專利名稱：一種真菌腈水解酶及其基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種真菌腈水解酶及其基因序列，本發(fā)明涉及源自赤霉菌iGibberellaintermedia) CA3-1的一種真菌腈水解酶及其編碼的基因序列，屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腈水解酶是屬于腈代謝酶系中的一種，可以將3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、丙烯腈等腈類化合物水解轉(zhuǎn)化為煙酸、異煙酸、丙烯酸等有機(jī)酸；同時(shí)該酶可以用于處理毒性很強(qiáng)且難于降解的腈污染有毒廢水。腈水解酶作用底物的廣泛性使其在食品、制藥、飼料、環(huán)保等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，利用腈水解酶降解腈類化合物制備有機(jī)酸將成為化工生產(chǎn)中的一道重要工藝。煙酸是一種重要的醫(yī)藥中間體及飼料添加劑，也稱維生素B3或維生素PP，是人體必需的13種維生素之一。煙酸作為維生素類藥物，可用于防治糙皮病，亦可用作血擴(kuò)張藥；在飼料工業(yè)中，能大量用做食品飼料的添加劑，可提高禽畜的抗病能力，加快生長速度，提高飼料的利用率；作為醫(yī)藥中間體，用于異煙肼、尼可剎米及煙酸肌醇酯等的生產(chǎn)。煙酸的生產(chǎn)可采用化學(xué)合成法和生物催化法，目前在工業(yè)上，仍主要采用化學(xué)法來進(jìn)行煙酸的生產(chǎn)，如氨氧化法、氣相氧化法、電解氧化法和吡啶羥基化法等，所采用原料一般為3-甲基吡唆、2-甲基-5-乙基吡唆、3-氰基吡啶以及哇琳等。如俄羅斯科學(xué)院專利CN95191372. 7公開了以3-甲基吡啶為原料，在釩、鈦氧化物催化劑存在下，按氧3_甲基吡啶摩爾比15 40，水3_甲基吡啶摩爾比1(T70條件進(jìn)行一步氣相非均相催化氧化反應(yīng)，煙酸收率為82 86%，但該法反應(yīng)溫度250-290°C，對設(shè)備要求較高，能耗較大，而且收率偏低。昆明理工大學(xué)專利CN200810058492. 4公開了以吡啶為溶劑，二氧化硒為氧化劑，3-甲基吡啶為原料合成煙酸的方法，反應(yīng)溫度為100 150 °C，反應(yīng)選擇性在98. 5%以上，但產(chǎn)品收率僅40飛0%。從這些情況可以看出，化學(xué)合成法產(chǎn)率較低，產(chǎn)品副產(chǎn)物較多，需采用價(jià)格昂貴的催化劑，可再生性差，產(chǎn)品的后續(xù)分離純化困難，而且能耗偏高，污染較嚴(yán)重。因此，化學(xué)法應(yīng)用于煙酸制備仍存在諸多不足之處。相比而言，生物催化法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，催化劑易于制備，催化效率較高，選擇性強(qiáng)且成本較低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，為煙酸的大規(guī)模制備提供了一條行之有效的途徑。國外自上世紀(jì)80年代以來，采用微生物腈水解酶生物轉(zhuǎn)化腈類化合物制備有機(jī)酸開始備受關(guān)注，研究者從自然界篩選產(chǎn)腈水解酶的微生物(以細(xì)菌為主)，采用全細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行生物催化反應(yīng)制備有機(jī)酸。為了進(jìn)一步提高催化劑的穩(wěn)定性及催化效率，同時(shí)為深入了解腈水解酶的分子機(jī)理，對野生菌腈水解酶進(jìn)行了分離純化及生理生化性質(zhì)研究，鑒定了酶的編碼基因并進(jìn)行克隆表達(dá)，對腈水解酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。但是研究工作主要集中在細(xì)菌腈水解酶，對于真菌腈水解酶的研究則鮮有報(bào)道，僅有捷克科學(xué)院微生物所(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2009, 59: 243 - 247;BMC Biotechnology 2011, 11: 2)近年來開始開展了較為細(xì)致的研究工作，包括黑曲霉Aspergillus 和鐮刀菌solani中真菌腈水解酶的生物轉(zhuǎn)化,酶的分離純化及黑曲霉A腈水解酶基因的克隆表達(dá)等。國內(nèi)對腈水解酶的研究較少，只有少數(shù)幾所高校，包括華東理工大學(xué)、浙江工業(yè)大學(xué)開展了細(xì)菌腈水解酶的野生菌篩選，產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化和酶基因的克隆表達(dá)等工作，尚無工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)例。綜合目前國內(nèi)外的腈水解酶研究工作可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌腈水解酶的研究仍占主流，真菌腈水解酶作為一種新型的生物催化劑還有待進(jìn)一步開發(fā)。其主要原因是國內(nèi)外側(cè)重于開發(fā)各方面性質(zhì)研究已較為深入的細(xì)菌腈水解酶，對真菌腈水解酶的研究還未引起足夠重視；真菌中腈水解酶的編碼基因還沒有被大量闡明，無法通過基因重組技術(shù)等手段獲得大規(guī)模酶制品作為研究材料。從已有文獻(xiàn)資料來看，真菌腈水解酶具有比細(xì)菌腈水解酶催化效率高，選擇性強(qiáng)等技術(shù)優(yōu)勢，研究真菌腈水解酶具有非常重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種真菌腈水解酶Nit的氨基酸序列及其編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，提供包含本發(fā)明基因的質(zhì)粒及包含本表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，以及利用該宿主細(xì)胞(重組菌)生產(chǎn)真菌腈水解酶Nit的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是
