專利名稱：具有cmv啟動子的可表達(dá)egfp的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的發(fā)展及應(yīng)用，桿狀病毒已被開發(fā)成為高效的真核表達(dá)載體系統(tǒng)，用于各種外源基因的表達(dá)，并作為一種新型的疫苗、基因治療載體受到人們的高度重視。目前篩選重組桿狀病毒的方法有很多，諸如酵母-昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌-昆蟲細(xì)胞的穿梭載體的開發(fā)、桿狀病毒DNA線性化和體外定點酶促重組等。但是這些方法的重組效率較低、重組病毒篩選的周期較長、很難同時分離多個重組桿狀病毒、基因表達(dá)的效率也很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、用限制性內(nèi)切酶Nru I和BstZ17I對質(zhì)粒pcDNA3. I (-)進(jìn)行雙酶切；二、用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Hpa I對質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行雙酶切；三、將雙酶切后的質(zhì)粒pcDNA3. I (-)和質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行平末端連接，連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-pcDNA3. 1(-)；四、以pEGFP-C3為模板，pEGFP_u和pEGFP_d為弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后于T-Vector進(jìn)行連接，獲得pMD-EGFP ；五、用KpnI 和 Xho I 對重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBacl_pcDNA3. I (-)和 pMD-EGFP 分別進(jìn)行雙酶切，分別回收pFaStBacl-pcDNA3. I㈠重組轉(zhuǎn)移載體和EGFP基因的目的條帶，并分別進(jìn)行純化，然后純化產(chǎn)物pFastBacl-pcDNA3. I (-)與純化產(chǎn)物EGFP進(jìn)行連接，獲得pFastBacl-pcDNA3. 1(-)-EGFP ；六、pFastBacl-pcDNA3. I (-) -EGFP轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞并篩選白色單菌落，然后提取重組Bacmid DNA，然后以IOOng重組Bacmid DNA為模板，以pEGFP-u和pEGFP-d為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將含有EGFP基因的重組Bacmid命名重組Bacmid-EGFP ；七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將重組Bacmid-EGFP轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒CN-EGFP,即完成具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建；其中步驟四和步驟六中引物pEGFP-u序列均為5' -CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';引物 pEGFP-d 序列均為 5' -AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3;。本發(fā)明首次利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在OL細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)外源基因，拓寬了桿狀病毒可轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動物細(xì)胞范圍。而且，本發(fā)明利用CellProfiler 軟件對重組 桿狀病毒介導(dǎo)的EGFP在OL細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)字圖像進(jìn)行數(shù)量分析，確定出重組桿狀病毒對OL細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)條件與外源基因的最佳表達(dá)條件40M0I重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞并添加IOmM 丁酸鈉，轉(zhuǎn)導(dǎo)時間為12h，培養(yǎng)時間為72h，表達(dá)效率最高達(dá)95. 25%。因此，本發(fā)明為EGFP在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)量分析提供一種全新、科學(xué)和準(zhǔn)確的方法，填補(bǔ)了國內(nèi)外該領(lǐng)域的空白。


圖I為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)時間及培養(yǎng)時間對EGFP表達(dá)效率的影響的圖，其中▲表不72h, ■表不48h, 表不24h ；圖2為具體實施方式
一中轉(zhuǎn)導(dǎo)時間及培養(yǎng)時間對EGFP平均表達(dá)強(qiáng)度的影響的圖； 圖3為具體實施方式
一中轉(zhuǎn)導(dǎo)時間及培養(yǎng)時間對EGFP最高表達(dá)強(qiáng)度的影響的圖；圖4為具體實施方式
一中感染復(fù)數(shù)及培養(yǎng)時間對EGFP表達(dá)效率的影響的圖，其中▲表示72h, ■表示48h, 表示24h ；圖5為具體實施方式
一中感染復(fù)數(shù)及培養(yǎng)時間對EGFP平均表達(dá)強(qiáng)度的影響的圖；圖6為具體實施方式
一中感染復(fù)數(shù)及培養(yǎng)時間對EGFP最高表達(dá)強(qiáng)度的影響的圖；圖7為具體實施方式
一中丁酸鈉濃度及培養(yǎng)時間對EGFP表達(dá)效率的影響的圖，其中▲表示72h, ■表示48h, 表示24h ；圖8為具體實施方式
一中丁酸鈉濃度及培養(yǎng)時間對EGFP平均表達(dá)強(qiáng)度的影響的圖；圖9為具體實施方式
一中丁酸鈉濃度及培養(yǎng)時間對EGFP最高表達(dá)強(qiáng)度的影響的圖；圖10為具體實施方式
一中EGFP陽性細(xì)胞及陰性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度的分布圖；圖11為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP侵染OL細(xì)胞12小時后EGFP的表達(dá)情況圖；圖12為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP侵染OL細(xì)胞24小時后EGFP的表達(dá)情況圖；圖13為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP侵染OL細(xì)胞48小時后EGFP的表達(dá)情況圖；圖14為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP侵染OL細(xì)胞72小時后EGFP的表達(dá)情況圖；圖15為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP侵染OL細(xì)胞96小時后EGFP的表達(dá)情況圖；圖16為具體實施方式
