其中M :標(biāo)準(zhǔn)分子量；CK :陰性對(duì)照；1 ZJU0117 ；2 ZJU0118o圖4為被鑒別藻株ZJU0117與ZJU0118在所建鑒別標(biāo)準(zhǔn)中的歸類圖。
具體實(shí)施例方式我們?cè)陂L期的螺旋藻分子遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，螺旋藻與魚腥藻和項(xiàng)圈藻等其它藍(lán)藻一樣，在基因組中都有一段因品種(系)而不盡相同的特殊的高度回文序列(highly iterated palindromic sequence, HIPS) [Microbiology, 1998,144 :2791-2801]。本發(fā)明建立了一種以HIPS中特定序列HIPS-TG(5’ -GCGATCGCTG-3’ )為引物并結(jié)合PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)判別螺旋藻品系能否應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)的新方法。我們以HIPS中特定序列HIPS-TG(5’ -GCGATCGCTG-3’ )為引物對(duì)14株螺旋藻 ZJUO10 K ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJU0109/RH、 ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115和ZJUO116進(jìn)行DNA多態(tài)性擴(kuò)增，并經(jīng)電泳與聚類分析發(fā)現(xiàn)，14 株品系可分為兩大類ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 為第 I 類；ZJUO101, ZJUO102, ZJUO106, ZJUO109/RH, ZJUO110, ZJUO113 和 ZJUO114 為第II類。同時(shí)，從它們的電泳圖譜上也可見這兩類品系間DNA帶的特異性，即1050bp和 760bp的DNA帶為上述第I類品系所特有，而1520bp、950bp、720bp、700bp和500bp的DNA 條為第II類品系所特有。長期的科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐表明，上述第I類中的7株品系在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的7株品系因適應(yīng)能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見，HIPS-TG對(duì)螺旋藻基因組DNA的特異性擴(kuò)增條帶與螺旋藻的生產(chǎn)性狀間所存的上述顯著相關(guān)性，可作為鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的分子標(biāo)記，即候選品系經(jīng)引物 HIPS-TG擴(kuò)增的產(chǎn)物中，具1050bp和760bp的特異DNA電泳條帶，能與聚上述第I類品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；而具1520bp、950bp、720bp、700bp和500bp 的特異DNA電泳條帶，與上述第II類品系聚在一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案可以通過以下步驟實(shí)施I、選用材料為公知的14株螺旋藻品系ZJU0101、ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13、ZJUOl 14、ZJUOl 15 和ZJU0116，在浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物資源與分子工程實(shí)驗(yàn)室也有保存。其中，ZJUO103, ZJUO104, ZJU0105、ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 生產(chǎn)性狀好，被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)；而 ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13 和ZJUO114因生產(chǎn)性狀差而不適用于工廠化生產(chǎn)。2、試劑和儀器Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純。序列擴(kuò)增用美國 Hybaid 公司的 Thermal Cycler PCR 儀。3、PCR 擴(kuò)增25 μ L PCR反應(yīng)體系中，含10倍的PCR緩沖液2. 5 μ L，4種dNTP各I μ mol/L,特定引物 HIPS-TG :5’ -GCGATCGCTG-3，O. 5 μ mol/L，I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因組 DNA, PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0所述4 種 dNTP 是指 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP。4、電泳分析和觀察將擴(kuò)增產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓8. 5V/cm。電泳結(jié)束后用銀染方法染色，再在VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad (USA)觀察并照相，經(jīng)過觀察比對(duì)被篩選的螺旋藻品系用引物HIPS-TG擴(kuò)增出條帶的分子量。5、聚類圖的構(gòu)建對(duì)上述ZJU0101、ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJUO108, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13、ZJUOl 14、ZJUOl 15 和 ZJUO116 的電泳結(jié)果采用 NTSYSpc2. I軟件以非加權(quán)平均法(UPGMA)進(jìn)行分析，并構(gòu)建藻株間的聚類圖。6、結(jié)果與分析HIPS-TG擴(kuò)增特異性條帶電泳分析ZJUO10K ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJUO109/RH、ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115 和 ZJUO116 的基因組 DNA 分別經(jīng)特定弓 I 物HIPS-TG擴(kuò)增，結(jié)果如圖I所示。1050bp和760bp的DNA帶僅出現(xiàn)在ZJU0103、ZJU0104、 ZJU0105、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0115 和 ZJUO116 品系中，而 1520bp、950bp、720bp、700bp 和 500bp 的 DNA 帶僅出現(xiàn)在 ZJUO10K ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13 和 ZJUO114品系中，表現(xiàn)出顯著的特異性。進(jìn)一步將電泳結(jié)果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權(quán)平均法(UPGMA)進(jìn)行分析，并構(gòu)建藻株間的聚類圖，結(jié)果如圖2所示。14株品系正好被聚為兩大類:ZJU0103、ZJUO104, ZJU0105、ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 為第 I 類， ZJUO10K ZJUO102, ZJUO106、ZJU0109/RH、ZJUO110、ZJUOl 13 和 ZJUO114 聚為第 II 類，這與上述擴(kuò)增DNA特異性差異條帶的結(jié)果相吻合。