所述的真菌腈水解酶基因的表達(dá)方法由赤霉菌{Gibberella in termedia) CA3_1(該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.4903)總RNA通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得其cDNA序列，以cDNA序列為模板擴(kuò)增目的編碼基因SEQID NO: 1，真菌腈水解酶基因以pET-28a(+)為質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Nit，以大腸桿菌疋 coli Rosetta-gami (DE3)為表達(dá)宿主,實(shí)現(xiàn)赤霉菌(( iM6 r(977a intermedia)CA3-1腈水解酶的高效表達(dá)。(I)赤霉菌{Gibberella intermedia) CA3-1 總 RNA 的提取
赤霉儀QGibberel la intermedia') CA3-1菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)基(葡萄糖10 g/L,酵母膏
7.5g/L, NaCl I. 16 g/L, KH2PO4 2. 72 g/L, FeSO4 0. 03 g/L,己內(nèi)酰胺 3. 39 g/L)中培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度30°C。經(jīng)真空抽濾收集菌體用無菌水洗滌2-3次，將濕菌體置于玻璃勻衆(zhòng)器中，加入I mL Trizol試劑,低溫勻衆(zhòng)2 min ;勻衆(zhòng)液轉(zhuǎn)移至I. 5 mL離心管中,加入
0.2 mL氯仿,劇烈震蕩30 s,室溫放置3 min, 12, 000 rpm 4 °C離心10 min ;吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入1/2倍無水乙醇(v/v)，混勻；用移液器將混合液轉(zhuǎn)至吸附柱中，室溫下靜置2 min, 12, 000 rpm離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入500 ML RPE溶液，靜置2 1^11，于10，000 rpm離心30 S，倒掉收集管中廢液；重復(fù)該步驟一次；將吸附柱放回收集管中，10，000 rpm離心2 min ;將吸附柱置于干凈的
1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入30-50 ML DEPC處理水，靜置5 min, 12, 000 rpm離心2 min，將所得到的RNA溶液用于后續(xù)試驗(yàn)。 (2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA序列
以總RNA為模板,使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一條鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按如下條件進(jìn)行42飛0 °C保溫15 30 min, 99 1下5 min滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，然后于5 V保存5 min。在反轉(zhuǎn)錄管中加入位Tag HS酶及相關(guān)試劑合成cDNA第二條鏈，并進(jìn)一步PCR擴(kuò)增cDNA序列，以核苷酸序列am (ATGTCCAAGWCYCTCAARGT)作為上游引物，M13 Primer M4通用引物為下游序列。PCR反應(yīng)在50 U L體系中進(jìn)行,反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性2 min后開始循環(huán)；94 °C變性30 s，53°C退火30 s，72 °C延伸I min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C終延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收。(3)真菌腈水解酶編碼基因的克隆
以赤霉菌{Gibberella intermedia) CA3-1的c DNA序列為模板，以下核苷酸序列作為引物，PCR擴(kuò)增真菌腈水解酶的編碼基因。引物PI : 5，-CCGGAATTCATGTCCAAGACTCTCAAAGTCG-3，。引物P2 : 5，-CCCAAGCTTTCACAGGTCGTTGGCAAAG-3，。PCR反應(yīng)在50 UL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性2 min后開始循環(huán)；94 °C變性30 s，61 °C退火30 s，72 °C延伸I min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C終延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，與pMD-19 T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌疋coliJM109，在含氨芐抗性(100 mg/L)的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子接入LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12 16 h，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pMD19T-Nit，對該質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。(4)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