一中重組桿狀病毒CN-EGFP侵染OL細(xì)胞添加ImM 丁酸鈉培養(yǎng)48小時后EGFP的表達(dá)情況圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、用限制性內(nèi)切酶Nru I和BstZ17I對質(zhì)粒pcDNA3. I (-)進(jìn)行雙酶切；二、用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Hpa I對質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行雙酶切；三、將雙酶切后的質(zhì)粒pcDNA3. I (-)和質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行平末端連接，連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-pcDNA3. 1(-)；四、以pEGFP-C3為模板，pEGFP_u和pEGFP_d為弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后于T-Vector進(jìn)行連接，獲得pMD-EGFP ；五、用Kpn I 和 Xho I 對重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBacl_pcDNA3. I (-)和 pMD-EGFP 分別進(jìn)行雙酶切，分別回收pFaStBacl-pcDNA3. I㈠重組轉(zhuǎn)移載體和EGFP基因的目的條帶，并分別進(jìn)行純化，然后純化產(chǎn)物pFastBacl-pcDNA3. I (-)與純化產(chǎn)物EGFP進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后獲得 pFastBacl-pcDNA3. I (-) -EGFP ；六、pFastBacl-pcDNA3. I (-) -EGFP轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞并篩選白色單菌落，然后提取重組Bacmid DNA，然后以IOOng重組Bacmid DNA為模板，以pEGFP-u和pEGFP-d為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將含有EGFP基因的重組Bacmid命名重組Bacmid-EGFP ；七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將重組Bacmid-EGFP轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒CN-EGFP,即完成具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建；其中步驟四和步驟六中引物pEGFP-u序列均為5' -CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';引物 pEGFP-d 序列均為 5' -AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3;。本實施方式步驟三中連接產(chǎn)物的鑒定將DH5 α感受態(tài)細(xì)胞從_70°C取出，在冰上融化后加入2μ I連接產(chǎn)物，冰中放置30min，42°C熱休克90s，冰浴2_3min，加入37°C預(yù)熱的S. O. C培養(yǎng)基900 μ 1，37°C振蕩培養(yǎng)Ih (160-200rpm)，然后4000rpm離心3min,棄上清，保留200 μ l培養(yǎng)基，將沉淀重新混勻后，涂布于LB瓊脂平板上(含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml氨芐青霉素)，37 °C培養(yǎng)過夜。采用堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA :隨機(jī)挑取生長于LB瓊脂平板上的數(shù)個白色菌落分別接種于含100 μ g/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取I. 5ml培養(yǎng)液于離心管中，13000r/min室溫離心Imin,棄上清,將沉淀重懸于100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris-HCI，IOmM EDTA，pH8. O)中，振蕩，加入 200 μ I 新配制的溶液 II (O. 2MNa0H,1% SDS)，混勻后置冰浴5min，然后加入150 μ I溶液III (5Μ乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml配制而成),混勻，冰浴IOmin后于13000r/min室溫離心IOmin0取上清,加等體積室溫酚/異戊醇(25/1)溶液，抽提一次。取上清，加等體積室溫氯仿/異戊醇(24/1)溶液，抽提一次。取上清，加等體積預(yù)冷異丙醇，混勻后冰浴IOmin ;13000r/min，室溫離心IOmin,棄去上清液，沉淀用預(yù)冷75%乙醇洗滌一次，室溫干燥，使乙醇揮發(fā)。沉淀溶于25 μ LddH20中，加入IyL RNaseA酶后混勻，37°C水浴30min。用限制性內(nèi)切酶EcoR I對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切以鑒定提取的質(zhì)粒。本實施方式步驟四中引物pEGFP-u和pEGFP_d，如表1所示
權(quán)利要求
1.具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行 一、用限制性內(nèi)切酶NruI和BstZ17I對質(zhì)粒pcDNA3. I㈠進(jìn)行雙酶切； 二、用限制性內(nèi)切酶SnaBI和Hpa I對質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行雙酶切； 三、將雙酶切后的質(zhì)粒pcDNA3.1(_)和質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行平末端連接，連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-pcDNA3. 1(-)； 四、以pEGFP-C3為模板，pEGFP-u和pEGFP-d為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后于T-Vector進(jìn)行連接，獲得pMD-EGFP ； 五、用KpnI和Xho I對重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-pcDNA3. I (-)和pMD-EGFP分別進(jìn)行雙酶切，分別回收pFaStBacl-pcDNA3. 