專利名稱：一種鑒別螺旋藻品系是否適用于工廠化培植的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于螺旋藻開發(fā)應用的技木，特別涉及一種鑒別螺旋藻品系是否適用于エ 廠化培植的方法。
背景技術：
螺旋藻(Spirulina)，是ー種光合放氧、呈規(guī)則螺旋的原核絲狀微藻，系藍藻門 (Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學研究，1997，15(4) =369-374]。因富含優(yōu)質蛋白和多種生物活性物質而受到國內(nèi)外的極大關注，并已在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，成為目前全球研究開發(fā)規(guī)模最大，應用前景最廣泛的經(jīng)濟微藻。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產(chǎn)實踐表明，螺旋藻不同品種(系)，對溫度、光質、光照強度，以及培養(yǎng)液的鹽度、PH和營養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要求與適應性存在顯著差異，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟效益也相差甚遠[水生生物學報， 1999,23(1) 59-64] 0所以，與其它農(nóng)業(yè)與生物技術產(chǎn)業(yè)一祥，選育品性兼優(yōu)的品種(系) 是有效提升當前螺旋藻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益、切實解決生產(chǎn)實際問題，最直接而重要的途徑之一。目前國內(nèi)外篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)螺旋藻品種(系)的一般常規(guī)方法如下1、對新分離到的品種(系)進行編號；2、在實驗室條件下作多種環(huán)境因子的交叉組合培養(yǎng)試驗，并根據(jù)所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標作初歩篩選；3、對實驗室初篩到有生產(chǎn)養(yǎng)殖潛力的候選品種(系)在不同季節(jié)、氣候及營養(yǎng)條件下進行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗，再篩選出目標品種(系)。這ー方法雖然實用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。因此，迫切需要建立簡單、快速、有效的評價與篩選方法，以滿足當前國內(nèi)外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的實際需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種簡單、快速、低成本有效的篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質螺旋藻品系的新方法。為解決技術問題，本發(fā)明的解決方案是提供一種鑒別螺旋藻品系是否適用于エ廠化培植的方法，是將候選品系的基因組 DNA經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增，并在電泳分析后采用NTSYSpc2. I軟件構建藻株間的聚類圖； 若候選品系具有1750bp、1100bp、820bp、570bp、420bp和360bp的特異DNA電泳條帶，且能與己知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則候選品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若候選品系具有1600bp、1150bp、1070bp、920bp和690bp的特異DNA電泳條帶，且與己知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；所述特定引物HIPS-GC 的序列為 5’ -GCGATCGCGC-3，(SEQ ID NO 1)；所述生產(chǎn)性狀好的品系是:ZJU0103、ZJUO104,ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJU0116 ;所述生產(chǎn)性狀差的品系是ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、 ZJUOl10、ZJUOl13 和 ZJUOl14。
該方法具體包括下述步驟(I)選用14種螺旋藻品系作為對比樣本，即ZJU0101、ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、 ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13、ZJUOl14、ZJUOl15 和 ZJUO116 ；(2)試劑和儀器TaqDNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、 RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純；序列擴增用美國Hybaid公司的 Thermal Cycler PCR 儀;(3) PCR 擴增將候選品系及14種對比樣本的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增；在25 ii L PCR反應體系中，含10倍的PCR緩沖液2. 5 y L，4種dNTP各I u mol/L, 特定引物 HIP-GC :5，-GCGATCGCGC-3，0. 5 u mol/L, I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因組 DNA, PCR 反應程序為 94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s, 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin ；(4)電泳分析和觀察將擴增產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓8. 5V/cm ;電泳結束后用銀染方法染色，再在VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad (USA)觀察并照相，經(jīng)過觀察比對候選品系用特定引物HIPS-GC擴增出條帶的分子量；(5)聚類圖的構建對上述候選品系及14種對比樣本的電泳結果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權平均法(UPGMA)進行分析和構建藻株間的聚類圖，并根據(jù)聚類情況進行判斷。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所建立的篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質螺旋藻品系的方法與常規(guī)方法相比， 不僅簡單、快速、有效，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。


圖I為14株螺旋藻品系中擴增條帶的電泳圖；其中M :標準分子量；CK :陰性對照；I 14 :分別對應 ZJUO10U ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108、ZJUO109/RH、ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115 和 ZJUO116。圖2為14株用于構建生產(chǎn)性狀鑒別標準的螺旋藻品系的聚類圖。圖3為被鑒別藻株ZJUOl 17和ZJUOl 18的電泳圖；其中M :標準分子量；CK :陰性對照；1 ZJU0117 ；2 ZJU0118o圖4為被鑒別藻株ZJU0117與ZJU0118在所建鑒別標準中的歸類圖。