本研究所采用的表達(dá)質(zhì)粒是pET-28a(+)，帶有17啟動(dòng)子和His_tag標(biāo)記，將質(zhì)粒pET-28a(+)和真菌腈水解酶基因分別進(jìn)行雙酶切后割膠回收，用T4連接酶在16 °C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌疋coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素抗性(10 mg/L)的LB平板培養(yǎng)過夜，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pET28a(+)-Nit。(5)重組菌的篩選
將重組質(zhì)粒pET28a⑴-Nit在42 °C熱擊90 s轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌疋coliRosetta-gami (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,在含卡那霉素(10 mg/L)和氯霉素(35 mg/L)抗性的LB平板培養(yǎng)過夜，篩選陽性轉(zhuǎn)化子萬.coli Rosetta-gami (DE3) /pET28a(+) -Nit，接入LB液體培養(yǎng)基中37 °〇培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6-0. 8，添加終濃度0.5 mM的IPTG (異丙基硫代-P-D-半乳糖苷)在25 1下進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo)4 24 h，重組菌株表現(xiàn)出腈水解酶活性。(6)重組真菌腈水解酶Nit的分離純化與酶學(xué)特征
將上述獲得的重組真菌腈水解酶Nit的發(fā)酵液于4 °C,8000 rpm離心10 min，去除上清。離心收集的細(xì)胞懸浮于緩沖液A (50 mM磷酸鈉、500 mM氯化鈉，pH7.4)中，制備成菌懸液。菌懸液在冰浴中用超聲破碎儀破碎，200 W功率下工作300次，每個(gè)循環(huán)工作3 s停7 S。樣品在稀釋一定倍數(shù)后用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，在顯微鏡進(jìn)行觀察，直到顯示完全裂解為止。細(xì)胞裂解液4 1下14，000 rpm離心30 min，所得上清液即為無細(xì)胞抽提液。取無細(xì)胞抽提液用0. 22 um濾膜過濾制備成上樣樣品，將Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱用緩沖液A沖洗至平衡，沖柱流速2 mL/min，而后對樣品進(jìn)行上柱，上柱流速I mL/min，待完全吸附后，分別用含緩沖液k 含400 mM咪唑的緩沖液A梯度洗脫，洗脫流速2 mL/min,洗脫過程實(shí)時(shí)監(jiān)控，檢測波長為280 nm，分別收集各階段洗脫峰，通過SDS-PAGE分析純化后的真菌腈水解酶的分子量大小和純度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果
本發(fā)明提供了一種真菌腈水解酶基因Nit及其高效表達(dá)方法。本發(fā)明所涉及的真菌腈水解酶Nit的編碼基因?yàn)槟壳皣鴥?nèi)真菌腈水解酶基因的首例報(bào)道。提取赤霉菌{Gibberella intermedia) CA3-1菌株的總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得其cDNA序列，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增cDNA編碼基因，它具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列，全長963個(gè)核苷酸，編碼320個(gè)氨基酸。以pET_28a(+)為表達(dá)質(zhì)粒，以大腸桿菌萬.coli Rosetta-gami (DE3)為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了赤霉菌{GibberellaCA3-1腈水解酶基因的高效表達(dá),重
組菌株萬.coli Rosetta-gami (DE3) /pET28a (+) -Nit表現(xiàn)出腈水解酶活性，能有效地將底物3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化為煙酸。該真菌腈水解酶Nit的最適反應(yīng)溫度為45 V，最適反應(yīng)pH為
7.8，此外，重組酶發(fā)酵周期短，催化效率高，適合于工業(yè)生產(chǎn)煙酸的需要。


圖I是重組真菌腈水解酶Nit分離純化過程的SDS-PAGE圖譜
M :標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；泳道I為無細(xì)胞抽提液；泳道2為純化后的真菌腈水解酶。圖2為真菌腈水解酶Nit的最適反應(yīng)溫度(以3-氰基吡啶為底物反應(yīng))。圖3為真菌腈水解酶Nit的最適反應(yīng)pH (以3-氰基吡啶為底物反應(yīng))
PH4-5. 8為檸檬酸鈉緩沖液，pH5. 8-8. 5為磷酸鈉緩沖液，pH8. 5-10為甘氨酸-NaOH緩沖液。圖4為金屬離子對真菌腈水解酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響(以3-氰基吡啶為底物反應(yīng))。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
