專(zhuān)利名稱(chēng)：一種復(fù)合酶制劑的制備方法及其在飼料中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用木霉菌株制備復(fù)合酶制劑的方法以及該復(fù)合酶制劑在飼料中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著我國(guó)人民的生活水平的不斷提高，我國(guó)的飼料業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)得到迅速發(fā)展，飼料資源不足已經(jīng)成為阻礙我國(guó)飼料エ業(yè)發(fā)展的ー個(gè)重要原因。特別是我國(guó)是ー個(gè)發(fā)展中的農(nóng)業(yè)大國(guó)、人口大國(guó)，飼料的主要原料是植物性的餅柏和其他農(nóng)副產(chǎn)品，由于植物細(xì)胞壁中含有大量的纖維素組成的微纖維，埋在木質(zhì)素、半纖維素和果膠的連續(xù)相中，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。加工粉碎只能打碎部分細(xì)胞壁，還有相當(dāng)多的植物細(xì)胞完整無(wú)損，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包含在其中，難以被動(dòng)物所消化吸收，以致飼料利用率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用木霉菌株制備復(fù)合酶制劑的方法以及該復(fù)合酶制劑在飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明選擇產(chǎn)纖維素酶活性較高的木霉菌株進(jìn)行誘變選育、培養(yǎng)和發(fā)酵， 提取出酶制劑，然后將該酶制劑用于動(dòng)物飼料中。本發(fā)明的飼用復(fù)合酶制劑有以下作用
I、能夠破解植物細(xì)胞壁，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更好地被吸收飼用復(fù)合酶中的纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等的協(xié)同作用，能夠破壞細(xì)胞壁，使其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)，增加動(dòng)物對(duì)植物性飼料的利用率。2、補(bǔ)充內(nèi)源酶不足，促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收。加入飼用酶，可以通過(guò)外源酶的作用， 提聞詞料的消化率，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。3、消除抗?fàn)I養(yǎng)因子纖維素是ー種纖維ニ糖的高聚體，較難溶解，對(duì)單胃動(dòng)物的消化有阻礙作用。半纖維素和果膠溶于水后會(huì)產(chǎn)生粘性，不利于內(nèi)源酶的擴(kuò)散。飼用復(fù)合酶制劑中的外源酶的作用可以將阻礙動(dòng)物消化吸收的物質(zhì)降解，促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收。本發(fā)明技術(shù)方案的具體步驟如下
I、木霉91一11 (分類(lèi)名為康氏木霉WJP-02,拉丁文學(xué)名為T(mén)richoderma Koningii WJP-02，保藏日期為2012年2月22日，保藏單位全稱(chēng)是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng)是 CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2012028)菌株的培育
(1)出發(fā)菌株的選擇取保存的產(chǎn)纖維素酶活性較高的里氏木霉菌株在相同條件下固態(tài)培養(yǎng)，測(cè)定產(chǎn)酶能力，選取出發(fā)菌株里氏木霉A3;
(2)誘變選育將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-5天的里氏木霉A3菌株孢子懸液置紫外燈下處理2分鐘；稀釋后與含LiCl的去氧膽酸鈉、經(jīng)球磨12小時(shí)的2%纖維素粉瓊脂基混合，倒在I毫米的雙層平板的上層，雙層平板的下層是3毫米厚的Mand ' s營(yíng)養(yǎng)液瓊脂層。30°C 避光培養(yǎng)3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落；