具體實施例方式發(fā)明人在長期的螺旋藻分子遺傳學研究中發(fā)現(xiàn)，螺旋藻與魚腥藻和項圈藻等其它藍藻一樣，在基因組中都有一段因品種(系)而不盡相同的特殊的高度回文序列 (highlyiterated palindromic sequence, HIPS)[Microbiology, 1998,144 :2791-2801]。 本發(fā)明建立了一種以HIPS中特定序列HIPS-GC :5’ -GCGATCGCGC-3’為引物并結合PCR(聚合酶鏈反應)技術判別螺旋藻品系能否應用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)的新方法。我們以HIPS中特定序列HIPS-GC(5’ -GCGATCGCGC-3’ )為引物，對14株螺旋藻 ZJUO10 U ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJU0109/RH、 ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115和ZJUO116進行DNA多態(tài)性擴增，并經(jīng)電泳與聚類分析發(fā)現(xiàn)，14 株品系可分為兩大類ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJU0107、ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 為第 I 類；ZJUO101, ZJUO102, ZJUO106, ZJUO109/RH, ZJUO110, ZJUO113 和 ZJUO114 為第II類。同時，從它們的電泳圖譜上也可見這兩類品系間DNA帶的特異性，S卩1750bp、 1100bp、820bp、570bp、420bp和360bp的DNA帶為上述第I類品系所特有，而1600bp、 1150bp、1070bp、920bp和690bp的DNA條為第II類品系所特有。長期的科學研究與生產(chǎn)實踐表明，上述第I類中的7株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的7株品系因適應能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見，HIPS-GC對螺旋藻基因組DNA的特異性擴增條帶與螺旋藻的生產(chǎn)性狀間所存的上述顯著相關性，可作為鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的分子標記，即候選品系經(jīng)引物HIPS-GC擴增的產(chǎn)物中，具1750bp、1100bp、820bp、 570bp、420bp和360bp的特異DNA電泳條帶，能與聚上述第I類品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；而具1600bp、1150bp、1070bp、920bp和690bp的特異DNA電泳條帶，與上述第II類品系聚在一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明的詳細技術方案可以通過以下步驟實施I、選用材料為公知的14株螺旋藻品系ZJU0101、ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13、ZJUOl 14、ZJUOl 15 和ZJU0116，在浙江大學原子核農(nóng)業(yè)科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存。其中，ZJUO103, ZJUO104, ZJU0105、ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 生產(chǎn)性狀好，被廣泛應用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)；而 ZJU0101、ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13 和ZJUO114因生產(chǎn)性狀差而不適用于工廠化生產(chǎn)。2、試劑和儀器Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純。序列擴增用美國 Hybaid 公司的 Thermal Cycler PCR 儀。3、PCR 擴增將候選品系及14種對比樣本的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增；25 U L PCR反應體系中，含10倍的PCR緩沖液2. 5 ii L，4種dNTP各I ii mol/L,特定引物 HIPS-GC :5’ -GCGATCGCGC-3，0. 5 u mol/L, I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因組 DNA, PCR 反應程序為 94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s，30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0所述4 種 dNTP 是指 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP。4、電泳分析和觀察將擴增產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓8. 5V/cm。電泳結束后用銀染方法染色，再在VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad (USA)觀察并照相，經(jīng)過觀察比對被篩選的螺旋藻品系用引物HIPS-GC擴增出條帶的分子量。5、聚類圖的構建
對候選品系及上述ZJU0101、ZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106, Z JUO10 7、Z JUO108、Z JUO109/RH、Z JUO110、Z JUO113、Z JUO114、Z JUO115 和 Z JUO116 的電泳結果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權平均法(UPGMA)進行分析，并構建藻株間的聚類圖。6、結果與分析 HIPS-GC擴增特異性條帶電泳分析ZJUO10U ZJU0102、ZJU0103、ZJU0104、ZJUO105, ZJUO106, ZJUO107, ZJUO108, ZJUO109/RH、ZJUO110、ZJUO113、ZJUO114、ZJUO115 和 ZJUO116 的基因組 DNA 分別經(jīng)特定弓 I 物 HIPS-GC 擴增，結果如圖 I 所示。1750bp、1100bp、820bp、570bp、420bp 和 360bp 的 DNA 帶僅出現(xiàn)在 ZJUO103, ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJUO116 品系中， 而 1600bp、1150bp、1070bp、920bp 和 690bp 的 DNA 帶僅出現(xiàn)在 ZJUO101、ZJUO102、ZJUO106、 ZJUO109/RH, Z JUO110, ZJUO113和ZJU0114品系中，表現(xiàn)出顯著的特異性。進一步將電泳結果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權平均法(UPGMA)進行分析，并構建藻株間的聚類圖，結果如圖2所示。14株品系正好被聚為兩大類ZJU0103、ZJU0104、ZJU0105、ZJU0107、ZJU0108、 ZJUOl 15 和 ZJUO116 為第 I 類，ZJUO101, ZJUO102, ZJUO106, ZJUO109/RH, ZJUO110, ZJUO113 和ZJU0114聚為第II類，這與上述擴增DNA特異性差異條帶的結果相吻合。