本實(shí)施例說明赤霉菌{Gibberella intermedia) CA3-1總RNA的提取。赤霉麗{Gibberella intermedia) CA3-1菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)基(葡萄糖10 g/L,酵母膏 7.5 g/L, NaCl I. 16 g/L, KH2PO4 2. 72 g/L, FeSO4 0. 03 g/L,己內(nèi)酰胺 3. 39 g/L)中培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度30°C。經(jīng)真空抽濾收集菌體用無菌水洗滌2-3次，將濕菌體置于玻璃勻漿器中，加入I mL Trizol試劑，低溫勻漿2 min ;勻漿液轉(zhuǎn)移至I. 5 mL離心管中，加入0. 2 mL氯仿,劇烈震蕩30 s,室溫放置3 min, 12, 000 rpm 4 °C離心10 min ;吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入1/2倍無水乙醇(v/v)，混勻；用移液器將混合液轉(zhuǎn)至吸附柱中，室溫下靜置2 min, 12, 000 rpm離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入500 ML RPE溶液，靜置2 1^11，于10，000 rpm離心30 S，倒掉收集管中廢液；重復(fù)該步驟一次；將吸附柱放回收集管中，10，000 rpm離心2 min ;將吸附柱置于干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30-50 ML DEPC處理水，靜置5 min, 12, 000 rpm離心2 min，將所得到的RNA溶液用于后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)施例2
本實(shí)施例說明反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA序列的流程。以總RNA為模板,使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一條鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按如下條件進(jìn)行42飛0 °C保溫15 30 min, 99 1下5 min滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，然后于5。。保存 5 min。在反轉(zhuǎn)錄管中加入位Tag HS酶及相關(guān)試劑合成cDNA第二條鏈，并進(jìn)一步PCR擴(kuò)增cDNA序列，以核苷酸序列am (ATGTCCAAGWCYCTCAARGT)作為上游引物，M13 Primer M4通用引物為下游序列。PCR反應(yīng)在50 U L體系中進(jìn)行,反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性2 min后開始循環(huán)；94 °C變性30 s，53°C退火30 s，72 °C延伸I min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C終延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收。實(shí)施例3
本實(shí)施例說明真菌腈水解酶編碼基因的克隆方法。以赤霉菌intermedia) CA3-1的cDNA序列為模板，以下核昔酸序列作為引物，PCR擴(kuò)增真菌腈水解酶的編碼基因。引物PI : 5，-CCGGAATTCATGTCCAAGACTCTCAAAGTCG-3，
引物 P2 : 5，-CCCAAGCTTTCACAGGTCGTTGGCAAAG-3’
PCR反應(yīng)在50 UL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性2 min后開始循環(huán)；94 V變性30 s，61 °C退火30 s，72 °C延伸I min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C終延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，與pMD-19 T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌瓦coli JM109，在含氨芐抗性(100 mg/L)的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子接入LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12 16 h，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pMD19T-Nit，對該質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。實(shí)施例4
本實(shí)施例說明重組質(zhì)粒的構(gòu)建程序。本研究所采用的表達(dá)質(zhì)粒是pET_28a(+),帶有17啟動(dòng)子和His-tag標(biāo)記,將質(zhì)粒pET-28a(+)和真菌腈水解酶基因分別進(jìn)行雙酶切后割膠回收，用T4連接酶在16 °C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌疋coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素抗性(10 mg/L)的LB平板培養(yǎng)過夜，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pET28a(+)-Nit。實(shí)施例5
