專利名稱：一粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)侨蜃钪饕募Z食作物，在中國(guó)也是僅次水稻的第二大糧食作物。目前，世 界小麥毎年的產(chǎn)量約為6. 2億噸，提供了人類所需的1/5能量，小麥的生產(chǎn)關(guān)乎著人類生存。普通小麥?zhǔn)签`個(gè)異源六倍體物種，含有A、B、D三個(gè)不同的染色體組，與小麥基因組具有同源或部分同源的野生種及原始種中蘊(yùn)含了豐富的基因資源。利用小麥種質(zhì)資源中優(yōu)異的等位變異是實(shí)現(xiàn)小麥穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)的關(guān)鍵因素。小麥白粉病是由子囊菌綱中高度專性寄生的禾谷白粉菌小麥?；虰lumeriagraminis f. sp. tritici侵染而引起的一種氣傳病。它引起的小麥白粉病是由ー種嚴(yán)重的小麥葉部病害。病菌侵染小麥后，吸收植株?duì)I養(yǎng)，使小麥植株的光合能力下降甚至完全喪失，最終導(dǎo)致成穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重下降，能夠?qū)е滦←湲a(chǎn)量損失5% 34%，嚴(yán)重時(shí)能達(dá)到45%甚至絕收。在眾多的的小麥白粉病防治措施中，培育和推廣抗病品種最為經(jīng)濟(jì)有效并且環(huán)保。當(dāng)前生產(chǎn)上抗白粉病利用的主要是質(zhì)量抗性基因。但是，由于白粉病質(zhì)量抗性具有小種?；裕≡臒o(wú)毒基因與抗性基因進(jìn)行協(xié)同進(jìn)化，在生產(chǎn)上大面積推廣使用單ー抗病品種很容易導(dǎo)致產(chǎn)生新的毒性小種，從而使所攜帯的抗病基因喪失其抗性。從小麥種質(zhì)資源中發(fā)掘與利用新的抗白粉基因是小麥遺傳學(xué)家和育種家們的一個(gè)長(zhǎng)期目標(biāo)與挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供該小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記MAG5827 ；所述的分子標(biāo)記MAG5827 左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2，擴(kuò)增產(chǎn)物為282bp，此分子標(biāo)記來(lái)自一粒小麥TA20337AL染色體，為共顯性分子標(biāo)記，利用Mapmaker Macintosh V 2. 0測(cè)得與Mlm2033基因的遺傳距離為0. 4cM。所述的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中抗白粉病基因的鑒定和轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。一粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記方法，用以下的任意ー對(duì)分子標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增待檢小麥基因組DNA，并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物分子標(biāo)記MAG5827
左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2 ；如果用引物MAG5827能夠擴(kuò)增出282bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著待檢小麥存在抗白粉病基因Mlm2033。ー種篩選抗白粉病小麥的方法，其特征在于用權(quán)利要求I所述的引物對(duì)之ー擴(kuò)增待檢小麥基因組DNA，如果用引物MAG5827能夠擴(kuò)增出282bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志該待檢小麥為存在抗白粉病Mlm2033的抗白粉病小麥。上述小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記可通過(guò)以下方法獲得( 一)TA2033與M389F2代的創(chuàng)建與表型鑒定
(I)栽培一粒小麥TA2033 (3)與栽培一粒小麥M389 (早)進(jìn)行雜交得到雜種F1,
F1自交產(chǎn)生F2群體。(2)F2代群體單株種植于穴盤，放置溫室，白天22度14小時(shí)，晚上18度10小吋。一葉一心期接種白粉病，接種7天后進(jìn)行抗性調(diào)查。鑒定結(jié)果見(jiàn)表I。(3)F2代單株調(diào)查后將感病植株移苗大田，自交所得種子為F3家系。每個(gè)F3家系中選擇18粒進(jìn)行子代測(cè)驗(yàn)。(4)通過(guò)對(duì)F2進(jìn)行遺傳分析，推定抗病種質(zhì)中攜帶的抗病基因的個(gè)數(shù)。( ニ)多態(tài)性分子標(biāo)記篩選(5)將6株抗病F2單株的葉片等量混合成抗池，6株感病F2單株的葉片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病親本TA2033、感病親本M389、抗池和感池的DNA,應(yīng)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記SSR與BSA (Bulk segregant analysis)結(jié)合的方法進(jìn)行多態(tài)性篩選。