專利名稱：一種基于固相載體進行擴增及進行核酸測序的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種基于固相載體進行擴增及進行核酸測序的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是體外酶促合成擴增DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得到擴增。PCR技術(shù)出現(xiàn)之后，根據(jù)不同的需要被不斷改進，廣泛應(yīng)用于基因分離、克隆和核酸序列檢測等領(lǐng)域。現(xiàn)有技術(shù)提供了一種基于固相載體進行擴增的方法，其實現(xiàn)步驟包括(1)將待測樣品與帶有親水性正離子的固相載體混合，使得待測樣品中含有的一種或多種靶標(biāo)核酸以單鏈核酸片段的形式結(jié)合到固相載體上；(2)將引物與帶有靶標(biāo)核酸的固相載體混合，使引物與靶標(biāo)核酸雜交結(jié)合，得到帶有引物-靶標(biāo)核酸的固相載體；(3)利用帶有引物-靶標(biāo)核酸的固相載體進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。該技術(shù)利用固相載體進行擴增，采用引物直接與固相載體上固定的靶標(biāo)核酸雜交結(jié)合，因此擴增反應(yīng)之后，擴增產(chǎn)物游離于液相中，未結(jié)合于固相載體表面，因此固相載體表面結(jié)合的擴增產(chǎn)物量少。利用該現(xiàn)有技術(shù)進行擴增，需以大量核酸分子為模板，當(dāng)固相載體表面的模板較少時無法保證擴增的順利進行，因此降低了固相載體的利用率，提高了成本；若以擴增反應(yīng)結(jié)束后的固相載體進行測序，很容易出現(xiàn)由于固相載體表面帶有的靶標(biāo)核酸過少，檢測信號過弱而無法準(zhǔn)確讀取靶標(biāo)核酸序列的現(xiàn)象，因此該現(xiàn)有技術(shù)對檢測儀器要求高，測序的準(zhǔn)確性存在局限性。因此需要一種新的基于固相載體進行擴增及進行核酸測序的方法，能夠提高固相載體表面的擴增產(chǎn)物結(jié)合量，確保擴增的順利進行，從而提高固相載體的利用率，降低成本，進而增強核酸測序的檢測信號，降低對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下可以提高測序的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于固相載體進行擴增及進行核酸測序的方法，能夠提高固相載體表面的擴增產(chǎn)物結(jié)合量，確保擴增的順利進行，從而提高固相載體的利用率，降低成本，進而增強核酸測序的檢測信號，降低對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下提高測序的準(zhǔn)確性。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的之一，一種基于固相載體進行擴增的方法，所述固相載體表面固定有至少一個模板序列，所述方法包括以下步驟A.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體；B.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得到擴增產(chǎn)物。其中，步驟A所述引物包括用于對所述模板序列進行擴增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是與模板序列5’端互補結(jié)合的核酸序列，所述下游引物是與模板序列 ’端序列相同的核酸序列。其中，步驟B中所述的擴增方式是單分子擴增。進一步的，所述單分子擴增方式包括乳液PCR擴增、滾環(huán)擴增和橋式PCR擴增的任一種。其中，所述引物結(jié)合于固相載體表面的方式為引物與固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)直接結(jié)合；或通過連接子攜帶的基團分別與引物和固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)間接結(jié)合。進一步的，所述配對連接的方式采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/碘乙酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一種。其中，所述固相載體的材質(zhì)采用玻璃、硅膠、陶瓷、塑料和金屬中的至少一種。其中，在步驟A之前還可以包括步驟A0.將模板序列通過基團配對方式結(jié)合于固相載體表面，得到固定有至少一個模板序列的固相載體。進一步的，所述引物及模板序列與固相載體采用不同的基團配對進行結(jié)合，所述固相載體表面或連接子帶有至少兩種基團。其中，步驟B之后還可以包括步驟B’ .對擴增產(chǎn)物進行純化回收。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的之二，一種基于固相載體進行核酸測序的方法，所述固相載體固定有至少一個模板序列，所述核酸測序的方法包括以下步驟A.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體；B.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得到擴增產(chǎn)物；C.根據(jù)堿基互補原則對擴增產(chǎn)物進行核酸測序，得核酸序列信息。其中，步驟A中所述引物包括腫瘤類易感基因引物、心血管疾病類易感基因引物、營養(yǎng)指導(dǎo)基因引物和單基因疾病檢測引物中的任一種。其中，所述步驟C包括以下步驟Cl.將擴增產(chǎn)物變性形成單鏈，得固定于固相載體的單鏈核酸片段；C2.根據(jù)堿基互補原則對單鏈核酸片段進行核酸測序，得核酸序列信息。 其中，所述核酸測序的方法是大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法。進一步的，所述大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法為基于聚合酶合成為基礎(chǔ)的合成測序法，或者是基于絡(luò)合連接為基礎(chǔ)的連接測序法。由上可知，本發(fā)明提供的基于固相載體進行擴增及進行核酸測序的方法，利用固相載體上固定的至少一個模板序列，將引物直接結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，使得擴增產(chǎn)物結(jié)合于固相載體表面，提高了固相載體表面的擴增產(chǎn)物結(jié)合量；利用擴增載體上同時存在的模板序列和引物進行單分子擴增時，可以避免由于沒有引物或沒有模板序列而使得固相載體無法用于擴增，從而提高了固相載體的利用率，降低了成本；同時，利用該擴增方法得到的固相載體進行測序，因其表面固定有大量擴增產(chǎn)物，測序時增強了檢測信號，降低了對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下提高了測序的準(zhǔn)確性。


