專利名稱：一個植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白OsVps9a 及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一個植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白0sVps9a及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高等植物在生殖時期向種子中積累大量的儲藏性物質(zhì)，植物種子因而成為了人類主要的食物來源。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，全球超過50% 人口以稻米為主要口糧。稻米中含有大量的儲藏蛋白，它是稻米中僅次于淀粉的第二大物質(zhì)。因此，深入研究儲藏蛋白，對于改良稻米的食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)都具有重要意義。水稻種子中的儲藏蛋白約占籽粒干重的8-10%，其中谷蛋白占60-80%，醇溶蛋白占18-20 %。其中谷蛋白可以被人體吸收，醇溶蛋白因儲存在致密的蛋白包涵體中而不能被消化。谷蛋白在稻米胚乳的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，需經(jīng)過一系列復(fù)雜調(diào)控的囊泡運輸過程，最終運送并沉積到蛋白質(zhì)儲藏型液泡中，形成二型蛋白體。谷蛋白運輸過程中如出現(xiàn)錯誤，谷蛋白就無法被位于蛋白質(zhì)儲藏型液泡中的液泡加工酶酶切為成熟的谷蛋白，因此，谷蛋白運輸相關(guān)基因的缺失會導(dǎo)致谷蛋白前體的大量積累以及二型蛋白體體積的縮小，進而影響稻米中可被吸收的成熟谷蛋白的積累和分布。Rab蛋白家族在真核生物中對囊泡運輸起著重要的調(diào)節(jié)作用。擬南芥中的 Rab5GTPase定位于前液泡膜上，調(diào)控了從高爾基體到液泡的囊泡運輸過程。為了正確地實現(xiàn)其多樣的功能，必須對Rab GTPases進行嚴格的時空調(diào)控。Rab蛋白被鳥核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)所激活，所有的 Rab5 的 GEF 均具有一個高度保守的VPS9催化結(jié)構(gòu)域。在擬南芥中，AtVPS9a能夠激活結(jié)構(gòu)上差異較大的兩種類型的Rab5蛋白，在植物的生長發(fā)育中具有重要的功能。但水稻中，含有VPS9結(jié)構(gòu)域的蛋白的功能還沒有被研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白(0sVps9a),來源于稻屬水稻(Oryza sativa var.日本晴)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ ID NO. I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)的由SEQ ID NO. I衍生的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO. I由480個氨基酸殘基組成，自氨基末端第144至264位為VPS9結(jié)構(gòu)域。為了使(a)中的0sVPS9a便于純化，可在由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。
表I標簽的序列
標簽殘基序列Poly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDK上述(b)中的0sVps9a可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的0sVps9a的編碼基因可通過將SEQ ID NO. 2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標簽的編碼序列得到。編碼上述植物谷蛋白運輸儲藏相關(guān)蛋白的基因0sVps9a也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子I) SEQ ID NO. 2 所示的 DNA 分子；2) SEQ ID NO. 3 所示的 DNA 分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲減相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴格條件可為在O. I X SSPE (或O. I X SSC), O. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。SEQ ID NO. 2由1443個核苷酸組成，為基因0sVps9a的CDS。含有以上任一所述基因的重組表達載體?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與 mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子 (Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 綠色熒光蛋白基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等) 或是抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除草劑基因)等。所述重組表達載體優(yōu)選為在pCAMBIA1305載體的酶切位點SmaI之間插入所述基因0sVps9a得到的重組質(zhì)粒，命名為pCAMBIA1305-0sVps9a。
