專利名稱：小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物育種學(xué)領(lǐng)域，涉及小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，提供人類大約20%的能量。在小麥生產(chǎn)中許多生物與非生物逆境直接影響小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)。赤霉病就是其中最重要的一種生物逆境，嚴(yán)重影響小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量?？共∑贩N的選育和應(yīng)用是控制赤霉病最經(jīng)濟有效的方法， 抗病基因的發(fā)掘是抗病育種的前提和基礎(chǔ)，而開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記更是應(yīng)用抗病基因的關(guān)鍵。小麥對赤霉病的抗性主要有五種類型(Mesterhazy 1995),其中抗侵染(Type I) 和抗擴展(Type II) (Schroeder and Christensen 1963)是最主要的兩種類型。Type I 抗性主要反映小麥抵抗病原菌的初侵染，是小麥抵御赤霉菌危害的第一道屏障，在抗性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。許多研究表明小麥對赤霉病的抗性是典型的數(shù)量性狀，受多基因控制。迄今為止已經(jīng)定位了 200多個抗赤霉病QTL，其中位于4B染色體上的抗赤霉病侵染QTL存在于多個抗性種質(zhì)中，表達(dá)穩(wěn)定且效應(yīng)較強。Lin et al (2006)利用望水白X南大2419重組自交系群體在望水白的4B染色體上檢測到一個抗侵染主效QTL，可解釋15 %左右的表型變異，且在各次實驗中LOD值都在3以上。Xue et al. (2010a)利用近等基因系證實該QTL 的效應(yīng)。Xue et al. (2010b)利用重組自交系群體和近等基因系群體，通過篩選和鑒定重組體的方法將4B QTL精細(xì)定位到相距I. 7cM的Xhbg226-Xgwml49區(qū)間，位于小麥缺失系 4BL5-0. 86-1. 00，并將其命名為Fhb4。且有研究表明該基因為顯性基因。由于小麥赤霉病抗性具有典型的數(shù)量性狀特征，受多基因控制，易受環(huán)境影響，早期世代很難對其進(jìn)行選擇。此外，許多抗赤霉病種質(zhì)的農(nóng)藝性狀較差，地區(qū)適應(yīng)性較強，利用傳統(tǒng)育種方法培育抗性品種費時費力可能也得不到預(yù)期的結(jié)果。分子標(biāo)記輔助選擇育種與傳統(tǒng)育種相比，可以在早期世代確定目標(biāo)基因型，且選擇不受基因表達(dá)及環(huán)境條件的影響，能夠提高選擇的準(zhǔn)確性，從而加快育種進(jìn)程(Collard and Mackill 2008)。雖然目前已有研究利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)選育了 Fhb4的近等基因系，但是所選育的Fhb4近等基因系株高偏高，這在育種中是不利的選擇(Xue et al. 2010a)。因此與其更緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)有利于減少選擇時的連鎖累贅，提高對Fhb4的應(yīng)用效率。此外，F(xiàn)hb4雖然被精細(xì)定位，但是所在區(qū)間的遺傳距離還是很大，有必要開發(fā)更緊密連鎖的分子標(biāo)記加快該基因的克隆研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供與小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4 更加緊密連鎖的分子標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個目的是提供該小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記，用標(biāo)記引物MAG5184-F :SEQ ID NO. I, MAG5184-R SEQ ID NO. 2擴增小麥品種基因組DNA，獲得的擴增片段為241bp，即為小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4連鎖的的分子標(biāo)記MAG5184，該標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，與Fhb4緊密連鎖， 利用Mapmaker Macintosh V 3. O測得該標(biāo)記與Fhb4基因的遺傳距離為O. 72cM ；或用標(biāo)記引物MAG7237-F :SEQ ID NO. 3, MAG7237-R SEQ ID NO. 4 擴增小麥品種 DNA，獲得的擴增片段為688bp，即為小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4連鎖的分子標(biāo)記MAG7237， 該該標(biāo)記在抗赤霉病品種望水白和感赤霉病品種綿陽99-323中用HinfI酶切消化存在多態(tài)，該標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，與Fhb4緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. O測得該標(biāo)記與Fhb4基因的遺傳距離為O. 34cM ；或用標(biāo)記引物MAG2521-F :SEQ ID NO. 5, MAG2521-R SEQ ID NO. 6 擴增小麥品種 DNA，獲得的擴增片段為161bp，即為小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4連鎖的分子標(biāo)記MAG2521， 該標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，與Fhb4緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. O測得該標(biāo)記與Fhb4基因的遺傳距離為O. 92cM。