(6)首先利用37對(duì)SSR引物對(duì)TA2033、M389、抗池和感池進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR 反應(yīng)體積為 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mMdNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0. 2微升，10 y M引物(F/R)各0. 5微升，模板DNA20納克，加水至25微升；SSR反應(yīng)體系為DNA 94°C預(yù)變性3min后，94°C變性lmin，50_65°C (視引物而定)退火lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸IOmin ； 在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果選擇在親本間和F2代群體的R、S池間擴(kuò)增出相同有多態(tài)型的引物，與Mlm2033連鎖的候選分子標(biāo)記I對(duì)；(三)分子標(biāo)記獲得(7)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，上述標(biāo)記ZMG132被定位于小麥7AL，由于小麥的第七群與短柄草的第一群有宏觀共線性，利用短柄草對(duì)應(yīng)的區(qū)段捜索小麥EST并開(kāi)發(fā)標(biāo)記，其中根據(jù)EST CJ579028轉(zhuǎn)化的標(biāo)記，MAG5827的PCR產(chǎn)物在抗感親本及抗感池中有一致的多態(tài)。(8)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用擴(kuò)增獲得的純和感病家系各單株的基因型資料與抗性鑒定獲得的抗性資料構(gòu)建I對(duì)分子標(biāo)記與Mlm2033基因的連鎖圖，所用軟件為MapmakerMacintosh V 2. 0，獲得了與Mlm2033緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5827，利用MapmakerMacintosh V 2. 0測(cè)得與Mlm2033基因的遺傳距離分別為0. 4cM ；
(四)抗譜的獲得(9)利用本實(shí)驗(yàn)室全部 的15個(gè)白粉病生理小種分別接種抗病材料TA2033，記錄抗病材料TA2033對(duì)不同生理小種的抗病表現(xiàn)。(五)向普通小麥的轉(zhuǎn)移(10)利用獲得的分子標(biāo)記，通過(guò)先將抗病基因Mlm2033導(dǎo)入到四倍體中，再導(dǎo)入到普通小麥獲得攜帯有Mlm2033的普通小麥品種(簡(jiǎn)稱為橋梁親本法)。有益效果本發(fā)明在一粒小麥中發(fā)現(xiàn)了ー個(gè)抗白粉病基因Mlm2033，Mlm2033優(yōu)異的抗病表現(xiàn)使得其在抗白粉病育種中有重要的價(jià)值。獲得了與其緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5827。利用獲得的分子標(biāo)記，通過(guò)橋梁親本法將Mlm2033轉(zhuǎn)移到推廣品種揚(yáng)麥158中，成功獲得了攜帶有Mlm2033的抗病揚(yáng)麥158。I、在一粒小麥中鑒定了ー個(gè)抗白粉病基因Mlm2033。2、對(duì)Mlm2033的抗譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示Mlm2033抗本實(shí)驗(yàn)室全部15個(gè)白粉病生理小種，具有優(yōu)異的抗性，是白粉病育種中優(yōu)良的抗病基因。3、獲得了與小麥抗白粉病基因Mlm2033緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5827。MAG5827與基因的遺傳距離為0. 4cM,同時(shí)也是共顯性分子標(biāo)記，能夠幫助該基因向推廣品種中轉(zhuǎn)移以及與其它抗病基因聚合。4、鑒定方便。分子標(biāo)記具有檢測(cè)方便、擴(kuò)增穩(wěn)定、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。用標(biāo)記MAG5827檢測(cè)小麥抗白粉病基因Mlm2033，可以確定Mlm2033的存在與否以及存在狀態(tài)，并預(yù)測(cè)白粉病抗性，進(jìn)而加快轉(zhuǎn)移Mlm2033的利用。5、本發(fā)明提出了利用一粒小麥種質(zhì)資源中抗白粉病基因的方法利用分子標(biāo)記篩選，通過(guò)橋梁親本法將Mlm2033導(dǎo)入到六倍體小麥中；利用該方法成功獲得了抗白粉病的揚(yáng)麥158。


圖I分子標(biāo)記擴(kuò)增帶型MAG5827擴(kuò)增帶型，其中I，2，3，4分別為抗病品種TA2033、感病品種M389、抗池和感池，M :pUC19/MspI，箭頭所指為282bp特異擴(kuò)增條帶；圖2MAG5827與小麥抗白粉病基因Mlm2033的遺傳連鎖圖，左邊為標(biāo)記間的圖距，箭頭所指方向?yàn)槎肆７较颉?br> 具體實(shí)施例方式實(shí)施例I( 一)TA2033與M389F2代的創(chuàng)建與表型鑒定( 一 ) TA2033與M389F2代的創(chuàng)建與表型鑒定(I)栽培一粒小麥TA2033 (3)與栽培一粒小麥M389 (早)進(jìn)行雜交得到雜種F1,
F1自交產(chǎn)生F2群體。(2)F2代群體單株種植于穴盤，放置溫室，白天22度14小時(shí)，晚上18度10小吋。一葉一心期接種白粉病，接種7天后進(jìn)行抗性調(diào)查。鑒定結(jié)果見(jiàn)表I。
