專利名稱：高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學領域，涉及高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法。
背景技術：
后基因組時代研究的主要內容是基因的在基因組水平上調控機制，其中核小體定位以及其化學組成、其成分的修飾是重要的研究內容[1-6]。構成染色質的基本結構單位是核小體，正是核小體使DNA線性結構長度壓縮了約10000倍，核小體結構在壓縮基因組的同時，也限制了轉錄因子與DNA之間的結合。兩分子的組蛋白H2A、H2B、H3和H4構成八聚體的核心組蛋白。長度約146bp的DNA分子在組蛋白八聚體上盤繞I. 65圈形成核小體的 核心顆粒，每個核小體之間由約60個堿基圍繞著Hl組蛋白的連接子連接[7-10]。以核小體形式存在的DNA會影響轉錄的每個過程，包括從轉錄起始復合物前體的結合到延伸的每ー個階段。146bp的DNA圍繞組蛋白八聚體I. 65圈；其中有14個組蛋白與DNA連接位點。在生理條件下蛋白與DNA的結合形成的核小體是相對穩(wěn)定存在的。但核小體并不是ー個簡單的穩(wěn)定性的結構，它受很多蛋白復合體的調節(jié)并擁有不同的動態(tài)時相從而行使很復雜的生命活動。全基因組研究表明啟動子區(qū)域的核小體的密度遠遠低于編碼區(qū)的核小體密度。Yuan等人首次用高通量基因芯片技術發(fā)現(xiàn)在酵母基因啟動子區(qū)都存在約200bp的核小體空缺區(qū)域[12]。早期和實驗和嚴格的數(shù)學模型都支持這ー假說核小體的包裝信號在全基因組序列上有序列依賴性[13]。通過這種數(shù)學模型預測在DNA的轉錄因子結合的位點有著低水平核小體占位，相反在DNA沒有轉錄因子結合位點有著穩(wěn)定的核小體占位。因而，真核細胞基因組里有序列特異性的轉錄因子結合位點，這些位點可以有蛋白靠近，所以在基因激活的第一歩，這些序列比形成核小體的DNA序列更容易被刺激信號所激活。核心組蛋白八聚體對特定的DNA序列有一定的選擇性其選擇性較其他序列高約1000倍；也有ー些DNA序列特異性的DNA結合蛋白如轉錄因子等反式作用元件與DNA結合吋，會阻止核小體結構的形成，從而導致數(shù)百個堿基對的DNA雙鏈上沒有核小體結構，我們稱為核小體空缺區(qū)域(Nucleosome Free Region) [14]。這些核小體空缺區(qū)域經常發(fā)生在基因的轉錄起始位點或者轉錄終止點，或者轉錄因子結合的部位、或者轉錄活性較高的部位，這些位點對ー些非特異的核酸酶如DNase I、MNase敏感[15]。核小體空缺區(qū)域的發(fā)現(xiàn)使我們對真核細胞轉錄調控機制有深刻的了解。目前許多研究試圖用生物信息學計算機預測的辦法，在基于DNA序列的前提下對酵母、人類、果蠅的核小體定位進行預測，并且更多的更復雜的算法不斷出現(xiàn)。這種預測在統(tǒng)計學上行得通，但是與實驗檢測的核小體定位比起來，精確度會小很多。本發(fā)明以人宮頸癌細胞系HeLa S3為模型，采用染色質上DNA缺刻平移biotin摻入標記、磁珠沾取biotin DNA獲得核小體空缺區(qū)域文庫。結合高通量測序技術建立了全基因組水平上核小體空缺區(qū)域捕捉技木。為全基因組范圍內更精確的定位活性染色質核小體空缺區(qū)域的研究提供新的方法?？梢杂脕硌芯空婧思毎D錄調控的染色質區(qū)域，為基因組學研究提供了一個有效方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法。本發(fā)明中使用的細胞HeLa S3是本領域技術人員熟知的人宮頸癌細胞系。在優(yōu)選的實施方案中，使用的工具酶是脫氧核糖核酸酶I (DNase I),SI核酸酶(Slnuclease)處理細胞核。最優(yōu)選的方法是本發(fā)明中的采用中性甲醛固定細胞核，DNase I做缺刻，SI核酸酶切取缺刻DNA，缺刻DNA平移biotin摻入，磁珠沾取biotin-DNA構建文庫的方法，以及通過該方法構建的HeLa S3細胞活性染色質NFR文庫。本發(fā)明涉及高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法。它在基因組相關研究中有潛在的用途。
附圖
表說明圖INFR片段擴增文庫瓊脂糖凝膠電泳MrllOObp DNA ladderI、無DNase I酶切未慘入biotin-dATP的陰性對照2、無DNase I酶切的陰性對照3、未摻入biotin-dATP的陰性對照4、DNase I 酶切摻入 biotin-dATP 的 NFR 文庫圖2NFR文庫的特異性驗證電泳圖Mr IOObp DNA Ladder1-5無DNase I酶切的陰性對照1、N8引物2、N9引物3、SlO引物4、S115、S12引物6-10NFR文庫6、N8引物7、N9引物8、SlO引物9、Sll引物10、S12引物圖3Unique mapped reads在基因間區(qū)和基因上的分布特征圖4Unique mapped reads在基因上的覆蓋深度圖5NFR peaks在全基因組上的分布圖6NFR文庫與某些特定修飾位點或蛋白-DNA結合位點的富集測序結果相關性分析
