專利名稱：一種提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及ー種提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法。
背景技術：
藏紅花(Crocus sativus L.)又名西紅花、番紅花、是鳶尾科番紅花屬球根類多年生草本植物，原產歐洲南部和伊朗，經印度傳入西藏，故稱為藏紅花。藏紅花作為ー種珍貴調味劑、香料和染料在歐洲已有幾百年的悠久歷史。藏紅花還具有較高的藥用價值，是ー種名貴的藥材。作為藥用國外最早記載于公元1550年左右《埃伯斯紙草書》之中，具有活血化瘀、散郁開結等奇特功效。作為傳統(tǒng)中藥在我國沿用己久，《本草綱目》中以番紅花為其正名。我國傳統(tǒng)中醫(yī)認為藏紅花具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效，用于經閉、產后瘀阻、跌打損傷、傷寒、咳血吐血、溫毒發(fā)斑、憂郁痞悶、驚悸發(fā)狂等癥?，F代藥理學研究表明，藏紅花柱頭提取物及其提純組分藏紅花素(crocin)、藏紅花苦素(picrocrocin)、藏紅花酸(crocetin)等在抗腫瘤、調節(jié)免疫、治療預防心腦血管疾病、抗抑郁癥以及抗氧化等方面具有明確的藥理效應。尤其在抗腫瘤方面功效顯著，特別對對白血病、卵巣癌、結腸癌、乳頭肉瘤、扁平細胞瘤和軟組織肉瘤都具有較強的抑制作用，其毒副作用明顯低于現常用抗腫瘤藥物。藏紅花原產于西班牙、希臘等南歐各國以及伊朗等地。由于其對生長環(huán)境要求較高，在我國僅西藏、新疆、浙江、江西、江蘇、北京、上海有少量栽培。另外，傳統(tǒng)方式栽培的藏紅花品質參差不齊、產量和質量較低。因此，藏紅花資源極其有限。我國主要是靠進口供藥用，嚴重制約其在醫(yī)藥エ業(yè)中的應用。植物組織和細胞培養(yǎng)技術在藥用植物生產上已得到廣泛的應用，為名貴藥和有價值的藥用資源的生產提供了新的途徑。已有大規(guī)模成功培養(yǎng)紫草、人參和青蒿等細胞生產紫草色素、人參皂甙和青蒿素等報道。利用植物細胞培養(yǎng)技術大規(guī)模生產藏紅花素等活性物質是解決藏紅花資源的有效方法之一。國內研究者先后開展了藏紅花細胞培養(yǎng)生產藏紅花素的研究工作，但存在的主要問題是產物產量低。如何提高藏紅花細胞培養(yǎng)物中藏紅花色素的含量是藏紅花細胞培養(yǎng)技術產業(yè)化應用的關鍵。研究發(fā)現，誘導子處理能提高植物組織培養(yǎng)物中有用次生代謝產物的含量。誘導子是能夠刺激植物細胞合成防御性次生代謝產物的物質，它可以通過改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力，引起次生代謝途徑中代謝通量和反應速率的改變，從而提高次生代謝產物的產量，為植物細胞次生代謝的合成調控提供了新手段，引起了人們的廣泛關注。利用誘導子來提高次生代謝產物，是目前在藥用植物細胞培養(yǎng)中常用的方法，最常用的誘導子有真菌細胞壁水解物、殼聚糖、茉莉酸甲酷、金屬尚子等。殼寡糖(也稱殼聚寡糖、幾丁寡糖，學名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺)是由2 10個氨基葡萄糖分子通過β_1，4-糖苷鍵連接而成的堿性寡糖，由幾丁質脫こ?；笏峤饣蛎附獾玫?。研究表明，殼寡糖作為ー種外源激發(fā)子，可激活植物的防御反應，通過抑制病菌入侵、誘導產生植保素、激活相關防御基因表達等途徑提高植物的整體抗性。殼寡糖作為誘導子促進植物次生代謝產物積累的作用也備受關注。50和200ppm殼寡糖能顯著提高希臘牛至(Origanum vulgare ssp. hirtum)多酌·含量(Heng Y 等，J. Agric. Food Chem. ,2012,60，136-143)。50-75mg/L殼寡糖具有誘導甘蔗葉積累多酚的作用(周桂等，南方農業(yè)科學，2011，42 (8)，874-877)。殼寡糖也能明顯提高4°C保藏條件下櫻桃中花青素含量(Garry K等，European Food Research and Technology, 233 (2), 351-358)。米用拌種結合葉噴方法用低聚殼寡糖處理丹參種子和葉片，低聚殼寡糖能較顯著地促進丹參酮IIA含量的提高(張元等，安徽農業(yè)科學，2010，38 (34)，19316-19318)