所述的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中抗赤霉病侵染基因Fhb4的鑒定中的應(yīng)用。小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記方法，用上述的任意一對分子標(biāo)記引物 PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG5184的引物MAG5184-F 和MAG5184-R能夠擴增出241bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG7237的引物MAG7237-F 和MAG7237-R擴增出688bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG2521的引物MAG2521-F和 MAG2521-R能夠擴增出161bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥存在抗赤霉病侵染基因Fhb4。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在篩選抗赤霉病小麥中的應(yīng)用。利用上述的分子標(biāo)記篩選抗赤霉病小麥的方法為用上述的任意一對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG5184的引物 MAG5184-F和MAG5184-R能夠擴增出241bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG7237的引物MAG7237-F和MAG7237-R擴增出688bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG2521的引物 MAG2521-F和MAG2521-R能夠擴增出161bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥為存在抗赤霉病侵染基因Fhb4的抗赤霉病小麥。所述的分子標(biāo)記的引物在克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4中的應(yīng)用。上述小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的(一 )望水白Fhb4近等基因系NMAS007與其輪回親本綿陽99_323F2 : 3群體的創(chuàng)建與Fhb4區(qū)段重組體的篩選(1)NMAS007(早)與小麥品種綿陽99_323 (3)進(jìn)行雜交得到雜種F^F1自交產(chǎn)生 F2群體；(2)利用Fhb4的邊界標(biāo)記篩選F2群體中在該區(qū)段發(fā)生重組的雜合單株，利用相同標(biāo)記在其F3代篩選在該區(qū)段發(fā)生重組的純合單株。(二)重組體抗病表型的鑒定(3)重組體開花前十天左右在田間撒播感病麥粒接種，一周后重復(fù)一次。接種15 天后調(diào)查病小穗率評價其抗侵染性；
(三)分子標(biāo)記分析(4)用SDS法提取抗病親本NMAS007、感病親本綿陽99-323及F2群體各單株的 DNA ;用 27 對 SSR 引物(http://wheat.pw.usda. gov/GG2/index, shtml)和來自于望水白 BAC克隆59對分子標(biāo)記弓丨物對NMAS007，綿陽99-323，中國春以及中國春缺失系4BL-5 (Endo and Gilll996)進(jìn)行多態(tài)性分析和特異性分析；(5)選擇在親本間擴增出多態(tài)、且能缺失定位到4BL5-0. 86-1. OObin的分子標(biāo)記在F2代群體單株中擴增獲取群體各單株的基因型資料，并且利用這些標(biāo)記檢測雜合重組體后代F3家系各單株的基因型；其中，PCR反應(yīng)體系為 12. 5 μ 1，其中 IOXbuffer I. 25 μ l,25mM MgCl2 O. 75 μ I,
2.5mMdNTPs I μ 1，左右引物各 0· 2 μ M，Taq 酶(5u/μ I) 0· I μ 1，模板 DNA 10ng，加水至 12. 5μ I ；PCR擴增程序為94°C預(yù)變性3min后，94°C變性30sec，6(TC退火lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600擴增儀上進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8 % 非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果。(四)分子標(biāo)記獲得(6)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，結(jié)合F2代群體各單株基因型資料與雜合重組體F3家系的田間抗病表型，利用軟件Mapmaker Macintosh V3. O構(gòu)建望水白Fhb4的遺傳連鎖圖，獲得了與Fhb4最為緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5184、MAG7237和MAG2521。有益效果本發(fā)明在國際上首次獲得了與Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5184、MAG7237和 MAG2521。可以加速抗病基因Fhb4在小麥抗病育種中的應(yīng)用，關(guān)且還可以用于Fhb4基因的克隆。I、獲得了與Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5184、MAG7237和MAG2521。在已知的分子標(biāo)記中與Fhb4連鎖最為緊密的是MAG7237，遺傳距離僅為O. 34cM,能夠幫助該基因向推廣品種中轉(zhuǎn)移以及與其它抗病基因的聚合。2、鑒定方便。這三個分子標(biāo)記都為共顯性標(biāo)記，具有檢測方便、擴增穩(wěn)定、簡便等優(yōu)點。用標(biāo)記MAG7237檢測Fhb4基因，可以確定Fhb4的存在與否以及存在狀態(tài)，并預(yù)測小麥的赤霉病抗性，進(jìn)而快速篩選攜有Fhb4的植株并用于抗病品種的選育。同時利用分子標(biāo)記進(jìn)行實驗室檢測可以避免環(huán)境對品種的影響。