長期的科學研究與生產(chǎn)實踐表明，上述第I類中的7株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的7株品系因適應能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見， HIPS-GC對螺旋藻基因組DNA的特異性擴增條帶與螺旋藻的生產(chǎn)性狀間所存的上述顯著相關性，可作為鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的分子標記，即候選品系經(jīng)引物HIPS-GC擴增的產(chǎn)物中，具1750bp、1100bp、820bp、570bp、420bp和360bp的特異DNA電泳條帶，能與聚上述第I類品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；而具1600bp、1150bp、 1070bp、920bp和690bp的特異DNA電泳條帶，與上述第II類品系聚在一起，則生產(chǎn)性狀差， 不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。作為實例，我們選取了 ZJUO117和ZJUO118這2株品系來驗證本發(fā)明的實用性，其中，ZJU0117品系的生產(chǎn)性狀好，被廣泛應用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)，而ZJU0118因生產(chǎn)性狀差而不適用于工廠化生產(chǎn)。ZJUOl 17和ZJUOl 18基因組DNA分別經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增，如圖 3 所示，ZJU0117 品系具 1750bp、1100bp、820bp、570bp、420bp 和 360bp 的特異性 DNA 帶， 而 ZJUO118 品系具 1600bp、1150bp、1070bp、920bp 和 690bp 的特異性 DNA 帶。同時，利用 NTSYSpc2. I軟件等分析表明，ZJUOl 17與生產(chǎn)性狀好的第I類ZJU0103、ZJU0104、ZJU0105、 ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15和ZJU0116聚在一起；而ZJU0118與生產(chǎn)性狀差的第II類 ZJUO10U ZJUO102, ZJUO106, ZJU0109/RH、ZJUOl 10、ZJUOl 13 和 ZJUO114 聚在一起(圖 4)。 該例子進一步說明，引物HIPS-GC擴增的特異性DNA帶，可作為一種分子標記來篩選適用于大規(guī)模生產(chǎn)的螺旋藻品系。
權利要求
1.一種鑒別螺旋藻品系是否適用于エ廠化培植的方法，其特征在于，是將候選品系的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增，并在電泳分析后采用NTSYSpc2. I軟件構建藻株間的聚類圖；若候選品系具有1750bp、1100bp、820bp、570bp、420bp和360bp的特異DNA電泳條帶，且能與己知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則候選品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若候選品系具有1600bp、1150bp、1070bp、920bp和690bp的特異DNA電泳條帶，且與已知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；所述特定引物HIPS-GC的序列為5’ -GCGATCGCGC-3’ ；所述生產(chǎn)性狀好的品系是:ZJU0103、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107, ZJUO108, ZJUOl 15 和 ZJU0116 ;所述生產(chǎn)性狀差的品系是ZJU0101、ZJU0102、ZJU0106、ZJU0109/RH、ZJUOl 10、 ZJUOl13 和 ZJUOl14。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，具體包括下述步驟(1)選用14種螺旋藻品系作為對比樣本，即ZJUO10UZJUO102, ZJUO103, ZJUO104, ZJU0105、ZJU0106、ZJU0107、ZJU0108、ZJU0109/RH、ZJUOl10、ZJUOl13、ZJUOl14、ZJUOl15 和 ZJUO116 ；(2)試劑和儀器TaqDNA聚合酶和瓊脂糖為上海生エ生物工程公司產(chǎn)品；dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、 RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純；序列擴增用美國Hybaid公司的 Thermal Cycler PCR 儀；(3)PCR擴增將候選品系及14種對比樣本的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增；在25 ii L PCR反應體系中，含10倍的PCR緩沖液2. 5 ii L，4種dNTP各I y mol/L,特定引物 HIP-GC :5，-GCGATCGCGC-3，0. 5 u mol/L, I. 25U 的 Taq DNA 聚合酶，IOOng 基因組 DNA, PCR 反應程序為 94°C 5min ；94°C 30s, 30°C 50s, 72°C 45s, 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin ；(4)電泳分析和觀察將擴增產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓8. 5V/cm ;電泳結束后用銀染方法染色，再在凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad觀察并照相，經(jīng)過觀察比對候選品系用特定引物 HIPS-GC擴增出條帶的分子量；(5)聚類圖的構建對上述候選品系及14種對比樣本的電泳結果采用NTSYSpc2. I軟件以非加權平均法進行分析和構建藻株間的聚類圖，井根據(jù)聚類情況進行判斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及螺旋藻開發(fā)應用技術，旨在提供一種鑒別螺旋藻品系是否適用于工廠化培植的方法。該方法是將候選品系的基因組DNA經(jīng)特定引物HIPS-GC擴增，并在電泳分析后采用NTSYSpc2.1軟件構建藻株間的聚類圖；若候選品系具有1750bp、1100bp、820bp、570bp、420bp和360bp的特異DNA電泳條帶，且能與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則候選品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若候選品系具有1600bp、1150bp、1070bp、920bp和690bp的特異DNA電泳條帶，且與已知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起，則生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明所建立的篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質螺旋藻品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單、快速、有效，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。
文檔編號C12Q1/04GK102605079SQ20121008425
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權日2012年3月27日
發(fā)明者于金鑫, 劉新穎, 汪志平, 王景梅, 藍瑾瑾, 邵斌, 陳子元 申請人:浙江大學