專利名稱：用BsrFI鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定單核苷酸多態(tài)性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法。
背景技術(shù)：
SNP(單核苷酸多態(tài)性)是指單個(gè)核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式。SNP現(xiàn)已廣泛用于簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導(dǎo)易感基因克隆。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)(PCR-RFLP)技術(shù)是一種快速、簡便、準(zhǔn)確、低成本檢測SNP基因型的經(jīng)典方法。該方法原理是限制性內(nèi)切酶是一類識別DNA特異位點(diǎn)(通常4 6bp)，并在特異位點(diǎn)進(jìn)行切割的酶類。酶切位點(diǎn)的特異性意味著對特定DNA等位基因的完全消化會產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的替換或插入、缺失可以產(chǎn)生或消除一個(gè)特定酶切位點(diǎn)，從而改變酶切割后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，則可以通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳加以檢測。該方法主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，快速，終點(diǎn)判斷準(zhǔn)確。主要缺點(diǎn)在于酶切位點(diǎn)的選擇，并不是所有的SNP位點(diǎn)都可以使用該方法來鑒別，且部分內(nèi)切酶價(jià)格昂貴。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是一種重要的葉酸代謝酶，體內(nèi)催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為體內(nèi)最主要的甲基供體5-甲基四氫葉酸，具有重要的生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的基因缺陷與動脈硬化性血管阻塞性疾病密切相關(guān)，還是胎兒神經(jīng)管畸形及癌癥發(fā)生的遺傳因素。人MTHFR基因定位于染色體1P36. 3，該基因第十二外顯子A/G堿基變異可引起第594位氨基酸變異(Gln/Arg)，文獻(xiàn)中常記為1793A/G多態(tài)，該多態(tài)可能影響MTHFR的功能。美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)可查閱MTHFR基因及其多態(tài)序列和相關(guān)信息，該多態(tài)在SNP數(shù)據(jù)庫中編號為rs2274976。因此，通常該多態(tài)在人群中存在三種MTHFR基因的基因型GG型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為G) ,AG型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別為G和A)和AA型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為A)。目前人MTHFR基因多態(tài)rs2274976的鑒定常采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人MTHFR基因多態(tài)rs2274976時(shí)常使用內(nèi)切酶BsrBI進(jìn)行鑒定，該內(nèi)切酶的價(jià)格昂貴(關(guān)于部分內(nèi)切酶的參考價(jià)格可以參考后面的表I)，影響了實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用，難以在實(shí)驗(yàn)室中普及使用。并且由于傳統(tǒng)PCR-RFLP方法的固有缺陷，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常難以選擇其他限制性內(nèi)切酶對人MTHFR基因多態(tài)rs2274976進(jìn)行鑒定。因此，本領(lǐng)域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP的方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種操作簡單，成本低，使用范圍廣的鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法，其包括以下步驟a)提供待測人基因組DNA ；b)使用擴(kuò)增人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲得酶切產(chǎn)物；以及d)對所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976，其中，所述 正向引物其3’末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs2274976堿基相鄰，倒數(shù)第二位堿基為錯(cuò)配堿基C，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成CCGG (第一個(gè)堿基C為錯(cuò)配堿基，第三個(gè)堿基G為多態(tài)等位基因)或ACCGGT (第二個(gè)堿基C為錯(cuò)配堿基，第四個(gè)堿基G為多態(tài)等位基因)結(jié)構(gòu)，或者與多態(tài)A等位基因形成CCAGT (第一個(gè)堿基C為錯(cuò)配堿基，第三個(gè)堿基A為多態(tài)等位基因)結(jié)構(gòu)。