3、提高抗病品種的選擇鑒定效率，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)的抗赤霉病育種過程中，需要將攜帶有抗病基因的親本與栽培品種進(jìn)行一系列雜交，對后代群體單株進(jìn)行抗病性鑒定， 并且需要多年多點的表型鑒定；并且抗病表型鑒定易受環(huán)境的影響，表型鑒定結(jié)果有一定的誤差。因此抗病品種的選育不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測與抗赤霉病侵染基因Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以將表型鑒定的工作大大減少，并且在苗期就可鑒定出攜有抗病基因Fhb4的單株，從而淘汰非目標(biāo)植株。因此，利用通過檢測與抗赤霉病侵染基因 Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG7237，不僅節(jié)約育種成本，而且大大提高抗病品種的選擇效率。4、減少連鎖累贅。由于小麥的赤霉病抗性往往和一些不良的農(nóng)藝性狀有一定的相關(guān)。早期借助分子標(biāo)記選育的攜帶有Fhb4的抗赤霉病株系總表現(xiàn)較高的株高，這可能由于QTL初步定位的區(qū)間比較大，致使選擇導(dǎo)入的區(qū)間比較大，造成了一些連鎖累贅。利用與抗赤霉病侵染基因Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記可以減少選擇時的連鎖累贅，提高選擇效率。5、可用于克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4研究。圖位克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4的前提在于獲得與Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記。MAG5184和MAG7237在所有已知分子標(biāo)記中與 Fhb4連鎖最為緊密。為克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4提供基礎(chǔ)。


圖1459個純合重組體病小穗率的分布圖。圖2MAG5184、MAG7237和MAG2521與小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的遺傳連鎖圖， 右邊為遺傳連鎖圖的標(biāo)記，左側(cè)數(shù)據(jù)為標(biāo)記間的遺傳距離。圖3MAG5184擴增帶型。M為PUC19/MspI，左側(cè)是分子量標(biāo)記條帶大小(bp)。I為綿陽 99-323，2為_^007，3、5、8、10、11、16、18、19為感病基因型單株，6、7、22、23、24、26為抗病基因型單株，4、9、12、13、14、15、17、20、21、25為雜合基因型單株。箭頭所指為特異擴增條帶。圖4MAG7237擴增帶型。M為D2000，左側(cè)是分子量標(biāo)記條帶大小(bp)。I為 NMAS007，2 為綿陽 99-323，3、6、8、9、11、12、16為感病基因型單株，5、17、18、19、20、22、23為抗病基因型單株，4、7、10、13、14、15、21、24、25、26為雜合基因型單株。箭頭所指為特異擴增條帶。圖5MAG2521擴增帶型。M為PUC19/MspI，左側(cè)是分子量標(biāo)記條帶大小(bp)。I為 NMAS007，2為綿陽99-323，2、3、4、5、10、11、14為感病基因型單株，其余為雜合基因型單株。 箭頭所指為特異擴增條帶。
具體實施例方式實施例I小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的(一 )望水白Fhb4近等基因系NMAS007與其輪回親本綿陽99_323F2 : 3群體的創(chuàng)建與Fhb4區(qū)段重組體的篩選(1)NMAS007(早)與小麥品種綿陽99-323 (3)進(jìn)行雜交得到雜種F1, F1自交產(chǎn)生包含有4303個單株的F2群體；(2)利用 Fhb4 的邊界標(biāo)記 Xhbg226 和 Xgwml49 (Torada et al. 2006 ； Roder et al. 1998)在&群體中篩到187個在該區(qū)段發(fā)生重組的雜合單株，利用相同標(biāo)記在其F3代篩選得到459個在該區(qū)段發(fā)生重組的純合單株。(二)重組體抗病表型的鑒定重組體開花前十天左右在田間撒播感病麥粒對這些純合重組體接種，一周后重復(fù)一次。接種15天后調(diào)查病小穗率。鑒定結(jié)果表明這些重組體抗性分離明顯(圖1)，攜帶有Fhb4基因的株系與感病親本相比，抗性有顯著提高(表I)。(三)多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選及重組體基因型分析(I)首先利用其他圖譜中位于Fhb4區(qū)段的27個SSR標(biāo)記(http: //wheat, pw. usda. gov/GG2/index, shtml)和望水白BAC克隆序列開發(fā)的59個分子標(biāo)記對Fhb4近等基因系和綿陽99-323進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終得到2個在親本間有多態(tài)的SSR標(biāo)記和I個在親本間有多態(tài)的STS標(biāo)記，即MAG5184、MAG2521和MAG7237這三個分子標(biāo)記。PCR 反應(yīng)體系為 12. 5 μ 1，其中 IOXbuffer I. 25 μ 1, 25mM MgCl2O. 75 μ 1, 2. 5mM dNTPs 1μ 1，左右引物各 O. 2 μ Μ，Taq 酶(5u/y 1)0. I μ 1，模板 DNA 10ng，加水至 12. 5μ I ；PCR擴增程序為94°C預(yù)變性3min后，94°C變性30sec，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600擴增儀上進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8 % 非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果。(3)利用在親本間有多態(tài)的分子標(biāo)記MAG5184、MAG7237和MAG2521分析所有純合重組體,這些重組體可以分成4種重組類型(表I)。(四)分子標(biāo)記的獲得根據(jù)連鎖交換規(guī)律，結(jié)合F2代群體各單株基因型資料與雜合重組體F3家系的田間抗病表型(表I)，利用軟件Mapmaker Macintosh V3. O構(gòu)建了望水白Fhb4的遺傳連鎖圖(圖2)，獲得了與Fhb4緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5184、MAG7237和MAG2521，它們分別距 Fhb4 基因 O. 72cM、0. 34cM、0. 92cM。MAG5184、MAG7237 和 MAG2521 分子標(biāo)記引物擴增帶型見圖3、圖4和圖5。表1NMAS007綿陽99_323F2 : 3群體中純合重組體的基因型和表型