含有以上任一所述基因(0sVps9a)的表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系及重組菌。擴增所述基因(0sVps9a)全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。一種培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法。本發(fā)明提供的培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法，是將所述基因?qū)氤墒旃鹊鞍缀拷档偷闹参镏?，得到成熟谷蛋白含量正常的轉(zhuǎn)基因植物；所述谷蛋白含量降低植物為籽粒中成熟谷蛋白含量顯著低于正常型的植物；所述谷蛋白含量正常的轉(zhuǎn)基因植物為籽粒中成熟谷蛋白的含量與正常型相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因植物。具體來說，所述基因通過所述重組表達載體導(dǎo)入成熟谷蛋白含量降低的植物中；所述成熟谷蛋白含量降低的植物可為 T5390。所述蛋白、所述基因、所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌或所述方法均可應(yīng)用于水稻育種。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛毎色@轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti 質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、 楊樹、草坪草、苜宿等。有益效果本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)、定位并克隆得到一個新的植物谷蛋白運輸儲藏相關(guān)蛋白的基因 0sVps9a。本發(fā)明的植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白影響植物的囊泡運輸過程。抑制該蛋白編碼基因的表達可導(dǎo)致植物種子中谷蛋白的囊泡運輸過程的障礙，并影響其剪切成熟，從而可以培育囊泡運輸變異的轉(zhuǎn)基因植物和植物成熟谷蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因植物。將所述蛋白的編碼基因?qū)氤墒旃鹊鞍缀拷档偷闹参镏?，可以培育成熟谷蛋白含量正常的植物。所述蛋白及其編碼基因可以應(yīng)用于植物遺傳改良。


圖I為野生型日本晴和突變體T5390蛋白質(zhì)電泳圖比較。圖2為野生型日本晴和突變體T5390的成熟種子外觀比較。A顯示日本晴具有半透明的胚乳，B顯示T5390胚乳是不透明的。圖3為野生型日本晴和突變體T5390的發(fā)育中胚乳細胞中超細微結(jié)構(gòu)的比較。圖4為野生型日本晴和突變體T5390的發(fā)育中胚乳細胞中谷蛋白分布的比較(免疫膠體金)。圖5為野生型日本晴和突變體T5390的發(fā)育中胚乳細胞中谷蛋白分布的比較(免疫熒光)。圖6為野生型日本晴和突變體T5390的蛋白質(zhì)儲藏液泡大小比較(免疫熒光)。圖7為精細定位示意圖。圖8為0sVps9a基因示意圖，顯示T5390中突變形式。圖9為轉(zhuǎn)基因植株進行PCR分子檢測結(jié)果。泳道I為T5390的突變體，泳道2為日本晴，泳道3_5為轉(zhuǎn)化獲得的3株轉(zhuǎn)CN 102603878 A
pCAMBIA1305-0sVps9a 植株。圖10為轉(zhuǎn)pCAMBIA1305-0sVps9a的植株發(fā)育中種子的超細微結(jié)構(gòu)觀察。圖11為轉(zhuǎn)pCAMBIA1305_0sVps9a的植株的成熟種子外觀。圖12為轉(zhuǎn)pCAMBIA1305_0sVps9a的植株的蛋白質(zhì)電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例I、植物種子谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)一、水稻成熟谷蛋白降低突變體T5390的成熟谷蛋白含量分布分析及遺傳分析在粳稻品種日本晴突變體庫中(來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，利用蛋白質(zhì)電泳分析，篩選得到了一個種子中成熟谷蛋白含量降低的株系，同時其谷蛋白前體相比正常型顯著的增加，命名為T5390。與日本晴比較，T5390的主要特征是種子中成熟谷蛋白含量下降(見圖I)，伴隨谷蛋白前體大量積累，同時具有種子不透明的表型，見圖2。A圖顯示日本晴具有半透明的胚乳，B圖顯示T5390胚乳是不透明的。對發(fā)育中胚乳進行的透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)T5390中儲存成熟谷蛋白的二型蛋白體相對日本晴(圖3A)的大小顯著的變小，并且二型蛋白體的外形也發(fā)生了變化，具有高度不規(guī)則的外形(圖3B)。