具體實施例方式在本發(fā)明的具體實施方案中，以人HeLaS3細胞為模型，應用本發(fā)明的高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法，捕捉活性染色質構建NFR文庫，直接利用高通量全基因組深度測序技術捕捉染色質核小體空缺區(qū)域，分析其分布特征。為全基因組范圍內更精確的定位活性染色質轉錄調控區(qū)域的研究建立了新的方法。將HeLaS3細胞活性染色質經構建的NFR文庫，送華大基因公司，Illumina公司的Solexa基因組分析平臺(Genome Analyzer platform)進行高通量測序。通過高通量測序獲得HeLaS3細胞染色質全基因組15000個核小體空缺區(qū)域片段。通過對本發(fā)明方法獲得的15000個核小體空缺區(qū)在全基因組上分布進行的全面分析，證明本發(fā)明所采用的鏈置換缺刻平移標記摻入的方法，根據對已有的染色質構象的了解以及分子生物學酶學技術捕捉染色質上的核小體空缺區(qū)域，結合磁珠沾取來捕獲全基因組核小體空缺區(qū)域的方法特異性很局]。本發(fā)明所述高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法，包括裂解細胞，提取細胞核、中性甲醛固定細胞核，DNase I做缺刻、缺刻DNA平移biotin摻入、SI核酸酶切取缺刻DNA、苯酚/氯仿抽堤，こ醇沉淀、DNA片段末端加A，加接頭、磁珠沾取biotin-DNA、NFR文庫擴增等8個步驟。以下通過實施例來進ー步闡明本申請的內容。應當理解，實施例僅用于示例性說明申請的技術方案的具體實施方式
，而不是以任何方式限定本申請的范圍。實施例I
步驟一、裂解細胞，提取細胞核培養(yǎng)HeLa S3細胞生長達80%融合后換無血清培養(yǎng)基，血清饑餓24小時[15，16]后，棄培養(yǎng)液。用冰預冷的PBS洗細胞兩次，再加Iml PBS在冰上用細胞刮刮細胞，4°C，3000rpm離心10分鐘，收集細胞。用PBS緩沖液懸浮細胞，并對細胞進行計數(shù)。IO7/管分裝，再次離心收集細胞。加入細胞核分離緩沖液(IOmM Tris buffer, pH 7. 4, IOmM NaCl, 5mMMgCl2, ImM PMSF，O. 2% NP40)，輕柔混勻，使細胞終濃度為5 X 106/ml，冰浴10分鐘。4°C下3000rpm離心10分鐘，收集細胞核。用無NP40的緩沖液洗漆細胞核(IOmM Tris buffer,pH 7. 4, IOmM NaCl,5mM MgCl2, ImM PMSF)，洗去多余的 NP40，4°C下 3000rpm 離心 10 分鐘。步驟ニ、中性甲醛固定細胞核，DNaseI做缺刻I.加用PBS配制的甲醛固定液，甲醛終濃度為I %，輕柔混勻，室溫下交聯(lián)20分鐘固定細胞核。2.滅活甲醛加2. 5M的的甘氨酸至終濃度為O. 125M，以滅活甲醛。輕柔混勻，放置10分鐘后，4°C下3000rpm離心10分鐘；用NEB buffer2洗漆重懸。4°C下3000rpm離心10分鐘，棄上清。3. DNaseI在染色質上打切ロ配制O. 02U/ml的DNase I缺刻液，用NEBbuffer2為緩沖液，室溫下處理細胞核5分鐘后，加O. 5MEDTA至終濃度為20mM，用以滅活DNase I，4°C下3000rpm離心10分鐘，棄上清。步驟三、DNA缺刻平移biotin摻入
反應體系體積(μ )
10ΧΝΕΒ buffer250
IOmMdNTPMix12.5
Biotin-dATP12.5
DNA Polymerase I5 00U
Add ddH20 up to50037°C孵育60分鐘。加0. 5MEDTA至終濃度為20mM，用以滅活DNApolymerase IAV下3000rpm離心10分鐘,棄上清。步驟四、Slnuclease處理細胞核
Slnuclease處理細胞核，工作濃度為330U/ml，室溫孵育30分鐘。以切取缺刻DNA。
反應體系體積(μ )
10XS1 buffer20
Slnuclease200U
Add ddH2〇 up to20023°C孵育45分鐘，加8 μ I O. 5Μ EDTA終止反應。
步驟五、苯酚/氯仿抽提，こ醇沉淀DNA加入等體積酹，冰上放置IOmin, 12000rpm離心lOmin。取上清,加入等體積酹/氯仿(I : I),冰上放置lOmin, 12000rpm離心lOmin。再次取上清,加入1/10體積的3M NaAc和2. 5倍體積的無水こ醇，_20°C沉淀Ih以上，4°C 12000rpm離心20min，沉淀用70%こ醇洗一遍，室溫放置待こ醇揮發(fā)干凈后，加入15μ I無菌水溶解。步驟/K、DNA片段末纟而加Α，加接頭I. DNA片段末端加A
反應體系體積(μ )