表IBgt 19 接種后 M389 X TA2033F2 群體 0058](3)F2代單株調(diào)查后將感病植株移苗大田，自交所得種子為F3家系。每個(gè)F3家系中選擇18粒進(jìn)行子代測(cè)驗(yàn)。驗(yàn)證感病單株是否為純和感病家系。(4)通過(guò)對(duì)ろ進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)抗病種質(zhì)TA2033中攜帯有ー個(gè)顯性抗病基因。( ニ)多態(tài)性分子標(biāo)記篩選(I)將6株抗病F2單株的葉片等量混合成抗池，6株感病F2單株的葉片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病親本TA2033、感病親本M389、抗池和感池的DNA,應(yīng)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記SSR與BSA (Bulk segregant analysis)結(jié)合的方法進(jìn)行多態(tài)性篩選。(2)首先利用 37 對(duì) SSR 引物(bare =Song QJ, Shi JR, Singh S，F(xiàn)ickus Eff,Costa JM, Lewis J, Gill BS, Ward R, Cregan PB (2005) Development and mappingof microsatellite (SSR)markers in wheat.Theor Appl Genet 110 :550-560 ;gwm :Roder MS, Korzun V, Wendehake K, Plaschke J, Tixer MH, Leroy P, Ganal MW(1998)Amicrosatellite map of wheat. Genetics 149 :2007-2023；wmc ffheat MicrosatelliteConsortium(http://wheat, pw. usda. gov) ；cfa, gpw :Sourdille，s lab(http://wheat.pw.usda.gov) ；cfd Guyomarc> h H, Sourdille P, Charmet G, Edwards KJ, BernardM(2002)Characterization of polymorphic microsate丄Iite markers from Aegilopstauschn and transferaoility to the D—genome of bread wheat. Theor Appl Genet104 :1164-1172 ；gdm Pestsova E, Ganal MW, Rflder MS (2000) Isolation and mappingof microsatel丄ite markers speciffc for the D genome of bread wheat. Genome 43:689-697)對(duì)TA2033、M389、抗池和感池進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR 反應(yīng)體積為 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mMdNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0. 2微升，10 y M引物(F/R)各0. 5微升，模板DNA 20納克，加水至25微升；SSR反應(yīng)體系為DNA 94°C預(yù)變性3min后，94°C變性lmin，50_65°C (視引物而定)退火lmin，72°C延伸展lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸IOmin ；其中SSR標(biāo)記ZMG132在抗感親本與抗感池之間檢測(cè)到了一致多態(tài)。(三)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)(3)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，根據(jù) Singriin 的定位結(jié)果(Singriin C, Hsam SLK, ZellerFJ, Wenzel Lr, Mohler V(2004)Localization of a novel recessive powdery mildewresistance gene from common wheat line RD30in the terminal region of chromosome7AL. Theor Appl Genet 109 :210-214)，ZMG132被定位于7AL。由于小麥的第七群與短柄草的第一群有宏觀共線性，利用短柄草對(duì)應(yīng)的區(qū)段捜索小麥EST并開(kāi)發(fā)標(biāo)記，其中根據(jù)ESTCJ579028轉(zhuǎn)化的標(biāo)記，MAG5827的PCR產(chǎn)物在抗感親本及抗感池中有一致的多態(tài)(圖I)。(4)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用擴(kuò)增獲得的純和感病家系各單株的基因型資料與抗性鑒定獲得的抗性資料構(gòu)建I對(duì)分子標(biāo)記與Mlm2033基因的連鎖圖，所用軟件為MapmakerMacintosh V 2. 0，獲得了與Mlm2033緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG5827，利用MapmakerMacintosh V 2. 0測(cè)得與Mlm2033基因的遺傳距離分別為0. 4cM(圖2)；(四)抗譜的獲得(5)利用本實(shí)驗(yàn)室全部的15個(gè)白粉病生理小種分別接種抗病材料TA2033，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TA2033對(duì)15個(gè)生理小種表現(xiàn)抗病，是優(yōu)良的抗病基因。(五)向普通小麥的轉(zhuǎn)移