同時，T5390的胚乳細胞中還出現(xiàn)了很多來源未知的聚集體(圖3C)。 利用免疫膠體金對谷蛋白進行標記，結(jié)果顯示，T5390中的谷蛋白除了分布在變小的二型蛋白體中(圖4B)，還存在于細胞壁附近和新出現(xiàn)的大的聚集體中(圖4C)。利用免疫熒光技術(shù)，同樣觀察到T5390(圖5B)中的二型蛋白體的顯著的變小(平均面積只有日本晴〈圖 5Α>的53.4% )，谷蛋白除了存在于二型蛋白體中還沿著細胞壁分布，聚集體中也分布了大量的谷蛋白(圖5Β)。水稻胚乳細胞中，谷蛋白須被最終運送到蛋白質(zhì)儲藏型液泡中形成二型蛋白體。我們利用a-TIP蛋白的抗體標記了水稻蛋白質(zhì)儲藏型液泡，發(fā)現(xiàn)Τ5390(圖 6Β)中的蛋白質(zhì)儲藏液泡的大小亦顯著的小于日本晴(圖6Α)。所以，微觀觀察數(shù)據(jù)表明在Τ5390突變體胚乳細胞中谷蛋白的存儲形式發(fā)生了大幅度的改變，部分谷蛋白沒有被正確的運送到蛋白質(zhì)儲藏型液泡中。谷蛋白的剪切成熟須在蛋白質(zhì)儲藏型液泡/二型蛋白體中完成，因此，推斷Τ5390中因為囊泡運輸過程的障礙，谷蛋白不能全部成功運輸?shù)蕉偷鞍左w中，而以前體形式存在于細胞壁附近和聚集體中，因此，成熟的谷蛋白的含量大幅的下降。二、突變基因定位I、突變基因初步定位用日本晴的花粉給Τ5390進行了人工輔助授粉，所得種子中成熟谷蛋白含量正常，用Τ5390的花粉給日本晴進行人工輔助授粉，所得種子中成熟谷蛋白含量也表現(xiàn)正常。 所得Fl自交后，后代中正常型和突變型的種子符合3 I的分離比例，因此，Τ5390中成熟谷蛋白降低的表型是由單個隱性核基因控制的。用突變體Τ5390與秈稻品種9311 (來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所種質(zhì)資源庫)雜交，在T5390/9311的F2種子中利用蛋白質(zhì)電泳分析挑選出10個具有成熟谷蛋白含量下降的單株，提取各株的葉片中的基因組DNA，利用覆蓋水稻全基因組的565對SSR引物對10單株進行連鎖分析，將谷蛋白運輸儲藏蛋白相關(guān)基因gpa2 (glutelin precursor accumulation
2)定位在第4染色體上標記RM3467和RM RM14764之間。上述SSR標記分析的方法如下所述(I)提取上述選取單株的總DNA作為模板，具體方法如下①取O. 2克左右的水稻幼嫩葉片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的Eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GEN0/GRINDER儀器上粉碎樣品 Imin0②加入660 μ I 提取液(含 IOOmM Tris-Hcl (PH 8. O)，20mM EDTA (PH 8. O)，I. 4M NaCl，O. 2g/ml CTAB的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。③加入40 μ I 20% SDS，65°C溫浴lOmin，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。④加入100 μ I 5Μ NaCl，溫和混勻。⑤加入100 μ I 10XCTAB，65°C溫浴lOmin，間斷輕輕上下顛倒混勻。⑥加入900 μ I氯仿,充分混勻，12000rpm離心3min。⑦轉(zhuǎn)移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600 μ I異丙醇，混勻，12000rpm離心 5min。⑧棄上清液，沉淀用70% (體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。⑨加入ΙΟΟμΙ 1ΧΤΕ(121克Tris溶于I升水中，用鹽酸調(diào)PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。 ⑩取2 μ I電泳檢測DNA質(zhì)量，并用DU800分光光度儀測定濃度(Bechman Instrument Inc. U. S. A)。(2)將上述提取的DNA稀釋成約20ng/ μ I，作為模板進行PCR擴增；PCR 反應(yīng)體系(10 μ I) DNA(20ng/ul) Iul，上游引物(2pmol/ul) Iul，下游引物(2pmol/ul) lul，IOxBuffer (MgCl2free) lul，dNTP (IOmM) 0. 2ul, MgCl2 (25mM) 0. 6ul， rTaq(5u/ul)0. lul, ddH20 5. lul,共 IOul PCR 反應(yīng)程序94. (TC變性 5min ；94. (TC變性 30s、55°C退火 30s、72°C延伸 lmin, 共循環(huán)35次；72°C延伸7min ;10°C保存。PCR反應(yīng)在MJ Research PTC-225熱循環(huán)儀中進行。(3) SSR標記的PCR產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。以50bp的DNA Ladder為對照比較擴增產(chǎn)物的分子量大小，銀染顯色。2、突變基因精細定位根據(jù)初步定位的結(jié)果，在突變基因所在區(qū)域附近尋找公共圖譜上的分子標記，并自行開發(fā)SSR標記。用F2群體中的成熟谷蛋白含量下降的單株驗證，在該染色體的相關(guān)區(qū)段篩選更多標記進一步定位突變體基因。從T5390/9311衍生的F2分離群體中挑出確認為成熟谷蛋白含量下降的單株650株(用于突變基因精細定位。利用公共圖譜上的分子標記和基于水稻基因組序列數(shù)據(jù)自行開發(fā)的SSR分子標記對突變基因進行了精細定位，并根據(jù)定位結(jié)果初步確定突變基因，具體方法如下