本實(shí)施例說明轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞及重組菌的篩選方法。將重組質(zhì)粒pET28a(+)_Nit在42 °C熱擊90 s轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌疋coliRosetta-gami (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,在含卡那霉素(10 mg/L)和氯霉素(35 mg/L)抗性的LB平板培養(yǎng)過夜，篩選陽性轉(zhuǎn)化子萬.coli Rosetta-gami (DE3) /pET28a(+) -Nit，接入LB液體培養(yǎng)基中37 °〇培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6-0. 8，添加終濃度0. 5 m的IPTG (異丙基硫代-P -D-半乳糖苷)在25 1下進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo)20 h，重組菌株表現(xiàn)出腈水解酶活性。實(shí)施例6
本實(shí)施例說明重組真菌腈水解酶Ni t的分離純化與酶學(xué)特征。將重組真菌腈水解酶Nit的發(fā)酵液于4 °C,8000 rpm離心10 min，去除上清。離心收集的細(xì)胞懸浮于緩沖液A(50 mM磷酸鈉、500 mM氯化鈉，pH7. 4)中，制備成菌懸液。菌懸液在冰浴中用超聲破碎儀破碎，200 W功率下工作300次，每個(gè)循環(huán)工作3 s停7 S。樣品在稀釋一定倍數(shù)后用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，在顯微鏡進(jìn)行觀察，直到顯示完全裂解為止。細(xì)胞裂解液4 1下14，000 rpm離心30 min，所得上清液即為無細(xì)胞抽提液。取無細(xì)胞抽提液用0. 22 um濾膜過濾制備成上樣樣品，將Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱用緩沖液A沖洗至平衡，沖.柱流速2 mL/min，而后對樣品進(jìn)行上柱，上柱流速I mL/min，待完全吸附后，分別用含緩沖液k 含400 mM咪唑的緩沖液A梯度洗脫，洗脫流速2 mL/min,洗脫過程實(shí)時(shí)監(jiān)控，檢測波長為280 nm，分別收集各階段洗脫峰，通過SDS-PAGE分析純化后的真菌腈水解酶的分子量大小和純度。結(jié)果表明純化后的真菌腈水解酶達(dá)到電泳純，表觀分子量大小為36000道爾頓。純化過程電泳圖見圖I。將重組酶進(jìn)行3-氰基吡啶的生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組酶可有效轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶為煙酸，結(jié)果表明真菌腈水解酶已實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。以3-氰基吡啶為底物時(shí)，真菌腈水解酶Nit的最適反應(yīng)溫度為45 0C (圖2)，最適反應(yīng)pH為7. 8 (圖3)，金屬離子Fe3+，Mg2+，Mn2+對酶活有一定的促進(jìn)作用，Ag+則能完全抑制該真菌腈水解酶活性(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種編碼真菌腈水解酶Nit的基因，其特征為核苷酸序列如下所示IATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG61GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA121ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA GCATCTGGGC CAACTCGCCT181ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT CATTGGAGAG AGAGTCACCT241GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG TCTTTGTAGT CCTTGGATAT301AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT TCATCGATGA GACCGGCACT361ATTGTTCTCC ACCGCCGCAA GATCAAGCCC ACCCATGTTG AGCGTGCTAT CTACGGTGAC421GGACAGGGCG AGTCTCTGAC CAATGTCGCC GACACGAAAT TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT481AACTGCTGGG AGCACACCCA GACACTTCTC CGCTACTATG AATACTCCCA GGATGTCGAT541ATCCACGTCT CCAGCTGGCC TTCCATCTTC CCCCAGAACG TCCCTGAGTG GCCATACCAT601ATCACTCCCG AATGCTGCAA GGCCTTTTCT CACGTCGTCT CCATGGAGGG AGCCTGCTTC661GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT CATGACTGAG GAGAACCATA AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC721TACGACTATA CTAAGAAGTC TGGTGGCGGC TTCAGTATGA TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG781GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC TCCTAACGAG GAGGGTATTC TTTACGCTGA TATCAACCTT841GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG GACATTGTCG GCCACTACTC GCGACCCGAC901CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA CAAACATGCT GCCAAGCCTG TCTTCTTTGC CAACGACCTG 961TGA。