(6)利用獲得的分子標(biāo)記，通過(guò)先將抗病基因Mlm2033導(dǎo)入到四倍體中，再導(dǎo)入到普通小麥獲得攜帯有Mlm2033的普通小麥品種(簡(jiǎn)稱為橋梁親本法)。利用上述策略，成功獲得了攜帶有Mlm2033的抗病揚(yáng)麥158。小麥種質(zhì)資源中蘊(yùn)含豐富的基因資源，利用這些基因資源對(duì)于小麥具有重要作用。本發(fā)明通過(guò)將抗病種質(zhì)TA2033與感病品種雜交，通過(guò)遺傳分析確定抗病材料中攜帯有ー個(gè)顯性的抗病基因，通過(guò)分子標(biāo)記篩選，并構(gòu)建分離群體，發(fā)現(xiàn)抗病基因位于小麥7AL染色體上，通過(guò)構(gòu)建分離群體同時(shí)利用分子標(biāo)記的方法構(gòu)建了抗病基因Mlm2033的遺傳連鎖圖?？棺V測(cè)試發(fā)現(xiàn)Mlm2033具有優(yōu)異的白粉病抗性，是小麥抗白粉病育種的優(yōu)良抗源。利用分子標(biāo)記MAG5827，通過(guò)橋梁親本法成功將抗白粉病基因Mlm2033導(dǎo)入到推廣品種揚(yáng)麥158中。在傳統(tǒng)育種的方法中，由于不知道抗病材料的遺傳及其連鎖的分子標(biāo)記，每代轉(zhuǎn)移都需要抗性鑒定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，已知與Mlm2033緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以簡(jiǎn)便快捷的篩選含有Mlm2033的植株，分子標(biāo)記MAG5827的應(yīng)用，可以大大節(jié)省抗病材料的篩選時(shí)間和勞力，并加強(qiáng)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。
權(quán)利要求
1.一粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記，其特征在于所述的分子標(biāo)記MAG5827 ； 所述的分子標(biāo)記MAG5827 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 擴(kuò)增產(chǎn)物為282bp，此分子標(biāo)記來(lái)自一粒小麥TA20337AL染色體，為共顯性分子標(biāo)記，利用Mapmaker Macintosh V 2. 0測(cè)得與Mlm2033基因的遺傳距離為0. 4cM。
2.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在小麥野生種質(zhì)資源中抗白粉病基因的鑒定和轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。
3.—粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記方法,其特征在于用以下的ー對(duì)分子標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增待檢小麥基因組DNA，并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 分子標(biāo)記MAG5827 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2 ； 如果用引物MAG5827能夠擴(kuò)增出282bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著待檢小麥存在抗白粉病基因 Mlm2033。
4.ー種篩選抗白粉病小麥的方法,其特征在于用權(quán)利要求I所述的引物對(duì)之ー擴(kuò)增待檢小麥基因組DNA，如果用引物MAG5827能夠擴(kuò)增出282bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志該待檢小麥為存在抗白粉病Mlm2033的抗白粉病小麥。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記MAG5827與Mlm2033基因的遺傳距離為0.4cM。利用分子標(biāo)記MAG5827選擇含有Mlm2033單株，通過(guò)橋梁親本法可以將一粒小麥中的抗白粉病基因Mlm2033轉(zhuǎn)移到普通小麥中。利用本發(fā)明與Mlm2033緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以簡(jiǎn)便快捷的篩選含有Mlm2033的植株，分子標(biāo)記MAG5827的應(yīng)用，可以大大節(jié)省抗病材料的篩選時(shí)間和勞力，并加強(qiáng)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102653758SQ201210085158
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者付必勝, 馬正強(qiáng) 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)