附圖I是本發(fā)明一個實施例中基于固相載體進行擴增的方法流程圖；附圖2是本發(fā)明一個實施例中基于固相載體進行核酸測序的方法流程圖；附圖3是本發(fā)明一個實施例中對擴增產(chǎn)物進行核酸測序的方法流程圖；附圖4是本發(fā)明一個實施例中基于固相載體進行擴增并進行核酸測序的方法示意圖；附圖5是本發(fā)明一個實施例中基于固相載體進行擴增及核酸測序得到的熒光信號圖；附圖6是本發(fā)明另ー個實施例中基于固相載體進行擴增及核酸測序得到的熒光信號圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進ー步詳細說明。本發(fā)明提供了一種基于固相載體進行擴增及進行測序的方法，該方法是基于表面固定有至少ー個模板序列的固相載體完成的，包括以下步驟首先將擴增所用的引物結(jié)合于固相載體表面的引物結(jié)合位點處，得到固定有引物的擴增載體；然后對擴增載體上的模板序列進行擴增，可以得到表面固定結(jié)合有大量擴增產(chǎn)物的固相載體；利用擴增載體上同時存在的模板序列和引物進行單分子擴增時，可以避免在獨立空間里由于沒有引物或沒有模板序列而使得固相載體無法用于擴增，從而提高了固相載體的利用率，降低了成本；利用這種擴增后得到的固相載體進行核酸測序，可以增強測序時的檢測信號，降低對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下提高測序的準(zhǔn)確性。圖I示出了本發(fā)明ー種基于固相載體進行擴增的方法流程，該方法包括以下步驟S101.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體；S102.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得到擴增產(chǎn)物。利用本發(fā)明記載的基于表面固定有至少ー個模板序列的固相載體進行擴增的技術(shù)方案，可以通過固定于固相載體表面的引物將擴增產(chǎn)物固定到固相載體表面，從而可以提高固相載體表面結(jié)合的模板序列數(shù)量。針對本技術(shù)方案，需要說明的是步驟SlOl中所述引物，是用于對固相載體表面固定的模板序列進行擴增的核酸序列，包括上游引物和下游引物中的至少ー種。所述上游引物，是與模板序列的5’端互補結(jié)合的核酸序列；所述下游引物，是與模板序列的3’端序列相同的核酸序列。在本發(fā)明的ー個具體實施例中，將上游引物或下游引物結(jié)合于固相載體表面的引物結(jié)合位點，與上游引物和下游引物同時固定于固相載體表面的方案相比，可以在實現(xiàn)發(fā)明目的的同時減少試劑的種類；在本發(fā)明的另ー個具體實施例中，將上游引物、下游引物按照一 定的比例同時結(jié)合于固相載體表面的引物結(jié)合位點，可以在實現(xiàn)發(fā)明目的的同時加快擴增的速度。其中上游引物與下游引物的混合比例根據(jù)需要可變，優(yōu)選為I : 2至2 : I的比例之間，更優(yōu)選為 I I。上述對于上游引物與下游引物之間的混合比例只是本發(fā)明所用的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。其中，本發(fā)明所述模板序列，是指固定于固相載體表面，用于作為擴增模板的單鏈核酸序列，可以是DNA、RNA或eDNA，其來源可以是通過固相載體從混合樣品中捕獲得到，也可以是通過直接將模板序列樣品結(jié)合于固相載體表面得到。本發(fā)明所述引物結(jié)合位點，是指固相載體表面用于固定引物的結(jié)合位點。其中，本發(fā)明所述固相載體，可以是由不同材質(zhì)構(gòu)成的，其材質(zhì)可以采用玻璃、硅膠、陶瓷、塑料和金屬中的任意ー種，而固相載體的表面無特殊要求，優(yōu)選帶有平滑表面的固相載體，固相載體的具體類型可以是現(xiàn)有技術(shù)中常用的固相載體，包括但不限于塑料珠、 玻璃珠、玻片、磁珠和納米金顆粒。本發(fā)明中優(yōu)選采用磁珠作為固相載體，以使得擴增反應(yīng)結(jié)束后擴增產(chǎn)物的分離純化更加方便。上述只是本發(fā)明對于固相載體的ー些具體實施例， 并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所述的擴增載體，是指表面固定有至少ー個模板序列，且同時還結(jié)合有引物的固相載體，此時模板序列和引物同時固定于固相載體表面，能夠直接應(yīng)用于擴增。本發(fā)明中所述引物結(jié)合于固相載體表面時，不排除引物同時也與模板序列互補結(jié)合，這并不影響本發(fā)明的發(fā)明目的的實現(xiàn)。上述引物結(jié)合于固相載體表面可以采用多種方式實現(xiàn)。在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，引物通過與固相載體表面攜帯的基團進行配對連接，實現(xiàn)直接結(jié)合，可以簡化操作。在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，引物通過與連接子攜帯的其中ー個基團連接，再通過連接子攜帯的另ー個基團與固相載體表面攜帯的基團進行配對連接，從而實現(xiàn)引物與固相載體的間接連接；在本實施方案的另ー個具體實施例中，連接子是類似于樹脂結(jié)構(gòu)的存在，使用該連接子除了可以實現(xiàn)引物與固相載體的間接連接之外，還可以進ー步提高固相載體表面結(jié)合的引物數(shù)量。其中，所述連接子用于連接引物與固相載體。所述連接子可以采用多種化合物，包括但不限干烷烴、單鏈核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。上述配對連接的方式多種多樣，可以采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/ 碘こ酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的任意一種。在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，引物帶有生物素標(biāo)記，而固相載體本身已經(jīng)經(jīng)過鏈霉親和素修飾，因此兩者直接通過生物素與鏈霉親和素之間的配對連接，實現(xiàn)直接連接。在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，固相載體表面帶有氨基修飾，而引物經(jīng)過羧基修飾，兩者通過氨基-羧基進行配對連接，實現(xiàn)直接連接。在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，采用多聚化合物如樹脂作為連接子，通過氨基分別與引物所帶的羧基及固相載體表面攜帯的醛基進行配對連接，實現(xiàn)引物與固相載體表面的間接結(jié)合。在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，以烷烴分子作為連接子，其上帯有氨基以及羧基，因此可以與羧基化的引物以及表面氨基化的固相載體進行配對連接，實現(xiàn)引物與固相載體表面的間接結(jié)合。上述僅是本發(fā)明中引物結(jié)合于固相載體表面的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的發(fā)明目實現(xiàn)的基礎(chǔ)是表面固定有至少ー個模板序列的固相載體，其表面固定的模板序列是用于擴增的單鏈核酸序列，其來源可以為多種途徑，可以是直接固定有模板序列的固相載體，也可以是通過連接反應(yīng)后固定有模板序列的固相載體，此時，需要在步驟SlOl開始之前，進行模板序列結(jié)合于固相載體表面的操作。在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，直接在擴增之前對所要擴增的基因組進行片段化，然后利用接頭與片段化得到的核酸片段兩端連接，且固相載體表面進行相應(yīng)的修飾處理，再將接完接頭之后的片段固定于固相載體表面。在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，用于擴增的模板序列最初位于臨床待測血液樣品中。首先對固相載體表面進行鏈霉親和素修飾，然后連接經(jīng)過生物素修飾的捕獲探針，得到帶有捕獲探針的固相載體。將帶有捕獲探針的固相載體直接與臨床待測血液樣品混合，從中進行模板序列的捕獲。捕獲結(jié)束后，利用離心分離，即可得到表面固定有模板序列的固相載體。