SSR標記開發(fā)將公共圖譜的SSR標記與水稻基因組序列進行整合，下載突變位點附近的BAC/ PAC克隆序列。用SSRHunter (李強等，遺傳，2005，27 (5) =808-810)或SSRIT軟件搜索克隆中潛在的SSR序列(重復(fù)次數(shù)彡6);將這些SSR及其鄰近400 500bp的序列在NCBI通過BLAST程序在線與相應(yīng)的秈稻序列進行比較，如果兩者的SSR重復(fù)次數(shù)有差異，初步推斷該SSR引物的PCR產(chǎn)物在秈、粳間存在多態(tài)性；再利用Primer Premier 5. O軟件設(shè)計SSR 引物，并由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。將自行設(shè)計的SSR成對弓I物等比例混合，檢測其在T5390和9311之間的多態(tài)性，表現(xiàn)多態(tài)者用作精細定位gpa2基因的分子標記。用于精細定位的分子標記見表2。表2用于精細定位的分子標記
權(quán)利要求
1.一種谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白0sVps9a,是如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)(a)由SEQID NO. I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQID NO. I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)的由SEQ ID NO. I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因0sVps9a。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因0sVps9a，其特征在于所述基因是如下I)或2)或3) 或4)所述的DNA分子1)SEQ ID NO. 2所示的DNA分子；2)SEQ ID NO. 3所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白0sVps9a的DNA分子;4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲減相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是在 PCAMBIA1305載體的酶切位點SmaI之間插入權(quán)利要求2或3所述基因得到的重組質(zhì)粒。
6.擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求I所述蛋白，權(quán)利要求2或3所述基因，權(quán)利要求4所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌中的至少一種在植物育種中的應(yīng)用。
8.一種培育成熟谷蛋白含量正常轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)氤墒旃鹊鞍缀拷档偷闹参镏?，得到成熟谷蛋白含量正常轉(zhuǎn)基因植物；所述成熟谷蛋白含量降低的植物是種子中成熟谷蛋白含量降低，并伴隨谷蛋白前體增加的植物；所述成熟谷蛋白含量正常的轉(zhuǎn)基因植物為成熟谷蛋白和谷蛋白前體含量均正常的轉(zhuǎn)基因植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求4或 5所述重組表達載體導(dǎo)入成熟谷蛋白含量降低的植物中。
10.一種培育成熟谷蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是抑制目的植物中權(quán)利要求 2或3所述基因的表達，得到成熟谷蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的植物為攜帶權(quán)利要求2或3所述基因的植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白OsVps9a及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ ID NO.1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白質(zhì)。將所述蛋白的編碼基因?qū)氤墒旃鹊鞍缀拷档偷闹参镏?，可以培育成熟谷蛋白含量正常的植物。所述蛋白及其編碼基因可以應(yīng)用于植物遺傳改良。
文檔編號C12N1/19GK102603878SQ201210082939
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者萬建民, 任玉龍, 劉峰, 江玲, 王益華, 鮑依群 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)