2.一種真菌腈水解酶Nit，其氨基酸序列如下所示IMETSerLysThrLeuLysValAlaAlalIeGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln21GlyGlyValAsnLysSerIIeGlyLeuIIeGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal41IleGlyPheProGluValPhelleProGlyTyrProTrpSerlIeTrpAlaAsnSerPro61ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro81GluMETAspGlnlleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr101SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIIeAlaGlnSerPheIIeAspGluThrGlyThr121IIeValLeuHisArgArgLysIIeLysProThrHisValGluArgAlalIeTyrGlyAsp141GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu161AsnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp181IIeHisValSerSerTrpProSerIIePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis201IIeThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe221ValLeuLeuAlaSerGlnIIeMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly241TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu261GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIIeLeuTyrAlaAspIIeAsnLeu281GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIIeValGlyHisTyrSerArgProAsp301GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeuo
3.一種用于編碼真菌腈水解酶Nit的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于含有權(quán)利要求I的核苷酸序列，載體為pET28a(+)-Nit。
4.一種用于生產(chǎn)真菌腈水解酶Nit的重組菌株，其特征在于含有權(quán)利要求3中的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌萬.coli Rosetta-gami (DE3)。
5.一種生產(chǎn)真菌腈水解酶并用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸的方法，其特征在于將權(quán)利要求4所述的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、產(chǎn)酶誘導(dǎo)，編碼真菌腈水解酶Nit的基因序列得以表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生真菌腈水解酶Nit ；以3-氰基吡啶為底物時(shí)，真菌腈水解酶Nit的最適反應(yīng)溫度為.45 °C，最適反應(yīng)pH為7.8。
全文摘要
一種真菌腈水解酶Nit及其基因序列，該真菌腈水解酶Nit基因全長963個(gè)核苷酸，編碼320個(gè)氨基酸；以pET-28a(+)為表達(dá)質(zhì)粒，以大腸桿菌E.coliRosetta-gami(DE3)為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了真菌腈水解酶基因的高效表達(dá)，重組菌株大腸桿菌E.coliRosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit具有腈水解酶活性，能有效地將底物3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化為煙酸。該真菌腈水解酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為7.8，重組酶發(fā)酵周期短，催化效率高，適合于工業(yè)生產(chǎn)煙酸的需要。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102618563SQ20121008980
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者史勁松, 李恒, 許正宏, 錢建瑛, 陸震鳴, 龔勁松 申請人:江南大學(xué)