專利名稱：口腔癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種口腔癌易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估口腔癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療口腔癌的方向指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
口腔癌是發(fā)生在口腔的惡性腫瘤的總稱，大部分屬于鱗狀上皮細(xì)胞癌。在臨床實(shí)踐中口腔癌包括唇癌、牙銀癌、舌癌、軟硬腭癌、頜骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌和上頜竇癌以及發(fā)生于顏面部皮膚粘膜的癌癥等?？谇话┦穷^頸部較常見的惡性腫瘤之一。口腔癌在全世界是居第六位的常見腫瘤，并且男性的發(fā)生率較女性高I至5倍。在發(fā)展中國家，口腔癌是一大問題。口腔癌的發(fā)生率與年齡的增加有關(guān)。40歲后發(fā)生率急劇上升。隨著世界老齡人口的增加，將有更多的老年人處于口腔癌的高度危險(xiǎn)之中。其危險(xiǎn)隨年齡增長急劇上升，由30歲男性的7/10萬升至60歲時(shí)80/10萬。口腔癌發(fā)生初期，往往無痛苦，不易引起患者的重視，或者患者雖然發(fā)現(xiàn)一些異常但希望其能自行消失。口腔癌最好的治療方法莫過于手術(shù)切除。但一般當(dāng)口腔癌被確診時(shí)， 往往錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。此時(shí)即使可以手術(shù)，也會(huì)因?yàn)槭中g(shù)面積大而對(duì)口腔造成損害，不能恢復(fù)正常的功能與形態(tài)。因此，早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防就成為了治療口腔癌的重要前提。通過大量的研究證明，CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上 C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)。CYPlAl基因編碼細(xì)胞色素P4501A1。該蛋白是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類。被激活的CYPlAl能夠?qū)⒍喾N環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)如多環(huán)芳烴轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而更加造成癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)。分子生物學(xué)研究表明，CYPlAl第462號(hào)氨基酸由Ile變?yōu)閂al，以及CYPlAl MSPI位點(diǎn)T — C，會(huì)增加CYPlAl酶活性，可產(chǎn)生高誘導(dǎo)活性的CYPlAl酶，使多環(huán)芳烴類化合物活化速率加快，導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。國內(nèi)外研究表明CYPlAl基因多態(tài)性與口腔癌發(fā)生密切相關(guān)，大樣本的中國人群的關(guān)聯(lián)分析顯示， 該位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象是中國人群中重要的口腔癌遺傳易感因素之一。因此該位點(diǎn)可以作為肺癌易感性的遺傳檢測因子。CYP2D6酶又稱為異喹胍羥化酶，主要是因?yàn)楫愢掖x僅依賴于CYP2D6。CYP2D6 表型和基因型有顯著的種族差異，亞洲人常見的單核苷酸多態(tài)性之一是CYP2D6第一號(hào)外顯子C188T突變，造成Pro34Ser氨基酸替代，導(dǎo)致編碼的酶活性改變，影響對(duì)前致癌物的代謝，與個(gè)體的口腔癌易感性有密切關(guān)系。綜上所述，鑒于CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6 基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性在口腔癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在口腔癌發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出易患口腔癌的高危人群，從而有針對(duì)性的預(yù)防和治療口腔癌，這對(duì)于降低口腔癌的發(fā)病率有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上 C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估口腔癌發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種口腔癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上 C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測序引物； PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應(yīng)體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)(I)CYPlAl (Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA 3'(2)CYP1A1 (MspI)正向引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'CYPlAl (MspI)反向引物5' CTTCACTCCCACCGCCTCT3'(3)CYP2D6(C188T)正向引物5' AACACAGCAGGTTCACTCACAG3'CYP2D6(C188T)反向引物5' ATCCATGTTTGCTTCTGGTAGG3'
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5 μ I 25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I 分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應(yīng)使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)CYPlAl (Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'(2) CYPlAl (MspI)測序引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'(3)CYP2D6(C188T)測序引物5' AACACAGCAGGTTCACTCACAG3 '反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul, 25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA測序引物Iul，去離子水 2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行預(yù)防口腔癌發(fā)病的基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)I.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。2.基因型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測序，確定這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。3. 口腔癌發(fā)病高危人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通過對(duì)受檢者SNPs基因型的分析，出具口腔癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6 基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)基因上SNP位點(diǎn)基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀口腔癌易感基因無創(chuàng)檢測報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測口腔癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于檢測CYPlAl基因上 Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP 酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)CYPlAl 基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對(duì)CYPlAl基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述3個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對(duì)特異性引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA 3'(2)CYPlAl (MspI)正向引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'CYPlAl (MspI)反向引物5' CTTCACTCCCACCGCCTCT3'(3)CYP2D6(C188T)正向引物5' AACACAGCAGGTTCACTCACAG3'CYP2D6(C188T)反向引物5' ATCCATGTTTGCTTCTGGTAGG3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'(2)CYPlAl (MspI)測序引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'(3)CYP2D6(C188T)測序引物5'AACACAGCAGGTTCACTCACAG 3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1) 0 反應(yīng)體系10父？0 反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3.2uM DNA 測序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul，100% 乙醇溶液 15111，70%乙醇溶液30111，！1101 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度在_20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測口腔癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因上Ile462Val位點(diǎn)多態(tài)性及MspI位點(diǎn)多態(tài)性，CYP2D6基因上C188T位點(diǎn)多態(tài)性的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與口腔癌發(fā)生密切相關(guān)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評(píng)估受檢者口腔癌患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每一位受檢者的基因檢測結(jié)果從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受檢者有針對(duì)性的預(yù)防口腔癌的發(fā)生，降低口腔癌的發(fā)病幾率。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605081SQ20121008672
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司