(3)將從雙層平板上挑取的40個(gè)優(yōu)良菌株移入PDA斜面，30°C培養(yǎng)4-5天，取斜面一支，無(wú)菌水洗下，制成孢子懸液，將Iml孢子懸液接種于固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3-4天，加50 ml水30°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾得發(fā)酵粗酶液，測(cè)定纖維素酶活力，得到10株高產(chǎn)菌株；
(4)再經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)復(fù)篩，進(jìn)行單孢子分離和酶活測(cè)定，最終得到木霉91-11菌株。2、酶制劑的制備飼用復(fù)合酶制劑含有纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶等多酶組分，以木霉91-11菌株、玉米秸桿和麩皮為主原料，經(jīng)固態(tài)通風(fēng)發(fā)酵、提取酒精而成。本エ藝采用硫酸銨鹽析、酒精沉淀兩種方法進(jìn)行
(1)酶曲的制備木霉91-11菌株用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質(zhì)的三角瓶中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，得到酶曲；
(2)酶曲水浸提浸提槽中加入水和酶曲，常溫下間歇攪拌，浸提；
(3)離心分離將浸提得到的料液，用三足式離心機(jī)分批離心，分出纖維渣，離心稀酶液入儲(chǔ)te ；
(4)過(guò)濾凈化離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，得浄化的酶液；
(5)超濾濃縮浄化的酶液進(jìn)行超濾濃縮，得超濾液；
(6)超濾液沉淀，得到酶泥；
(7)酶泥加輔料混勻后，45°C真空干燥至水分的重量含量在8.0%以下；
(8)粉碎、混合干燥的酶進(jìn)行粗破碎后，在粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過(guò)40目或60目篩，得到飼用復(fù)合酶制劑。根據(jù)上述酶制劑的制備方法，其中步驟(2)的浸提條件為酶曲與水之比為I :7 ； 控制浸提液的PH5. 0-5. 59，室溫下浸提I. 5小時(shí)；
根據(jù)上述酶制劑的制備方法，其中步驟(5)中超濾濃縮的具體條件為工作溫度為常溫、控制PH5. 0-5. 5，進(jìn)液量與超濾水體積之比為4-6:1，系統(tǒng)壓カ控制在0. 1-0. 25MPa之間,濃縮4倍；
根據(jù)上述酶制劑的制備方法，其中步驟(6)中的沉淀方法優(yōu)選硫酸銨鹽析沉淀或酒精沉淀；
硫酸銨鹽析的具體方法優(yōu)選為超濾液泵入鹽析罐，開(kāi)動(dòng)攪拌，緩緩加入硫酸銨至飽和，加完后，繼續(xù)攪拌15分鐘，使硫酸銨充分溶解并與酶液混合均勻，常溫下靜置沉淀12 小時(shí)，濃縮液進(jìn)行壓濾或離心得到酶泥；
酒精沉淀的具體方法優(yōu)選為超濾液泵入酒精沉淀罐中，開(kāi)動(dòng)攪拌，加入預(yù)冷的重量比為95%酒精，加完后，繼續(xù)攪拌10分鐘，常溫下靜置沉淀，傾去上清液，離心分離或板框壓濾，收集濾液待回收，得酶泥；
本發(fā)明的有益效果是
1.纖維素酶組分較齊全，結(jié)晶纖維素也可分解；
2.酶活性比較穩(wěn)定，在pH4.8，50°C攪拌缸中，穩(wěn)定達(dá)48小時(shí)以上；
3.對(duì)化學(xué)抑制劑有一定的抗性；
4.91-11菌株產(chǎn)纖維素酶活性(FDA)較QM9414、Rut-C_30、⑶R-29都有大幅度的提
聞;
5.91-11菌株適合于固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)，這種發(fā)酵法投資成本相對(duì)較低。6.發(fā)酵的原料為各種飼料原料，如，豆柏、麩皮、米糠等等。通過(guò)固體發(fā)酵得到的酶制劑，正是由各種飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子誘導(dǎo)得到，來(lái)源性決定了該類(lèi)酶制劑在動(dòng)物腸胃道內(nèi)適應(yīng)性強(qiáng)、作用效果明確。