在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，用于擴增的模板序列位于臨床疾病患者的唾液中。為得到用于擴增的模板序列，首先利用相應(yīng)的引物進行一般的PCR，將從患者的唾液中得到的模板序列進行放大，然后以凝膠電泳進行分離回收，回收產(chǎn)物再進行生物素化接頭的連接，而固相載體采用鏈霉親和素修飾的磁珠，兩者混合結(jié)合，即可得到表面固定有至少ー個模板序列的磁珠。上述僅是本發(fā)明中固相載體表面固定的模板序列來源的ー些具體實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。固相載體表面進行模板序列的固定操作之后，在進行步驟SlOl的操作時，引物與固相載體表面的結(jié)合方式，可以與模板序列與固相載體表面的結(jié)合方式一致，也可以米取不一樣的結(jié)合方式。在本發(fā)明的一個實施方案中，引物以及模板序列都米用與固相載體表面直接配對連接的方式。進ー步的，在采用相同結(jié)合方式時，模板序列與引物還可以采用相同或者是不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接或間接配對連接。在本實施方案的ー個具體實施例中，固相載體表面帶有鏈霉親和素修飾，而模板序列和引物都帶有生物素修飾，模板序列和引物都通過鏈霉親和生物素的作用固定于固相載體表面；在本實施方案的另ー個具體實施例中，固相載體表面帶有氨基修飾，而模板序列帶有羧基修飾，引物帶有醛基修飾，模板序列與引物通過不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接；在本實施方案的另ー個具體實施例中，固相載體表面帶有氨基修飾，而模板序列帶有羧基修飾，引物帶有異硫氰基修飾，模板序列與引物通過不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接；在本實施方案的另ー個具體實施例中，固相載體經(jīng)過不同的修飾處理后帶有氨基以及鏈霉親和素，而模板序列帶有羧基修飾，引物帶有生物素修飾，模板序列與引物通過不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接；在本實施方案的另ー個具體實施例中，固相載體表面帶有樹脂包埋，而模板序列與引物分別于樹脂上所攜帯的相同或不同基團進行配對，從而都采用間接連接的方式實現(xiàn)與固相載體的連接。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，模板序列與引物采用不同的固定方式與固相載表面結(jié)合。在本實施方案的一個具體實施例中，固相載體表面帶有鏈霉親和素修飾，模板序列通過捕獲探針實現(xiàn)與固相載體的間接配對連接，而引物通過鏈霉親和生物素的作用實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接，兩者通過不同的結(jié)合方式與固相載體連接；在本實施方案的另一個具體實施例中，固相載體表面帶有氨基修飾，模板序列利用羧基修飾實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接，引物通過氨基與連接子上所帶的醛基配對連接，然后再通過連接子上的醛基實現(xiàn)與固相載體的間接連接，從而實現(xiàn)模板序列與引物通過不同的結(jié)合方式與固相載體連接。上述實施方案以及具體實施例只是本發(fā)明中模板序列與引物兩者與固相載體表面結(jié)合方式的一些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S102中，利用擴增載體對模板序列進行擴增，是指利用一定的方法(如化學(xué)、酶促或其他類型的方法)使得模板序列的拷貝數(shù)增加或?qū)е履０逍蛄写嬖诘男盘栐黾?。本發(fā)明利用擴增載體進行擴增時，除加入必須的擴增試劑外，還加入少量游離態(tài)的引物用以加速擴增的啟動以及擴增的速度。加入的游離態(tài)引物量可根據(jù)固相載體上固定的引物種類和量的不同而進行相應(yīng)的調(diào)整。在本發(fā)明的一個實施方案中，固相載體表面固定的是上游引物，在一個具體實施例中，加入的游離態(tài)引物是下游引物；在另一個具體實施例中，為使擴增速度能夠加快，加入大量游離態(tài)下游引物的同時，也加入了少量上游引物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，固相載體表面固定的是下游引物，在一個具體實施例中，加入的游離態(tài)引物是上游引物；在另一個具體實施例中，為使擴增速度能夠加快，加入大量游離態(tài)上游引物的同時，也加入了少量下游引物。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，上游引物與下游引物同時結(jié)合于固相載體表面，在一個具體實施例中，加入的游離態(tài)引物是上游引物或者是下游引物中的其中一種；在另一個具體實施例中，擴增時同時加入游離態(tài)的上游引物和下游引物，以便加快擴增的速度，且上游引物與下游引物的量以I : I為佳，以其他比例亦可。本發(fā)明可以采用多種擴增方式，包括但不限于常見的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增、基于核酸序列的擴增(NASBA)、Q-Beta復(fù)制和滾環(huán)擴增(RCA)，優(yōu)選可以實現(xiàn)單分子擴增的乳液PCR(EPCR)、橋式PCR，其中橋式PCR又可分為水相橋式PCR和乳液橋式PCR兩種。本發(fā)明所述單分子擴增，是指對模板序列，以極微量(甚至是單個分子)的形式在空間上隔離(但這些模板序列整體上還是屬于同一個反應(yīng)體系)，在各自的空間內(nèi)實現(xiàn)對模板序列的擴增，得到擴增均一的擴增產(chǎn)物，用以提升擴增后得到的擴增產(chǎn)物的信號。其中，本發(fā)明中所述EPCR是利用乳濁液體系中各液滴形成的獨立空間，對擴增載體上的模板序列進行獨立擴增反應(yīng)，用以生成大量均一的擴增產(chǎn)物的單分子擴增技術(shù)，其大致操作步驟是將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個擴增載體，包含有足夠的其它擴增試劑(包括DNA聚合酶、dNTP等)。在EPCR反應(yīng)后，固相載體表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源的模板序列擴增產(chǎn)物。EPCR 具體步驟可參考文獻BEAMing :single_molecule PCR on microparticlesNo. 7，July 2006。本發(fā)明中所述的橋式PCR是利用固定于固相載體上的上游引物或下游引物與模板序列形成橋狀結(jié)構(gòu)進行擴增，從而得到大量同源、均一擴增產(chǎn)物的單分子擴增技術(shù)。所述橋式PCR的基本原理是，橋式PCR的引物被固定在固相載體上，PCR過程中PCR擴增產(chǎn)物會被固定在固相載體上，且PCR擴增產(chǎn)物能夠與固相載體上的引物互補配對，成橋狀，然后互補配對的引物以與其成橋的擴增產(chǎn)物為模板進行擴增。通過控制初始模板加入的量，橋式PCR反應(yīng)完成后，擴增產(chǎn)物在固相載體上以一簇簇的形式存在，且每一簇的擴增產(chǎn)物為同來源的DNA模板擴增產(chǎn)物。水相橋式PCR與乳液橋式PCR的主要區(qū)別在于，乳液橋式PCR是在乳液體系中隔離的獨立空間中進行橋式PCR，同時具有水相橋式PCR與EPCR的特性。關(guān)于橋式PCR的具體原理和實施方案可參考以下文獻CN20061009879. X、US6227604和Dual primer emulsion PCR for nextgeneration DNA sequencing,Ming Yan Xu et alBenchmarks Vol. 48No. 5, 2010。