長期的科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐表明，上述第I類中的7株品系在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的7株品系因適應(yīng)能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見， HIPS-TG對(duì)螺旋藻基因組DNA的特異性擴(kuò)增條帶與螺旋藻的生產(chǎn)性狀間所存的上述顯著相關(guān)性，可作為鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的分子標(biāo)記，即候選品系經(jīng)引物HIPS-TG擴(kuò)增的產(chǎn)物中，具1050bp和760bp的特異DNA電泳條帶，能與聚上述第I類品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；而具1520bp、950bp、720bp、700bp和500bp的特異DNA 電泳條帶，與上述第II類品系聚在一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。作為實(shí)例，我們選取了 ZJUO117和ZJUO118這2株品系來驗(yàn)證本發(fā)明的實(shí)用性，其中，ZJU0117品系的生產(chǎn)性狀好，被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)，而ZJU0118因生產(chǎn)性狀差而不適用于工廠化生產(chǎn)。ZJU0117和ZJU0118基因組DNA分別經(jīng)特定引物HIPS-TG擴(kuò)增， 如圖3所示，ZJUOl 17品系具1050bp和760bp的特異性DNA帶，而ZJUOl 18品系具1520bp、 950bp、720bp、700bp和500bp的特異性DNA帶。同時(shí)，利用NTSYSpc2. I軟件等分析表明， ZJUOl 17 與生產(chǎn)性狀好的第 I 類 ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和ZJUO116聚在一起；而ZJUO118與生產(chǎn)性狀差的第II類ZJUO10K ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUO110, ZJU0113和ZJU0114聚在一起(圖4)。該例子進(jìn)一步說明，引物 HIPS-TG擴(kuò)增的特異性DNA帶，可作為一種分子標(biāo)記來篩選適用于大規(guī)模生產(chǎn)的螺旋藻品系O
權(quán)利要求
1.一種適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用螺旋藻品系的篩選方法，其特征在于，是將候選品系的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-TG擴(kuò)增，并在電泳分析后采用NTSYSpc2. I軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系具有1050bp和760bp的特異DNA電泳條帶，且能與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則候選品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若候選品系具有1520bp、 950bp、720bp、700bp和500bp的特異DNA電泳條帶，且與已知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起， 則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；所述特定引物HIPS-TG的序列為5’ -GCGATCGCTG-3’ ；所述生產(chǎn)性狀好的品系是:ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJU0116 ;所述生產(chǎn)性狀差的品系是ZJU0101、ZJU0102、ZJU0106、ZJU0109/RH、ZJU0110、 ZJUOl13 和 ZJUOI14ο
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，具體包括下述步驟(1)選用14種螺旋藻品系作為對(duì)比樣本，即ZJUO10KZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13、ZJUOl14、ZJUOl15 和 ZJUO116 ；(2)試劑和儀器TaqDNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、 RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純；序列擴(kuò)增用美國Hybaid公司的 Thermal Cycler PCR 儀；(3)PCR擴(kuò)增將候選品系及14種對(duì)比樣本的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-TG擴(kuò)增；在25 μ L PCR反應(yīng)體系中，含10倍的PCR緩沖液2. 5 μ L，4種dNTP各I μ mol/L,特定引物 HIPS-TG :5’-GCGATCGCTG-3’0. 5μ mol/L，I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因組 DNA， PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin ；(4)電泳分析和觀察將擴(kuò)增產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓8. 5V/cm ;電泳結(jié)束后用銀染方法染色，再在凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad觀察并照相，經(jīng)過觀察比對(duì)被篩選的螺旋藻品系用引物HIPS-TG擴(kuò)增出條帶的分子量；(5)聚類圖的構(gòu)建對(duì)上述候選品系及14種對(duì)比樣本的電泳結(jié)果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權(quán)平均法進(jìn)行分析和構(gòu)建藻株間的聚類圖，并根據(jù)聚類情況進(jìn)行判斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及螺旋藻開發(fā)應(yīng)用技術(shù)，旨在提供一種適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用螺旋藻品系的篩選方法。該方法是將候選品系的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-TG擴(kuò)增，并在電泳分析后采用NTSYSpc2.1軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系具有1050bp和760bp的特異DNA電泳條帶，且能與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則候選品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若候選品系具有1520bp、950bp、720bp、700bp和500bp的特異DNA電泳條帶，且與已知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明所建立的鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀優(yōu)良品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單、快速、有效，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102605077SQ201210082738
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者于金鑫, 劉新穎, 汪志平, 王景梅, 藍(lán)瑾瑾, 邵斌, 陳子元 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)