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供ー種提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，該方法主要基于培養(yǎng)的藏紅花細胞色素產量低的問題，提出利用殼寡糖作為新型誘導子，應用到藏紅花細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中以提高藏紅花細胞合成藏紅花色素能力。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下ー種提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，它包括如下步驟(I)將藏紅花愈傷組織接種到含有0. 5mg/L細胞分裂素、2mg/L細胞生長素和30g/L蔗糖的植物細胞培養(yǎng)基上，于20± 1°C培養(yǎng)25 30天；(2)將步驟⑴培養(yǎng)后的愈傷組織培養(yǎng)于含有60mg/L或20mg/L寡糖的植物細胞培養(yǎng)基中，所述的植物細胞培養(yǎng)基中添加0. 5mg/L細胞分裂素、2mg/L細胞生長素和20g/L蔗糖，于20±1°C培養(yǎng)26天。步驟(I)中，所述的藏紅花愈傷組織為藏紅花球莖或芽以常規(guī)方法處理誘導形成的愈傷組織。步驟(I)和步驟(2)中，所述的細胞分裂素為6-芐氨基嘌呤(以下簡稱6-BA)。步驟⑴中，所述的細胞生長素為萘こ酸(以下簡稱NAA)。步驟(I)中，所述植物細胞培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基為高鹽培養(yǎng)基，含有高濃度的硝酸鹽、鉀離子和銨離子，微量元素種類較多，其配方可參見Murashige T，Skoog,FA. 1962，Physiol. Plant 15 :473_479。步驟⑵中，所述的細胞生長素為吲哚こ酸(以下簡稱IAA)。步驟(2)中，所述的寡糖為殼寡糖，分子量3000Da。步驟(2)中，所述的植物細胞培養(yǎng)基為1/2B5培養(yǎng)基(其中磷酸ニ氫鈉、硝酸鉀、硫酸銨、硫酸鎂用量減半)。B5培養(yǎng)基配方可參見Gamborg OL7Miller RA7Ojima K. 1968，Exp.Cell Res. 50 :151-158。步驟(2)中，寡糖加入植物細胞培養(yǎng)基中的時機選擇在步驟(2)的細胞培養(yǎng)之前或在步驟(2)的細胞培養(yǎng)之后15天以內。有益效果本發(fā)明的方法能夠明顯促進藏紅花細胞合成藏紅花色素的能力，達到提高藏紅花色素產量的目的，而且生產的藏紅花色素穩(wěn)定，不易褐化。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例I : 選健康藏紅花球莖，剝去球莖皮膜，將球莖洗凈后于流水下沖洗過夜。用75% (v/V)こ醇浸泡lmin,再用O. I %升萊溶液消毒15min,之后用無菌水漂洗4次。用滅菌濾紙吸干球莖表面水分后切成O. 5 Icm3的小塊。接種于含有2.0mg/L 2，4-D和O. 5mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上，于20± 1°C下培養(yǎng)35天左右可獲得藏紅花球莖愈傷組織。將得到的藏紅花球莖愈傷組織接種到MS培養(yǎng)基上，其中附加O. 5mg/L 6_BA、2mg/LNAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，于20± I°C黑暗條件下培養(yǎng)，每25 30天繼代一次。將繼代培養(yǎng)26 28天的藏紅花球莖愈傷組織接種到含有60mg/L殼寡糖的1/2B5培養(yǎng)基中，其中附加O. 5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)26天，轉速130r/min。利用分光光度法測量藏紅花色素的含量，其含量為22. 04mg/gdCW。在相同條件下，1/2B5培養(yǎng)基中不加殼寡糖為對照，藏紅花色素的含量為12. 19mg/gdcw0可以看出，使用本發(fā)明方法培養(yǎng)的藏紅花細胞，其藏紅花色素的含量比對照提聞了 80. 8 。實施例2 將實施實例I中繼代培養(yǎng)26 28天的藏紅花球莖愈傷組織接種到1/2B5培養(yǎng)基中，其中附加O. 5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，轉速130r/min。在培養(yǎng)第4天時加入殼寡糖,終濃度為60mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)至26天，藏紅花色素的含量比對照提聞了 121.3%。實施例3 將實施實例I中繼代培養(yǎng)26 28天的藏紅花球莖愈傷組織接種到1/2B5培養(yǎng)基中，其中附加0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，轉速130r/min。在培養(yǎng)第14天時加入殼寡糖,終濃度為60mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)至26天，藏紅花色素的含量比對照提聞了 85.7%。實施例4 球莖按實施實例I方法消毒后切下芽點，置于不含激素的MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)長出無菌芽，直接以無菌芽作為誘導愈傷組織誘導外植體材料，將其切成約O. 