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，利用PCR方法對模板序列進行擴增，此方法操作簡單，但缺點在于需要模板序列較多。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，利用RCA的方法對模板序列進行擴增，此實施方案的優(yōu)勢在于能夠形成單分子擴增，擴增結(jié)束后可以直接得到大量均一的擴增產(chǎn)物；也可以針對模板序列中存在的特異性核酸序列，利用特異性核酸內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，可以得到大量特定位置且分布均一的擴增產(chǎn)物。所述特異性核酸內(nèi)切酶，是指能識別模板序列中的特異性核酸序列，并在特定位置進行切割的內(nèi)切酶。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，利用EPCR對擴增載體表面固定的模板序列進行擴增，可以實現(xiàn)單分子擴增，以極少量甚至是單個模板序列完成擴增，而且得到大量均一的擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，利用橋式PCR對擴增載體表面固定的模板序列進行擴增，同樣可以實現(xiàn)單分子擴增，以極少量甚至是單個模板序列完成擴增，得到大量均一的擴增產(chǎn)物。在本實施方案中的一個具體實施例中，利用水相橋式PCR對固相載體表面固定的模板序列進行擴增；而在本實施方案中的另一個具體實施例中，利用乳液橋式PCR實現(xiàn)對固相載體表面固定的模板序列的擴增。其中，本發(fā)明中所述的擴增產(chǎn)物，指的是經(jīng)過擴增反應(yīng)后，表面固定有大量擴增得到的核酸序列的固相載體。上述優(yōu)選實施方案中利用EPCR和橋式PCR進行單分子擴增，與只有引物或只有模板序列固定于固相載體的技術(shù)相比，可以避免由于缺少其中一種而無法進行擴增，從而可以提高固相載體用于擴增的效率，減少固相載體的使用量，降低成本。而且，與背景技術(shù)中提到的現(xiàn)有技術(shù)相比，同為固相載體上固定有模板序列的擴增技術(shù)，本發(fā)明所述技術(shù)方案的擴增產(chǎn)物全部結(jié)合于固相載體表面，可以提高帶有擴增產(chǎn)物的固相載體在后續(xù)應(yīng)用中的效率，進一步降低成本。上述僅是本發(fā)明中用于擴增固相載體表面固定的模板序列的一些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S102進行擴增后，得到的擴增產(chǎn)物里包含表面結(jié)合有擴增的模板序列的固相載體，以及其他未反應(yīng)完的雜質(zhì)，因此，若需要進一步進行后續(xù)操作，需要進行對擴增產(chǎn)物的純化回收。純化回收的目的在于將表面結(jié)合有擴增的模板序列的固相載體與雜質(zhì)分離提純出來，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的常用方法，包括但不限于離心分離提純、柱分離純化。圖2示出了本發(fā)明的一種基于固相載體進行核酸測序的方法，其中所述固相載體固定有至少一個模板序列，該方法包括以下步驟S201.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體；S202.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得擴增產(chǎn)物；S203.根據(jù)堿基互補原則對擴增產(chǎn)物進行核酸測序，得核酸序列信息。本技術(shù)方案的優(yōu)勢在于，基于表面固定至少有一個模板序列的固相載體，在其表面結(jié)合引物進行擴增，可以提高固相載體表面擴增產(chǎn)物結(jié)合的數(shù)量，從而可以在后續(xù)的核酸測序過程中，增強核酸測序的檢測信號，降低對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下可以提高測序的準(zhǔn)確性。針對本技術(shù)方案，需要說明的是步驟S201中引物、固相載體表面固定的模板序列、引物與固相載體結(jié)合的方式以及相應(yīng)的內(nèi)容，遵循上一技術(shù)方案中步驟SlOl中所述，在此不再過多贅述。鑒于本技術(shù)方案的優(yōu)勢所在，可將本發(fā)明所記載的技術(shù)方案應(yīng)用于各種臨床疾病相關(guān)基因的核酸序列檢測，用以得到相關(guān)基因的核酸序列，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合后續(xù)進一步的分子生物學(xué)試驗和臨床試驗、臨床觀察以及綜合數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，并建立一定的疾病模型，進而可以實現(xiàn)相應(yīng)疾病的早期評估。需要進一步說明的是，本技術(shù)方案中所述的引物并無特殊要求，包括上游引物和/或下游引物，是用于擴增模板序列的核酸序列。所述引物優(yōu)選可以與臨床應(yīng)用結(jié)合，能用于擴增各種臨床疾病相關(guān)基因序列的引物，包括但不限于腫瘤類易感基因引物、心血管疾病類易感基因引物、營養(yǎng)指導(dǎo)基因引物和單基因疾病檢測引物。其中，所述腫瘤類易感基因引物，是指用于擴增各種腫瘤類易感基因的引物；所述腫瘤類易感基因，是指初步研究顯示可能與某一種腫瘤有一定關(guān)聯(lián)的基因，常見的包括但不限于肺癌易感基因、乳腺癌易感基因、結(jié)直腸癌易感基因、鼻咽癌易感基因、胰腺癌易感基因、肝癌易感基因和胃癌易感基因。其中，所述肺癌易感基因包括但不限于APE1、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、CYP1A1、CYP2E1、ERCC1、ERCC2 和 ERCC6 ;所述乳腺癌易感基因包括但不限于FGFR2、MTHFR和IL-I β ;所述結(jié)直腸癌易感基因包括但不限于ΜΜΡ2、SMAD7、ADH2、ALDH2、CYP1A2、MMP-1、MTHFR、TP53、VEGF和C0X-2 ;所述鼻咽癌易感基因包括但不限于IL-2、MDM2、HLA-A, HLA-B, MDSl-EVII、HCG9和ITGA9 ;所述胰腺癌易感基因包括但不限于 MTHFR、COX-2、FasL, CASP8、THSD7B、ARL4C、LTF、FOXQl 和 PARK2 ;所述肝癌易感基因包括但不限于IL-1B、TNF-a、EGF和TGF-β I ;所述胃癌易感基因包括但不限于EGF、ALDH2、MTHFR、P53、IL-10、PSCA、TNFA、PLCEl、CYPlAl 和 CDHl。所述心血管疾病類易感基因引物，是指用于擴增各種心血管類疾病易感基因的引物；所述心血管疾病類易感基因，是指經(jīng)初步研究顯示與各種心血管類疾病有一定關(guān)聯(lián)的基因，常見的包括但不限于冠狀動脈性心臟病易感基因、動脈粥樣硬化易感基因、老年性癡呆癥易感基因、原發(fā)性高血壓易感基因、家族性高膽固醇血癥易感基因、心肌梗塞易感基因和帕金森綜合癥易感基因。其中，所述冠狀動脈性心臟病易感基因包括但不限于MEF2A、PDGF, FGF、EGF、VEGF, COX-I和T-PA ;所述動脈粥樣硬化易感基因包括但不限于AL0X5AP、ApoE、LDLR、HUMARA、DCC和Rb ;所述老年性癡呆癥易感基因包括但不限于APP、PS-I、PS_2、ApoE, ACE、CH25H、CST3、CHRNB2和SORLl ;所述原發(fā)性高血壓易感基因包括但不限于AGT、ACE、AT1R、CYP11B2、G_0 3、eN0S、RnB0、LDLR和LL ;所述家族性高膽固醇血癥易感基因包括但不限于LDLR、apoB 100和ApoE ;所述心肌梗塞易感基因包括但不限于ALDH2、LTA、PSMA6、TAFI、ACE和MMP9 ;所述帕金森綜合癥易感基因包括但不限于SNCA、LRRK2、PINKl、UCH-L I和 Parkin。