通過本發(fā)明的方法可以通過引物上的錯(cuò)配堿基將SNP附近的序列改變?yōu)榭杀活A(yù)先確定的限制性內(nèi)切酶識別的序列，因此，可以克服現(xiàn)有PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂貴內(nèi)切酶的缺陷，進(jìn)而大大降低了檢測SNP的成本。具體而言，由于在該正向引物序列中倒數(shù)第二位堿基C為錯(cuò)配堿基(該堿基在人MTHFR基因序列中的相應(yīng)位置為G)，因此，錯(cuò)配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由AGCGGT或AGCAGT更改為ACCGGT或ACCAGT (其中第二個(gè)堿基為錯(cuò)配堿基，第四個(gè)堿基為A/G多態(tài)位點(diǎn))，因此擴(kuò)增產(chǎn)物中G等位基因片段可被識別CCGG序列的限制性內(nèi)切酶或者識別ACCGGT序列的限制性內(nèi)切酶識別(即G等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。同樣錯(cuò)配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由GCGGT或GCAGT更改為CCAGT或CCGGT (其中第一個(gè)堿基為錯(cuò)配堿基，第四個(gè)堿基為A/G多態(tài)位點(diǎn))，因此擴(kuò)增產(chǎn)物中A等位基因片段可被識別CCAGT序列的限制性內(nèi)切酶識別(即A等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。進(jìn)而，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型。更具體地，經(jīng)序列分析可知，基因原始序列中A/G多態(tài)可由表I中前四種內(nèi)切酶識別。如通過堿基錯(cuò)配PCR將多態(tài)位點(diǎn)前面第二位堿基G替換為C，則該多態(tài)為G等位基因時(shí)經(jīng)PCR擴(kuò)增后含CCGG序列可被識別CCGG序列的內(nèi)切酶識別(如MspI、HpaII)，含有ACCGGT序列可被識別ACCGGT序列的內(nèi)切酶識別(如BsrFI、BsaWI、AgeI)。同樣可被上述內(nèi)切酶的同裂酶(isoschizomer,來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶)識別并切開，而A等位基因不能切開。通過堿基錯(cuò)配PCR將多態(tài)位點(diǎn)前面第二位堿基G替換為C，則當(dāng)該多態(tài)為A等位基因時(shí)該多態(tài)經(jīng)PCR擴(kuò)增后含CCAGT序列可被識別ACTGG序列(互補(bǔ)序列為CCAGT)的內(nèi)切酶識別(如BsrI)。同樣可被BsrI的同裂酶識別并切開，而G等位基因不能切開。下表I中提供了 NEB公司內(nèi)切酶價(jià)格信息(從111^口://\￥￥￥.11613-(311；[1^.(301]1獲取)作為限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和價(jià)格的參考。表I NEB公司幾種內(nèi)切酶識別序列及其價(jià)格內(nèi)切酶識別序列價(jià)格
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒，包含擴(kuò)增人MTHFR基因多 態(tài)性rs2274976位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒 數(shù)第一位堿基與rs2274976多態(tài)堿基相鄰，倒數(shù)第二位為錯(cuò)配堿基C，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物中與 多態(tài)G等位基因形成ACCGGT結(jié)構(gòu)，所述的正向引物為SEQ ID N0:1或者SEQ N0:11，反向 引物為SEQ ID NO :2、SEQ IDN0 7或SEQ NO 12 ;所述的試劑盒還包括選自BsrFI、BsaWI、 Agel的限制性內(nèi)切酶；并且所述試劑盒還包括用于實(shí)施鑒定的說明書。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中限制性內(nèi)切酶為BsrFI。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID N0:1，反向引物為SEQ ID NO :2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID N0:1，反向引物為SEQID NO :7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID NO :11，反向引物為SEQ ID NO :12。
全文摘要
用BsrFI鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒，包含擴(kuò)增人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒數(shù)第一位堿基與rs2274976多態(tài)堿基相鄰，倒數(shù)第二位為錯(cuò)配堿基C，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成ACCGGT結(jié)構(gòu)，所述的正向引物為SEQ ID NO1或者SEQ NO11，反向引物為SEQ ID NO2、SEQ ID NO7或SEQ NO12；所述的試劑盒還包括選自BsrFI、BsaWI、AgeI的限制性內(nèi)切酶；并且所述試劑盒還包括用于實(shí)施鑒定的說明書。該試劑盒操作簡單，成本低，使用范圍廣。
文檔編號C12Q1/68GK102660639SQ201210091430
公開日2012年9月12日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者姚武, 楊永利, 王威 申請人:鄭州大學(xué)