權(quán)利要求
1.小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記,其特征在于用標(biāo)記引物MAG5184-F :SEQ ID NO. I, MAG5184-R SEQ ID NO. 2擴增小麥品種基因組DNA，獲得的擴增片段為241bp，即為小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4連鎖的的分子標(biāo)記 MAG5184，該標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，與Fhb4緊密連鎖，利用Mapmaker Macintosh V 3. O測得該標(biāo)記與Fhb4基因的遺傳距離為O. 72cM ；或用標(biāo)記引物 MAG7237-F :SEQ ID NO. 3, MAG7237-R SEQ ID NO. 4 擴增小麥品種 DNA， 獲得的擴增片段為688bp，即為小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4連鎖的分子標(biāo)記MAG7237，該標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，與Fhb4緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. O測得該標(biāo)記與 Fhb4基因的遺傳距離為O. 34cM ；或用標(biāo)記引物 MAG2521-F :SEQ ID NO. 5, MAG2521-R SEQ ID NO. 6 擴增小麥品種 DNA， 獲得的擴增片段為161bp，即為小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4連鎖的分子標(biāo)記MAG2521，該標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，與Fhb4緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. O測得該標(biāo)記與 Fhb4基因的遺傳距離為O. 92cM。
2.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中抗赤霉病侵染基因Fhb4的鑒定中的應(yīng)用。
3.小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記方法，其特征在于用權(quán)利要求I所述的任意一對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記 MAG5184的引物MAG5184-F和MAG5184-R能夠擴增出241bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG7237的引物MAG7237-F和MAG7237-R擴增出688bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記 MAG2521的引物MAG2521-F和MAG2521-R能夠擴增出161bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥存在抗赤霉病侵染基因Fhb4。
4.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在篩選抗赤霉病小麥中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在篩選抗赤霉病小麥的方法為用權(quán)利要求I所述的任意一對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG5184的引物MAG5184-F和MAG5184-R能夠擴增出241bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG7237的引物MAG7237-F和MAG7237-R擴增出 688bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG2521的引物MAG2521-F和MAG2521-R能夠擴增出 161bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥為存在抗赤霉病侵染基因Fhb4的抗赤霉病小麥。
6.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記的引物在克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于作物育種學(xué)領(lǐng)域，公開了小麥抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記選自MAG5184、MAG7237或MAG2521中的任意一種，與Fhb4基因的遺傳距離分別為0.72cM、0.34cM、0.92cM。本發(fā)明在國際上首次獲得了與Fhb4最為緊密連鎖的分子標(biāo)記。這三個分子標(biāo)記都為共顯性標(biāo)記，具有檢測方便、擴增穩(wěn)定、簡便等優(yōu)點。用標(biāo)記MAG7237檢測Fhb4基因，可以確定Fhb4的存在與否以及存在狀態(tài)，并預(yù)測小麥的赤霉病抗性，進(jìn)而快速篩選攜有Fhb4的植株并用于抗病品種的選育。
文檔編號C12Q1/68GK102604943SQ20121008293
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者李國強, 薛樹林, 馬正強 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)