所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因引物，是指用于擴增各種營養(yǎng)指導(dǎo)基因的引物。所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因，是指經(jīng)初步研究顯示與人體營養(yǎng)具有一定關(guān)聯(lián)，可用于指導(dǎo)人體營養(yǎng)吸收消化能力的基因，常見的包括但不限于抗葉酸代謝指導(dǎo)基因、黃曲霉素代謝能力指導(dǎo)基因、嗜酒基因、吸煙損傷指導(dǎo)基因和乳糖代謝指導(dǎo)基因。所述葉酸代謝指導(dǎo)基因包括但不限于MTHFR、MTRR、CBS和SHMTl ;所述黃曲霉素代謝能力指導(dǎo)基因包括但不限于GSTM1、GSTTU EPHx,XRCCl和hOGGl ;所述嗜酒基因包括但不限于ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1 ;所述吸煙損傷指導(dǎo)基因包括但不限于P53和K-ras ;所述乳糖代謝指導(dǎo)基因包括但不限于LCT、MCM6和ALDH2。所述單基因疾病檢測引物，是指用于擴增各種單基因疾病基因的引物。所述單基因疾病基因，是指與各種單基因疾病具有一定關(guān)聯(lián)的單一基因，常見的包括但不限于苯丙酮尿癥基因(PAH)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因(G6PD)、半乳糖血癥基因(GALT)、A型及B型血友病基因(F8及F9)、鐮刀狀細胞性貧血基因(HBB)和地中海貧血基因(HBA)。上述僅是本發(fā)明中對于引物的一些具體實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S202中所述擴增，可以采用多種方式實現(xiàn)，為保證用于核酸測序的擴增產(chǎn)物的均一性，優(yōu)選采用單分子擴增方式，包括但不限于EPCR和橋式PCR，相應(yīng)的操作已經(jīng)在之前進行了詳細描述，在此也不作過多贅述。利用擴增載體進行擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物后，為保證用于核酸測序時擴增產(chǎn)物的純度，需要對擴增產(chǎn)物進行純化回收，根據(jù)不同的擴增方式需要采用不同的純化回收方式，而這些純化回收方式是本領(lǐng)域內(nèi)成熟而且常知的技術(shù)內(nèi)容，包括但不限于離心分離法、柱分離純化回收法，若固相載體為特定的磁珠或磁球，也可以直接利用磁鐵吸附的方法進行純化回收。若擴增方式優(yōu)選為EPCR和乳液橋式PCR，則純化回收步驟中還需要進行破乳釋放擴增產(chǎn)物的操作，破乳釋放的方法可以采用常見的方法，在本發(fā)明的一個具體實施方案中，往擴增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物中加入釋放緩沖液，利用離心破乳的方式釋放擴增產(chǎn)物；在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，往擴增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物中加入異丙醇進行破乳釋放擴增產(chǎn)物，然后通過離心分離的方式得到純化后的擴增產(chǎn)物；在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，往擴增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物中加入己烷進行破乳釋放擴增產(chǎn)物，然后再離心分離得到純化后的擴增產(chǎn)物。上述僅是本發(fā)明中利用擴增載體進行擴增的一些具體實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。
步驟S203利用步驟S202中得到的擴增產(chǎn)物進行核酸測序，其具體操作如圖3所示的方法流程實現(xiàn)，該方法包括以下步驟S2031.將擴增產(chǎn)物變性形成單鏈，得固定于固相載體的單鏈核酸片段；S2032.根據(jù)堿基互補原則對單鏈核酸片段進行核酸測序，得核酸序列信息。步驟S2031中，在對擴增產(chǎn)物進行核酸測序之前，由于擴增之后得到的擴增產(chǎn)物是雙鏈核酸序列，因此需要進行變性形成單鏈，得到固定于固相載體表面的單鏈核酸片段。步驟S2032中所述核酸測序，是指利用堿基互補原則，對擴增產(chǎn)物的堿基進行配對，以此來檢測其核酸序列。進行核酸測序的方法可以采用多種方法，本發(fā)明基于固相載體表面帶有大量擴增產(chǎn)物，優(yōu)選采用大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法，以此提高核酸測序的效率與準(zhǔn)確性。本發(fā)明所述大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法是指在固相載體表面構(gòu)建擴增產(chǎn)物矩陣后，所有矩陣點上的測序反應(yīng)都可以平行而且循環(huán)進行的測序方法。所述大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法包括但不限于基于聚合酶合成為基礎(chǔ)的合成測序法、基于絡(luò)合連接為基礎(chǔ)的連接測序法?；诰酆厦负铣蔀榛A(chǔ)的合成測序法是基于帶可去除標(biāo)記的核苷酸進行的，在每次合成反應(yīng)中，每個模板鏈至多只能延伸一次，然后收集該次加入的核苷酸的標(biāo)記信號，然后根據(jù)堿基互補原則即可得到相應(yīng)的待測核苷酸?；诰酆厦负铣蔀榛A(chǔ)的合成測序法的大致流程如下a.測序引物通過互補配對結(jié)合在單鏈核酸片段共有的已知序列上(該單鏈核酸片段固定在固相載體表面上)，在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸進行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集該次加入核苷酸的標(biāo)記信號，即可得到與測序引物3’最末端堿基互補的單鏈核酸片段的下一位的堿基序列信息。b.切除可去除標(biāo)記，然后在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸繼續(xù)進行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集加入核苷酸的標(biāo)記信號，即可得到與測序引物3’末端堿基互補的單鏈核酸片段的下兩位的堿基序列信息。重復(fù)b步驟，直至不能繼續(xù)進行合成反應(yīng)為止，從而獲得單鏈核酸片段的全部序列信息?；诮j(luò)合連接為基礎(chǔ)的連接測序法是基于帶熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進行的，在每次連接反應(yīng)中，每個模板鏈至多只連接ー種特定位置帶熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，然后收集該次的熒光標(biāo)記信號，然后根據(jù)堿基互補原則即可得到相應(yīng)的待測核苷酸。