7.發(fā)酵產(chǎn)物是含有主要酶種和多種輔助酶種的復(fù)合酶，而不是簡(jiǎn)單的單酶復(fù)合物發(fā)酵所得到的酶制劑產(chǎn)品中，包括幾種主要酶種，如木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶， 等等，同時(shí)，產(chǎn)品中含有多種低濃度輔酶，能增強(qiáng)主要酶種的作用。輔助酶種可切去主鏈上的分枝，也可與微生物的其他代謝因子(未知因子)，一起作用，協(xié)助酶與特定的物質(zhì)結(jié)合， 這個(gè)過(guò)程是酶降解完整抗?fàn)I養(yǎng)因子的關(guān)鍵一歩，協(xié)助水解飼料組分中廣泛存在的非淀粉多糖及其他抗?fàn)I養(yǎng)因子。8.微生物在固體發(fā)酵的生長(zhǎng)條件，接近它們?cè)谧匀画h(huán)境中的生長(zhǎng)，因而更有能力生產(chǎn)出液體深層發(fā)酵不能生產(chǎn)的酶和代謝產(chǎn)物。9.酶蛋白屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物通常是在微生物進(jìn)行分化時(shí)形成的，液體培養(yǎng)抑制微生物分化，所以固體發(fā)酵單位的酶產(chǎn)量和種類(lèi)，往往比液體發(fā)酵聞。10.固體發(fā)酵得到的自然組合的酶，才真正具有協(xié)同作用，能很好地降解各種飼料中不可消化的組分。11.固體發(fā)酵生產(chǎn)，復(fù)合酶的各種酶制劑之間具有“協(xié)同性”。12.添加復(fù)合酶，能夠通過(guò)提前淀粉和蛋白質(zhì)的消化位點(diǎn)，從而提高動(dòng)物日量的消化率，改善動(dòng)物健康水平。13.添加復(fù)合酶，有明顯的能量效益。14.添加復(fù)合酶，酶解產(chǎn)生“生物活性寡糖”。15.添加復(fù)合酶，提高脂肪(油脂)的消化率。16.添加復(fù)合酶，能夠分解熱不敏感的大豆抗原蛋白、凝集素、胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子。17.除“木聚糖酶、葡聚糖酶”以外，復(fù)合酶中均含有一定量的“纖維素酶”、“甘露聚糖酶”、“半乳糖苷酶”等等。


附圖I中是酶制劑提取的エ藝流程圖。本申請(qǐng)中的木霉91 一 11的分類(lèi)名為康氏木霉WJP-02，拉丁文學(xué)名為T(mén)richoderma Koningii WJP-02，保藏日期為2012年2月22日，保藏單位全稱(chēng)是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng)是CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2012028o
具體實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例I
木霉菌株91一11，全稱(chēng)為康氏木霉WJP-02 (Trichoderma Koningii WJP-02),保藏號(hào)為CCTC N0:M2012028，選育方法如下
首先制備培養(yǎng)基以PDA為培養(yǎng)基在30°C下培養(yǎng)4-5天，然后固態(tài)培養(yǎng)以秸桿和麩皮為基質(zhì)、250ml三角瓶裝料5g，加營(yíng)養(yǎng)鹽15ml，0. IMPa滅菌30min，接種產(chǎn)纖維素菌株的孢子懸液(105-106 個(gè)/ml) lml，30°C培養(yǎng) 4 天。然后取保存的產(chǎn)纖維素酶活性較高里氏木霉菌株的菌株同條件下固態(tài)培養(yǎng)，測(cè)定產(chǎn)酶能力，選擇里氏木霉A3菌株為出發(fā)菌株。然后將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-5天的菌株孢子懸液以終濃度2 u g/ml的NIG溶液，pH6. 0，30°C預(yù)感處理30分鐘；置紫外燈下處理2分鐘；稀釋后與含LiCl (0. 2%)去氧膽酸鈉(0. 05%)，經(jīng)球磨12小時(shí)的2%纖維素粉瓊脂基混合，倒在I毫米的雙層平板的上層，雙層平板的下層是3毫米厚的Mand , s營(yíng)養(yǎng)液瓊脂層。 30°C避光培養(yǎng)3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落。將從雙層平板上挑取的40個(gè)優(yōu)良菌株移入PDA斜面，30°C培養(yǎng)4-5天，取斜面一支無(wú)菌水洗下，制成孢子懸液，將Iml孢子懸液接種于固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3-4天，加50 ml水30°C 浸提I小時(shí)，過(guò)濾得發(fā)酵粗酶液，測(cè)定纖維素酶活力(FDA)，得到10株高產(chǎn)菌株。再經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)復(fù)篩，獲得一株產(chǎn)纖維素酶活力高，發(fā)酵周期短的菌株，對(duì)其進(jìn)行單孢子分離和酶活測(cè)定，最終得到91一 11菌株。
實(shí)施例2
酶制劑的制備