5 Icm的小段，接種于含有2. Omg/L 2，4-D和O. 25mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上，于20± I°C培養(yǎng)獲得藏紅花芽愈傷組織。將得到的藏紅花芽愈傷組織分別接種到MS培養(yǎng)基上，其中附加O. 5mg/L 6-BA,2mg/L NAA和30g/L蔗糖，于20± I°C黑暗條件下培養(yǎng)，每25 30天繼代一次。將繼代培養(yǎng)26 28天的藏紅花芽愈傷組織接種到含有20mg/L殼寡糖的1/2B5培養(yǎng)基中，其中附加O. 5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)26天，轉速130r/min。藏紅花色素的含量為17. 78mg/g dew。在相同條件下，1/2B5培養(yǎng)基中不加殼寡糖為對照，其藏紅花色素的含量為14. 61mg/g dew。使用本發(fā)明方法培養(yǎng)的藏紅花細胞，其藏紅花色素的含量比對照提高了 21. 7%。實施例5
將實施實例4中繼代培養(yǎng)26 28天的藏紅花芽愈傷組織接種到1/2B5培養(yǎng)基中，其中附加O. 5mg/L BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，轉速130r/min。在培養(yǎng)第4天時加入殼寡糖,終濃度為20mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)至26天，藏紅花色素的含量比對照提高了 51.3%。
權利要求
1.ー種提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)將藏紅花愈傷組織接種到含有O.5mg/L細胞分裂素、2mg/L細胞生長素和30g/L蔗糖的植物細胞培養(yǎng)基上，于20±1°C培養(yǎng)25 30天； (2)將步驟(I)培養(yǎng)后的愈傷組織培養(yǎng)于含有60mg/L或20mg/L寡糖的植物細胞培養(yǎng)基中，所述的植物細胞培養(yǎng)基中添加O. 5mg/L細胞分裂素、2mg/L細胞生長素和20g/L蔗糖，于20±1°C培養(yǎng)26天。
2.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的藏紅花愈傷組織為藏紅花球莖或芽以常規(guī)方法處理誘導形成的愈傷組織。
3.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(I)和步驟(2)中，所述的細胞分裂素為6-芐氨基嘌呤。
4.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的細胞生長素為萘こ酸。
5.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述植物細胞培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
6.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的細胞生長素為吲哚こ酸。
7.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的寡糖為殼寡糖。
8.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的植物細胞培養(yǎng)基為1/2B5培養(yǎng)基。
9.根據權利要求I所述的提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，其特征在于，步驟(2)中，寡糖加入植物細胞培養(yǎng)基中的時機選擇在步驟(2)的細胞培養(yǎng)之前或在步驟(2)的細胞培養(yǎng)之后15天以內。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高藏紅花細胞合成藏紅花色素的方法，它包括如下步驟(1)將藏紅花愈傷組織接種到含有0.5mg/L細胞分裂素和2mg/L細胞生長素的植物細胞培養(yǎng)基上，于20±1℃培養(yǎng)25～30天；(2)將步驟(1)培養(yǎng)后的愈傷組織培養(yǎng)于含有60mg/L或20mg/L寡糖的植物細胞培養(yǎng)基中，所述的植物細胞培養(yǎng)基中添加0.5mg/L細胞分裂素和2mg/L細胞生長素，于20±1℃培養(yǎng)26天。本發(fā)明方法能顯著提高藏紅花細胞合成能力，藏紅花色素含量顯著提高，得到的藏紅花色素穩(wěn)定、不易褐化。
文檔編號C12N5/04GK102618484SQ201210086288
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權日2012年3月28日
發(fā)明者吳頻梅, 孫鎮(zhèn), 袁麗紅 申請人:南京工業(yè)大學