其中ー種連接酶的連接測序法是基于在特定位置帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進行的，該寡核苷酸探針帶有n個堿基，從其5’端數(shù)起的第a位帶有熒光標(biāo)記，其中不同的堿基對應(yīng)特定的熒光標(biāo)記，因為該寡核苷酸探針的3’端或5’端進行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個單鏈核酸片段只能連接ー個寡核苷酸探針。該連接測序法的大致流程如下A.測序引物通過互補配對結(jié)合在單鏈核酸片段共有的已知序列上，利用上述的寡核苷酸探針，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號， 即可得到與單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a位堿基序列信息。B.切除寡核苷酸上的熒光標(biāo)記，在連接酶的作用下，以上述的寡核苷酸探針為原料，繼續(xù)進行連接反應(yīng)，然后采集熒光信號，從而得到單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第2a位的堿基序 列信息。重復(fù)B步驟，直至不能繼續(xù)進行連接反應(yīng)為止，從而獲得單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a、2a、3a、4a......位的堿基序列信息。然后將測序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單鏈核酸片段上變性洗脫下來，換用與之前的測序引物相比3’末端或5’末端少ー個堿基的引物重復(fù)上述反應(yīng)，從而獲得單
鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a-l、2a-l、3a-l、4a_l......位的
堿基序列信息。重復(fù)此步驟，最后獲得單鏈待核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’
末端如第a_ (a-1)、2a_ (a-1)、3a_ (a-1)、4a_ (a-1)......位的喊基序列イ目息，從而獲得單
鏈核酸片段的全部序列信息。另ー種連接酶的連接測序法同樣也是基于帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進行的，該寡核苷酸探針帶有n個堿基，分為h(h ^ n)組，同一組寡核苷酸探針的不同熒光標(biāo)記對應(yīng)同一特定位置的不同堿基序列，不同組之間的區(qū)別在于不同熒光標(biāo)記對應(yīng)的特定位置不同，因為該寡核苷酸探針的3’端或5’端進行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個單鏈核酸片段只能連接ー個寡核苷酸探針。該連接測序法大致流程如下a.測序引物通過互補配對結(jié)合在單鏈核酸片段共有的已知序列上，利用上述寡核苷酸探針中的ー組(熒光標(biāo)記對應(yīng)的堿基位置為X，X く h)，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號，即可得到與單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第X位堿基序列信息，將測序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單鏈核酸片段上變性洗脫下來。b.然后重新將測序引物結(jié)合在單鏈核酸片段上，換用與a步驟不同的寡核苷酸探針組(熒光標(biāo)記對應(yīng)的堿基位置為1，I く h)，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號，即可得到與單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第y位堿基序列信息，將測序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單鏈核酸片段上變性洗脫下來。 C.重復(fù)步驟b，直至h組寡核苷酸探針均分別進行過一次連接反應(yīng)，從而獲得單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第1、2......、!!位的堿基序列信息。換用與之前的測序引物相比3’末端或5’末端多ー個或多個通用堿基的引物按上述原理進行反應(yīng)，能夠延長獲得的單鏈核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前的喊基序列的讀長。這種基于絡(luò)合連接為基礎(chǔ)的連接測序法的原理和具體實施方案可參考CN200710170507. I?；诤铣擅负铣蔀榛A(chǔ)的合成測序法原理上與焦磷酸測序方法類似，因此焦磷酸測序法同樣能夠適用于本發(fā)明的檢測方法。但是現(xiàn)有的焦磷酸測序法在測序過程中采用的是天然dNTP，使得其在測序過程中，對待測序文庫上可能存在的連續(xù)單堿基重復(fù)序列的測定存在困難；而基于聚合酶的合成測序法中的核苷酸帶有的可去除標(biāo)記，能夠保證毎次只延伸一個堿基；基于連接酶的連接測序發(fā)中的帶熒光標(biāo)記的探針的3’端或5’端進行了修飾，保證每個單分子擴增產(chǎn)物的片段上只連接ー個熒光探針；因此本發(fā)明的基于聚合酶的合成測序法和基于連接酶的連接測序法的準(zhǔn)確性較焦磷酸測序高。
此外，因為現(xiàn)有的焦磷酸測序儀器中的蝕刻光纖玻片(PTP板)上的小孔較大(55 UmX 44 u m)，用于容納測序之前的乳液PCR所得的擴增產(chǎn)物(乳液PCR的擴增產(chǎn)物被固定在10 y m的珠上)，這大大限制了焦磷酸測序法的測序通量，使得其測序反應(yīng)的試劑成本較高。此外，焦磷酸測序法在測序過程中還需往蝕刻光纖玻片(PTP板)的小孔內(nèi)加入昂貴的含有多種蛋白的復(fù)合物以保證測序反應(yīng)的順利進行，而這將大大提高測序反應(yīng)的試劑成本相対的，基于聚合酶的合成測序法和基于連接酶的連接測序法可通過Iy m的磁珠或者玻片來固定單分子擴增的產(chǎn)物，使得其通量更高，且除了需要帶有可去除標(biāo)記的核苷酸或在3’端或5’端進行了修飾的熒光標(biāo)記的探針外，對所需的其他試劑無特殊要求，這大大降低了測序反應(yīng)的試劑成本。在獲得相同數(shù)據(jù)量的情況下，基于聚合酶的合成測序法和基于連接酶的連接測序法的測序成本為焦磷酸測序法的兩千分之一或更少。因此本發(fā)明方案中優(yōu)選基于聚合酶的合成測序法或基于連接酶的連接測序法對單分子擴增產(chǎn)物進行測序。圖4為本發(fā)明ー個具體實施例中基于固相載體進行核酸測序的方法示意圖，該圖直觀的展現(xiàn)了基于固相載體進行核酸測序的過程步驟I.將模板序列結(jié)合于表面經(jīng)鏈霉親和素修飾的磁珠表面，得到表面固定有至少ー個模板序列的磁珠利用鏈霉親和素對磁珠表面進行修飾；以乳腺癌的GSTPl基因片段(SEQ ID NO 10)作為模板序列，采用生物素進行修飾；然后將經(jīng)過修飾后的磁珠與模板序列混合孵育，使得模板序列結(jié)合于磁珠表面，得到表面固定有至少ー個模板序列的磁珠。步驟2.引物結(jié)合于磁珠表面的引物結(jié)合位點，得到擴增載體將用于擴增模板序列的上游引物Gl (SEQ ID NO :1)、下游引物G2(SEQ ID NO 2)進行生物素化修飾，然后與表面固定有至少ー個模板序列的磁珠進行混合孵育，使得上游引物與下游引物結(jié)合到磁珠表面的引物結(jié)合位點處；孵育結(jié)束之后，利用磁鐵吸附住磁珠進行分離純化，得到用于擴增的擴增載體。步驟3.利用擴增載體進行單分子擴增，得到擴增產(chǎn)物利用深圳華因康基因科技有限公司的KE001乳濁液制備試劑盒，先制備油相體系，然后以擴增載體與其他擴增試劑(包括DNA聚合酶、少量上游引物和下游引物、緩沖液、鎂離子、dNTP等)組合形成水相，采用注水入油方式在乳濁液制備裝置上制成乳濁液體系；利用制備好的乳濁液體系進行EPCR單分子擴增，擴增結(jié)束之后以磁鐵吸附，分離純化得到擴增產(chǎn)物。步驟4.對擴增產(chǎn)物進行核酸測序，得到核酸序列信息將得到的擴增產(chǎn)物進行變性形成單鏈核酸片段，點樣，在玻片表面形成核酸片段矩陣，然后將帶有矩陣的玻片組裝成測序反應(yīng)小室，利用深圳華因康基因科技有限公司的Pstar-II測序平臺進行連接測序法測序，經(jīng)過生物信息學(xué)分析的手段得到模板序列的核酸序列信息。針對上述各技術(shù)方案，為進ー步說明，本發(fā)明給出具體的操作實施例本實施例以肺癌易感基因中的CYPlAl基因片段(SEQ ID NO 11)和XRCCl基因片段(SEQ ID NO :12)作為模板序列，利用本發(fā)明所述的技術(shù)方案對其進行擴增并進ー步對擴增產(chǎn)物進行核酸測序；為便于分離純化操作，固相載體采用磁珠。—、模板序列與磁珠表面的結(jié)合