1(_)重組轉(zhuǎn)移載體和EGFP基因的目的條帶，并分別進(jìn)行純化，然后純化產(chǎn)物pFastBacl-pcDNA3. I (-)與純化產(chǎn)物EGFP進(jìn)行連接，獲得pFastBacl-pcDNA3. 1(-)-EGFP ； 六、pFastBacl-pcDNA3.I (-) -EGFP轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞并篩選白色單菌落，然后提取重組Bacmid DNA，然后以IOOng重組Bacmid DNA為模板，以pEGFP-u和pEGFP-d為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將含有EGFP基因的重組Bacmid命名重組Bacmid-EGFP ； 七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將重組Bacmid-EGFP轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒CN-EGFP,即完成具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建； 其中步驟四和步驟六中引物pEGFP-u序列均為5' -CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3/ ;引物 pEGFP-d 序列均為 5' -AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3;。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中用限制性內(nèi)切酶Nru I和BstZ17I對質(zhì)粒pcDNA3. I (-)進(jìn)行雙酶切的體系如下 成分用量質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)ΙΟμN(yùn)ru I2.5μ BstZll I2.5μ NEBuffer 35μL 無菌水30μ 酶切反應(yīng)條件為37°C水浴2h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Hpa I對質(zhì)粒pFastBacl進(jìn)行雙酶切的步驟如下先用SnaB I單酶切，酶切體系如下成分體積質(zhì)粒 pFastBacl10|iL SnaB I2.5μιNEBuffer 4+BSA5μL 無菌水32.5pL、 37°C水浴作用2h，酶切結(jié)束后加入5 μ L醋酸鈉溶液3mol/L和50 μ L異丙醇沉淀DNA，再用體積濃度為70%的乙醇洗一遍，用42. 5 μ L ddH20溶解，再用Hpa I進(jìn)行酶切，酶切體系如下 成分體積SnaB I單酶切產(chǎn)物42.5μ Hpa I2.5μ NEBuffer 45μL 、 37 °C水浴作用2h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中連接的體系如下 成分用量IOxLigation Buffer (含 ATP)2μL雙酶切后的pFastBacl2.5μ 雙酶切后的pcDNA3.1(-)5 μL T4 DNA LigaseΙμ 無菌水0.6μ 連接反應(yīng)條件為16°C連接過夜。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下藥品加入體終濃度積10><7叫DNA聚合酶緩沖液5μ IxIOmM dNTP Mixture4 μι0.8mmol/pL20μΜ pEGFP-上游引物Ιμ 0.4μιηο1/μ 20μΜ pEGFP-下游引物Ιμ 0.4μιηο1/μpEGFP-C3 模板2μ 5U/|iL Taq DNA 聚合酶0.5μ 0.5U/|iL 無菌水36.5|iL PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C 30s、55°C 30s、72°C Imin 循環(huán) 40 次，最后 72°C延伸IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中用KpnI和Xho I對重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-pcDNA3. I (-)進(jìn)行雙酶切的體系如下 成分用量 重組轉(zhuǎn)移載體 ΙΟμ pF astB ac I -pcDNA3.1 (-) Kpn I2.5μXho I2.5μ NEBuffer 35μL 無菌水30μ 酶切反應(yīng)條件為37°C水浴2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中用KpnI和Xho I對pMD-EGFP進(jìn)行雙酶切的體系如下成分用量pMD-EGFPΙΟμ Kpn I2.5μ Xho I2.5μ NEBuffer 35μL無菌水30μ 酶切反應(yīng)條件為37°C水浴2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中連接的體系如下 成份體積IOXLigation Buffer (含 ATP)2|iL純化產(chǎn)物 pFastBacl-pcDNA3.1(-)2.5μ 純化產(chǎn)物EGFP5 μι Τ4 DNALigase\μL 無菌水9.5μ 連接反應(yīng)條件為16°C連接過夜。
全文摘要
具有CMV啟動子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，涉及可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。方法酶切pcDNA3.1(-)；酶切pFastBac1；二者連接得pFastBac1-pcDNA3.1(-)；pEGFP-C3進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后于T-Vector連接得pMD-EGFP；pFastBac1-pcDNA3.1(-)和pMD-EGFP分別酶切，再連接，得pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP；制Bacmid-EGFP；轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得CN-EGFP即完成。本發(fā)明首次利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在OL細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)外源基因，拓寬了桿狀病毒可轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動物細(xì)胞范圍。
文檔編號C12N15/66GK102618580SQ20121009320
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者凌宏志, 唐曉艷, 安琪, 宋剛, 平文祥, 樓莊偉, 葛菁萍, 金麗穎, 高冬妮 申請人:黑龍江大學(xué)