DNA (こ醇沉淀后)15
IO X ligase buffer4
IOmMdNTP Mix2
缺失型klenow0.5
T4 DNA polymeraseI
T4 polynucleotide kinase IAdd ddH^O up to4037°C孵育60分鐘，65 °C孵育20分鐘后滅活。2.加接頭，用于DNA文庫擴增
反應體系體積(μ )
DNA (加 A 后)40
10Χ ligase buffer6
PEl 接頭(20ιιΜ/μ1)4
ΡΕ2 接頭(20ιιΜ/μ1)4
T41igase3
Add ddH20 up to6016 °C過夜孵育。步驟七、磁珠沾取biotin-DNA
I.清洗磁珠在連接的同一天，處理磁珠，吸取80 μ I磁珠，I XWB buffer (5mM Tris-HCl (pH7. 5)，O. 5mMEDTA, IM NaCl)，按200 μ I每管清洗，5分鐘洗一次，洗3次。用I % BSA封閉過夜。IXWB buffer洗2次，按200 μ I每管清洗，每次5分鐘，離心棄上清。600 μ I 2 XffBbuffer重懸浮磁珠。2.鏈霉素磁珠與biotin的DNA相互結合反應體系體積(μ I)磁珠100
DNA連接產物 10025°C孵育4小時。3.清洗磁珠，去掉沒有連接的混合物IXffB buffer,按200 μ I每管清洗，5分鐘洗一次，洗3次。磁鐵架把磁珠固定在EP管底，棄去上清。再用無菌ddH20，5分鐘洗一次共洗2次。4. DNA從磁珠上洗脫無菌ddH20 20 μ I懸浮磁珠，70°C孵育30分鐘，吸取上清。步驟八、NFR文庫擴增I. NFR 文庫 PCR 擴增
PCR反應體系體積(μ )
Template DNA2
IOXEx taq buffer5
dNTP4
PEl primer2
PE2 primer2
Ex taq DNA polymerase0.25
Add ddH^O up to5094 °C，3min 預變性；94 °C，30sec ；64 °C，30sec ；72 °C, 30sec ；30 次循環(huán)；72 °C，IOmin ;4°C。取10 μ I PCR產物，加6X上樣緩沖液，I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如(圖I)所示。2.所得DNA用I. 5%瓊脂糖膠電泳，應用IOObp Marker,加壓100V電泳約30min。跑完膠后，切割約150bp的膠置于I. 5ml EP管內。3.采用QAGEN公司的膠回收純化試劑盒回收DNA稱量膠重量，加入3倍體積QG結合液，55 °C，IOmin將膠融化；將試劑盒中的硅膠膜型離心純化管柱放入2 m I的收集管；將樣品分次轉移至離心管柱中，13，O O O X g離心Imin ;棄去離心得到的液體，再將柱子放回原收集管；在柱內加入750μ LPE buffer,13，OOOXg離心Imin洗滌柱子；棄去離心得到的液體,再將柱子放回原收集管，13，OOOXg離心2min，盡量除去殘余的こ醇；將離心管柱放入I. 5ml的干凈Eppendorf管中；在柱子中央加入 100 μ LH20,靜置 2min, 13，000 X g 離心 Imin 洗脫 DNA0
步驟九、NFR文庫的驗證選取五對引物對NFR文庫實驗操作進行可靠性驗證。選取隨機引物2對(N8，N9)
和具有DNase I高敏感區(qū)域的2對引物(S10，Sll)以及本實驗室篩選到的ー對egfr啟動
子區(qū)的DNase I高敏感區(qū)域的引物(S12)進行驗證。以不加接頭的樣品為對照。取10 μ I
PCR產物，加6Χ上樣緩沖液，I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如(圖2)所示。PCR引物及
接頭序列如表I所示。表IPCR引物及接頭序列
權利要求
1.高通量全基因組水平捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法。
2.權利要求I捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法，其中選擇DNaseI酶切細胞核內染色質，染色質DNA缺刻平移biotin摻入標記,磁珠沾取biotin DNA獲得核小體空缺區(qū)域進行文庫構建。
3.權利要求2的所述的細胞主要指真核細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及全細胞水平高效捕獲染色質核小體空缺區(qū)的新方法。所述新方法能在全基因組范圍內更精確、更敏感地定位染色質核小體空缺區(qū)。這種方法可以用來尋找真核細胞轉錄調控的染色質核小體空缺區(qū)，是功能基因組研究的有效手段。
文檔編號C12Q1/68GK102691111SQ20121008749
公開日2012年9月26日 申請日期2012年3月29日 優(yōu)先權日2012年3月29日
發(fā)明者周萍, 張玉祥, 李振華, 王雅梅 申請人:首都醫(yī)科大學