將作為模板序列的CYPlAl基因片段和XRCCl基因片段分別用生物素進行修飾，然后分別與表面經(jīng)過鏈霉親和素修飾的磁珠結(jié)合，通過螺旋振蕩進行混勻，得到表面固定有至少一個模板序列的磁珠，每個反應(yīng)體系及反應(yīng)過程如下所示 模板序列 0.015ng (約IO8個分子)；鏈霉親和素修飾的Myone 磁珠(I μ m, 10mg/mL ;Invitrogen) 6 μ L ；螺旋振蕩混勻，反應(yīng)30min，以適量 TE 緩沖液，IOmM Tris-HCl，pH8. O ；lmM EDTA)清洗兩次，離心分離，將得到的磁珠以結(jié)合緩沖液(lOmMTris-HCl，pH7. 5 ；lmM EDTA ;IMNaCl ；0. 01% Triton X-100)重懸保存。二、引物結(jié)合于磁珠表面，得到擴增載體將用于擴增CYPlAl基因片段的上游引物Fl (SEQ ID NO 3)、下游引物Rl (SEQ IDNO 4)以及用于擴增XRCCl基因片段的上游引物F2 (SEQ IDNO :5)、下游引物R2 (SEQ ID NO:6)分別結(jié)合于固定有模板序列的磁珠表面，得到相應(yīng)的擴增載體；其中上游引物與下游引物都經(jīng)過生物素化，采用I : I的比例進行混合，具體的反應(yīng)體系及反應(yīng)過程為生物素化的上游引物與下游引物的混合物(100 μ M) O. 6 μ L ;磁珠懸浮液 IOyL;室溫條件下(18 25°C )，螺旋振蕩，孵育Ih ；適量TE緩沖液清洗2次，離心，以6μ L TE緩沖液重懸磁珠，得到擴增載體懸浮液，4 °C保存?zhèn)溆?。三、利用擴增載體進行擴增，得到擴增產(chǎn)物本實施方案中，利用擴增載體進行EPCR單分子擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物。I.乳濁液體系制備采用深圳華因康基因科技有限公司的KE001乳濁液制備試劑盒，根據(jù)使用說明首先對油相制備試劑以螺旋劇烈振蕩進行混勻，置于室溫30min，得到用于制備乳濁液體系的油相體系；利用擴增載體及試劑盒中相應(yīng)試劑制備PCR Mix水相體系，以150 μ L為例，該水相體系成分如下所示ddH20 112μ L ；10XPCR buffer (650mM Tris-HCl, ρΗ8· 0 ；160mM(NH4)2SO4 ；IOmMDTT ；llmM MgCl2)15μ L ；50mM MgSO4 3 μ L ；IOmM dNTP 3μ L ；10 μ M上游引物、下游引物混合物1.2yL;擴增載體懸浮液6yL;5U/μ L DNA Taq 酶 9yL;上述成分混勻，制備成PCR Mix水相體系。將制備好的油相體系與水相體系按照4 I的比例放入EP管中混合，同時加入輔助混勻的固相顆粒，根據(jù)實驗條件的不同，可以選擇加入鋼珠、玻璃珠或塑料珠，本實施方案中優(yōu)選加入鋼珠，將EP管置于乳濁液制備儀上夾緊，按照15HZ，10s，再轉(zhuǎn)換17HZ，8s進行振蕩混勻,制備成乳濁液體系。
2. EPCR單分子擴增利用制備好的乳濁液體系進行EPCR單分子擴增。CYPlAl基因片段和XRCCl基因片段的單分子擴增可以在同一體系中同時進行，簡化操作；也可以在兩個體系中分別進行，這樣可以直接對擴增產(chǎn)物進行區(qū)分。單分子擴增反應(yīng)體系以及反應(yīng)過程如下所示4min, 94°C ；30s 94 °C,55s 64 °C,45s 72°C，循環(huán)數(shù)為 3;30s 94 °C,55s 61 °C, 45s 72°C，循環(huán)數(shù)為 3;30s 94 °C,55s 58 °C,45s 72°C，循環(huán)數(shù)為 3;30s 94 °C,55s 57 °C,45s 72°C，循環(huán)數(shù)為 100 ;6min，72°C ；反應(yīng)結(jié)束后10 C保存。3.破乳釋放擴增產(chǎn)物，分離提純在EPCR反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)產(chǎn)物中加入適量異丙醇，螺旋震蕩混勻后4000rpm，3min離心分離去上清，擴增產(chǎn)物以磁鐵吸附。擴增產(chǎn)物中加入適量的抽提緩沖液(Extraction buffer),螺旋振蕩混勻后4000rpm離心3min分層，用磁鐵吸附磁珠，將液體清除；重復(fù)此操作數(shù)次。然后加入適量TE，重復(fù)清洗數(shù)遍擴增產(chǎn)物，最后以適量的TE重懸磁珠。四、利用擴增產(chǎn)物進行核酸測序，得到核酸序列信息利用華因康基因科技有限公司的Pstar-II測序平臺對擴增產(chǎn)物進行連接測序法測序，經(jīng)過生物信息學(xué)分析的手段得到模板序列的核酸序列信息。得到的擴增產(chǎn)物經(jīng)過變性得到單鏈核酸片段，然后與測序用的緩沖液進行混合，在測序?qū)Ｓ命c樣的玻片上進行矩陣點樣。點樣完成后，利用錫箔紙將放有已經(jīng)點好樣的固相載體的容器包住避光，室溫下固定lh。固定結(jié)束之后的玻片，以TE緩沖液進行洗滌，并用ddH20進行過洗。將洗滌過的玻片組裝成測序小室，然后根據(jù)之前所述的經(jīng)典連接測序法進行核酸測序，收集熒光信號圖，如圖5所示。利用生物信息學(xué)手段對熒光信號圖進行分析，得到模板序列的核酸序列信號。針對本發(fā)明所述有益效果中提到的固相載體利用率、增強測序時的檢測信號、降低對檢測儀器的要求以及同等條件下提高測序的準(zhǔn)確性，本發(fā)明提供了一個實施例加以證明。本實施例以CASP7基因中一段長度為160bp的核酸片段作為模板序列Ml (SEQ IDNO :13)，設(shè)計并合成用于擴增Ml的一對引物F3 (SEQ ID N0:7)、R3(SEQ ID N0:8)，利用帶有鏈霉親和素修飾的Myone磁珠對其進行擴增并利用擴增得到的擴增產(chǎn)物進行核酸測序。設(shè)計五個實驗組，各實驗組之間的區(qū)別在于進行EPCR反應(yīng)的體系不同，對應(yīng)的分別為體系Pl、體系P2 、體系P3、體系P4和體系P5。一、各EPCR反應(yīng)體系的構(gòu)建I.體系 PlI)模板序列結(jié)合于磁珠表面將模板序列Ml進行生物素修飾，然后與磁珠進行混合結(jié)合，得到表面固定有至少一個模板序列的磁珠，反應(yīng)體系及反應(yīng)過程為生物素化的模板序列Ml 0.016ng(108個分子)；Myone 磁珠(I u m, 10mg/mL ; Invitrogen) 6 u L ；螺旋振蕩混勻，反應(yīng)30min，以適量 TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl，pH8. O ；lmM EDTA)清洗兩次，離心分離，將得到的磁珠以6 ii L結(jié)合緩沖液(lOmMTris-HCl，pH7. 