主要設(shè)備浸提糟、離心機(jī)、超濾器、鹽析罐、貯罐、離心沉降機(jī)、輸、液泵、真空干燥器、粉碎機(jī)、混合器。實(shí)施例I中篩選出的木霉91 一 11菌株用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質(zhì)的三角瓶中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，得到酶曲；浸提槽定量的水，酶曲與水之比為I :7 ;浸提液pH5. 0-5. 59，室溫下間歇攪拌，浸提I. 5小吋。浸提的料液，用三足式離心機(jī)分批離心，分出纖維渣，稀酶液入儲(chǔ)罐。離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)液，得浄化的酶液。浄化的酶液進(jìn)行超濾濃縮。工作溫度為常溫、pH5. 0—5. 5，進(jìn)液量與超濾水體積之比為4-6:1，根據(jù)超濾情況調(diào)整系統(tǒng)壓力，控制在
0.I一0.25MPa之間，濃縮4倍。超濾濃縮液泵入鹽析罐，開(kāi)動(dòng)攪拌，按所需硫酸銨飽和度緩緩加入粉狀硫酸銨，邊加邊攪拌，硫胺加完后，繼續(xù)攪拌15分鐘，使硫酸銨充分溶解并與酶液混合均勻，達(dá)到酶液中硫酸銨飽和度為70%，常溫下靜置沉淀12個(gè)小時(shí)，傾去上清液，濃縮液進(jìn)行壓濾或離心。離心分離離心速度1450轉(zhuǎn)/分以上，離心時(shí)間30— 35分鐘。真空低溫干燥酶泥加輔料混勻后，裝盤(pán)入真空干燥器中進(jìn)行低溫(45°C)干燥。酶中水重量含量在8.0%以下。干燥的酶進(jìn)行粗破碎后，在粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，分別過(guò)40目或60目篩，摻入助劑，混合后即為飼用復(fù)合酶。提取收率浸提收率87%;濃縮收率85%;硫酸銨鹽析收率 95% ；尚心分尚收率95% ;干燥收率94%,提取總收率63%。
實(shí)施例3
酶制劑的制備實(shí)施例I中篩選出的木霉91 一 11菌株用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質(zhì)的三角瓶中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，得到酶曲；浸提槽定量的水，酶曲與水之比為I :7 ;浸提液PH5. 0-5. 59，室溫下間歇攪拌，浸提I. 5 小吋。浸提的料液，用三足式離心機(jī)分批離心，分出纖維渣，稀酶液入儲(chǔ)罐。離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)液，得浄化的酶液。浄化的酶液進(jìn)行超濾濃縮。工作溫度為常溫、pH5. 0-5. 5，進(jìn)液量與超濾水體積之比為4-6:1，根據(jù)超濾情況調(diào)整系統(tǒng)壓力，控制在0. 1-0. 25MPa之間，濃縮4倍。超濾濃縮液泵入酒精沉淀罐中，酶液中酒精濃度為67%， 開(kāi)動(dòng)攪拌，按所需濃度流量加_15°C以下預(yù)冷的95%酒精，加完后，繼續(xù)攪拌10分鐘，常溫下靜置沉淀4-6小時(shí)，傾去上清液，離心分離。離心速度1450轉(zhuǎn)/分以上，離心時(shí)間30-35 分鐘。板框試壓、試漏一切正常后，壓入沉淀酶液，根據(jù)壓濾情況，調(diào)節(jié)壓力，控制在0. 5MPa 之內(nèi)。收集濾液待回收，得酶泥。酶泥加輔料混勻后，裝盤(pán)入真空干燥器中進(jìn)行低溫(45°C) 干燥。酶中水的重量含量在8.0%以下。干燥的酶進(jìn)行粗破碎后，在粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，分別過(guò)40目或60目篩，摻入助劑，混合后即為飼用復(fù)合酶。提取收率浸提收率87%;濃縮收率85% ;酒精沉淀收率93% ;離心分離收率95% ;干燥收率91% ;提取總收率62%。
實(shí)施例4
兩組雞飼料，選用常規(guī)配方，其組成為以重量計(jì)玉米63%，豆餅18. 5%，麩皮5%，酵母4%，骨粉I. 5%，貝殼粉7. 5%，鹽0. 3%，多維素0. 03%,蛋氨酸0. 03%。但是在第一組雞飼料中添加了飼料總重量0. 1%的按以上步驟制作的復(fù)合酶，也就是說(shuō)第二組為對(duì)照組。試驗(yàn)雞為雛雞籠三級(jí)喂養(yǎng)，每籠10只雞，飼養(yǎng)人員手撒料，每天喂4次，并記錄投喂量。經(jīng)過(guò)50天后
的飼養(yǎng)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.ー種飼用復(fù)合酶制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)酶曲的制備木霉91-11菌株用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質(zhì)的三角瓶中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，得到酶曲；(2)酶曲水浸提浸提槽中加入水和酶曲，常溫下間歇攪拌，浸提；(3)離心分離將浸提得到的料液，用三足式離心機(jī)分批離心，分出纖維渣，離心稀酶液入儲(chǔ)te ；(4)過(guò)濾凈化離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，得浄化的酶液；(5)超濾濃縮浄化的酶液進(jìn)行超濾濃縮，得超濾液；(6)超濾液沉淀，得到酶泥；(7)酶泥加輔料混勻后，45°C真空干燥至水分的重量含量在8.0%以下；(8)粉碎、混合干燥的酶進(jìn)行粗破碎后，在粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過(guò)40目或60目篩，得到飼用復(fù)合酶制劑。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(6)中的沉淀方式為硫酸銨鹽析沉淀。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于步驟(6)的具體操作為將超濾液泵入鹽析罐，開(kāi)動(dòng)攪拌，緩緩加入硫酸銨至飽和，加完后，繼續(xù)攪拌15分鐘，使硫酸銨充分溶解并與酶液混合均勻，常溫下靜置沉淀12小時(shí)，去掉上清液，壓濾或離心得到酶泥。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(6)中的沉淀方式為酒精沉淀。
5.如權(quán)利要求I或4所述的方法，其特征在于步驟(6)的具體操作為將超濾液泵入酒精沉淀罐中，開(kāi)動(dòng)攪拌，加入預(yù)冷的重量比為95%酒精，加完后，繼續(xù)攪拌10分鐘，常溫下靜置沉淀，傾去上清液，離心分離或板框壓濾，收集濾液待回收，得酶泥。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法制備的復(fù)合酶制劑在飼料中應(yīng)用，其特征在于將該復(fù)合酶制劑混合在植物制成的飼料中。
7.一種制備如權(quán)利要求I所述的木霉91-11菌株的方法，其特征在于該方法包括以下步驟出發(fā)菌株的選擇取保存的產(chǎn)纖維素酶活性較高的里氏木霉菌株在相同條件下固態(tài)培養(yǎng)，測(cè)定產(chǎn)酶能力，選取里氏木霉A3為出發(fā)菌株；誘變選育將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-5天的里氏木霉A3菌株孢子懸液置紫外燈下處理 2分鐘；稀釋后與含LiCl的去氧膽酸鈉溶液、經(jīng)球磨12小時(shí)的2%纖維素粉瓊脂基混合，倒在I毫米的雙層平板的上層，雙層平板的下層是3毫米厚的Mand , s營(yíng)養(yǎng)液瓊脂層，30°C避光培養(yǎng)3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落；將從雙層平板上挑取的40個(gè)優(yōu)良菌株移入PDA斜面，30°C培養(yǎng)4-5天，取斜面一支，無(wú)菌水洗下，制成孢子懸液，將Iml孢子懸液接種于固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3-4天，加50 ml 水30°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾得發(fā)酵粗酶液，測(cè)定纖維素酶活力，得到10株高產(chǎn)菌株；再經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)復(fù)篩，進(jìn)行單孢子分離和酶活測(cè)定，最終得到木霉91-11菌株。
8.利用如權(quán)利要求7所述的木霉91-11菌株制備酶的方法，其特征在于菌株在含有碳源和氮源的營(yíng)養(yǎng)鹽溶液配成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)酶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述碳源為花生秸、苞米秸、谷草和稗草粉中的ー種或多種。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述氮源為麩皮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用木霉菌株制備復(fù)合酶制劑的方法以及該復(fù)合酶制劑在飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明選擇產(chǎn)纖維素酶活性較高的木霉菌株進(jìn)行誘變選育、培養(yǎng)和發(fā)酵，提取出酶制劑，然后將該酶制劑用于動(dòng)物飼料中，從而增加動(dòng)物對(duì)飼料的利用率。
文檔編號(hào)C12R1/885GK102604918SQ20121008582
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者王健鵬 申請(qǐng)人:王健鵬