5 ；lmM EDTA ；IM NaCl ；0. 01% Triton X-100)重懸保存。2)引物結(jié)合于磁珠表面將步驟I)得到的產(chǎn)物(結(jié)合有模板序列Ml的磁珠懸浮液)與5’端帶有生物素標(biāo)記的引物(F3、R3)反應(yīng)，使生物素化的F3、R3與模板序列Ml同時結(jié)合在Myone磁珠表面,反應(yīng)體系及過程如下生物素化的引物F3 (IOOiiM) 0. 3u L ；生物素化的引物R3 (IOOiiM) 0. 3u L ；步驟I)產(chǎn)物磁珠懸浮液 6 ii L ;室溫條件下(18 25°C )，螺旋振蕩，孵育Ih ； 適量TE緩沖液清洗2次，離心，以6 ii L TE緩沖液重懸磁珠，得到磁珠懸浮液，4°C保存?zhèn)溆?。本體系中，用干與磁珠結(jié)合，并作為擴增模板的模板序列的摩爾數(shù)與磁珠的數(shù)量大致相同，因此，步驟2)所得的磁珠懸浮液中的一個磁珠表面只結(jié)合了極少量甚至是單個模板序列。3)體系Pl的制備采用深圳華因康基因科技有限公司的KE001乳濁液制備試劑盒，根據(jù)使用說明制備乳池液體系首先對油相制備試劑以螺旋劇烈振蕩進行混勻，置于室溫30min，得到用于制備乳濁液體系的油相體系；利用步驟2)得到的磁珠懸浮液制備PCR Mix水相體系，以150 y L為例，該水相體系如下ddH20 113u L ；10XPCR buffer (650mM Tris-HCl, pH8. 0 ；160mM(NH4)2SO4 ；IOmMDTT ；llmM MgCl2)15u L ；50mM MgSO4 3 U L ；IOmM dNTP 3u L ；未生物素化的F3 (IOiiM) 0. 5u L ；
未生物素化的R3 (IOiiM) 0. 5u L ；步驟2)得到的磁珠懸浮液6 ii L ;5U/ii L DNA Taq 酶 9 ii L ;將上述成分混勻，制備成PCR Mix水相體系。將制備好的油相體系與水相體系按照4 I的比例放入EP管中混合，同時加入輔助混勻的鋼珠，將EP管置于乳濁液制備儀上夾緊，按照15HZ，10s，再轉(zhuǎn)換17HZ，8s進行振蕩混勻，制備成用于單分子擴增的乳濁液體系P1。2.體系 P2I)引物結(jié)合于磁珠表面將Myone磁珠與5’端帶有生物素標(biāo)記的引物(F3、R3)反應(yīng)，使生物素化的F3、R3結(jié)合在磁珠表面，反應(yīng)體系及過程如下生物素化的引物F3 (IOOiiM) 0. 3 U L ；生物素化的引物R3 (IOOiiM) 0. 3u L ；Myone 磁珠6 y L ;室溫條件下(18 25°C )，螺旋振蕩，孵育Ih ；適量TE緩沖液清洗2次，離心，以6 ii L TE緩沖液重懸磁珠，得到磁珠懸浮液，4°C保存?zhèn)溆谩?)體系P2的制備采用深圳華因康基因科技有限公司的KE001乳濁液制備試劑盒，根據(jù)使用說明制備乳池液體系首先對油相制備試劑以螺旋劇烈振蕩進行混勻，置于室溫30min，得到用于制備乳濁液體系的油相體系；利用步驟I)得到的磁珠懸浮液制備PCR Mix水相體系，以150 ii L為例，該水相體系如下ddH20 111 U L ；10XPCR buffer (650mM Tris-HCl, pH8. 0 ；160mM(NH4)2SO4 ；IOmMDTT ；llmM MgCl2)15u L ；50mM MgSO4 3 u L ；IOmM dNTP 3u L ；未生物素化的Ml模板序列0. 016ng(108個分子)；未生物素化的F3 (IOiiM) 0. 5 U L ； 未生物素化的R3 (IOiiM) 0. 5u L ；步驟I)得到的磁珠懸浮液 6 ii L ;5U/ ii L DNA Taq 酶 9 ii L ;將上述成分混勻，制備成PCR Mix水相體系。將制備好的油相體系與水相體系按照4 I的比例放入EP管中混合，同時加入輔助混勻的鋼珠，將EP管置于乳濁液制備儀上夾緊，按照15HZ，10s，再轉(zhuǎn)換17HZ，8s進行振蕩混勻，制備成用于單分子擴增的乳濁液體系P2。3.體系 P3
I)模板序列結(jié)合 于磁珠表面將模板序列Ml進行生物素修飾，然后與磁珠進行混合結(jié)合，得到表面固定有至少一個模板序列的磁珠，反應(yīng)體系及反應(yīng)過程為生物素化的模板序列Ml 0.016叩(108個分子)；Myone 磁珠(I μ m, 10mg/mL ; Invitrogen) 6 μ L ；螺旋振蕩混勻，反應(yīng)30min，以適量TE緩沖液清洗兩次，離心分離，將得到的磁珠以結(jié)合緩沖液重懸保存。2)引物結(jié)合于磁珠表面將步驟I)得到的產(chǎn)物(結(jié)合有模板序列Ml的磁珠懸浮液)與5’端帶有生物素標(biāo)記的F3反應(yīng)，使生物素化的F3與模板序列Ml同時結(jié)合在Myone磁珠表面，反應(yīng)體系及過程如下生物素化的引物F3 (100 μ M) O. 6 μ L ；步驟I)產(chǎn)物磁珠懸浮液 6 μ L ;室溫條件下(18 25°C )，螺旋振蕩，孵育Ih ； 適量TE緩沖液清洗2次，離心，以6 μ L TE緩沖液重懸磁珠，得到磁珠懸浮液，4°C保存?zhèn)溆?。本體系中，用于與磁珠結(jié)合，并作為擴增模板的模板序列的摩爾數(shù)與磁珠的數(shù)量大致相同，因此，步驟2)所得的磁珠懸浮液中的一個磁珠表面只結(jié)合了極少量甚至是單個模板序列。3)體系Ρ3的制備采用深圳華因康基因科技有限公司的KEOOl乳濁液制備試劑盒，以步驟2)中得到的磁珠懸浮液，按照制備體系Pl的相同操作，制備成用于單分子擴增的乳濁液體系Ρ3。4.體系 Ρ4I)引物結(jié)合于磁珠表面將Myone磁珠與5’端帶有生物素標(biāo)記的F3反應(yīng)，使生物素化的F3結(jié)合在磁珠表面,反應(yīng)體系及過程如下生物素化的引物F3 (100 μ Μ) O. 6 μ L ；Myone 磁珠6 μ L ;室溫條件下(18 25°C )，螺旋振蕩，孵育Ih ；適量TE緩沖液清洗2次，離心，以61 μ L TE緩沖液重懸磁珠，得到磁珠懸浮液，4°C保存?zhèn)溆谩?)體系P4的制備采用深圳華因康基因科技有限公司的KEOOl乳濁液制備試劑盒，以步驟I)中得到的磁珠懸浮液，按照制備體系P2的相同操作，制備成用于單分子擴增的乳濁液體系P4。5.體系 P5I)模板序列結(jié)合于磁珠表面將模板序列Ml進行生物素修飾，然后與磁珠進行混合結(jié)合，得到表面固定有至少一個模板序列的磁珠，反應(yīng)體系及反應(yīng)過程為生物素化的模板序列Ml0.016ng(108個分子)；
Myone 磁珠(I U m, lOmg/mL ;Invitrogen) 6 U L ；螺旋振蕩混勻，反應(yīng)30min，以適量TE緩沖液清洗兩次，離心分離，將得到的磁珠以結(jié)合緩沖液重懸保存。2)體系P5的制備采用深圳華因康基因科技有限公司的KEOOl乳濁液制備試劑盒，根據(jù)使用說明制備乳池液體系首先對油相制備試劑以螺旋劇烈振蕩進行混勻，置于室溫30min，得到用于制備乳濁液體系的油相體系；利用步驟I)得到的磁珠懸浮液制備PCR Mix水相體系，以150 ii L為例，該水相體系如下ddH20 113. 4u L ；IOXPCR buffer (650mM Tris-HCl, pH8. O ；160mM(NH4)2SO4 ；IOmMDTT ；llmM MgCl2)15u L ；50mM MgSO4 3 U L ；IOmM dNTP 3u L ；未生物素化的F3 (IOOiiM) 0. 3 U L ；未生物素化的R3 (IOOiiM) 0. 3 U L ；步驟I)得到的磁珠懸浮液6 ii L ;5U/ii L DNA Taq 酶9 ii L ;將上述成分混勻，制備成PCR Mix水相體系。將制備好的油相體系與水相體系按照4 I的比例放入EP管中混合，同時加入輔助混勻的鋼珠，將EP管置于乳濁液制備儀上夾緊，按照15HZ，10s，再轉(zhuǎn)換17HZ，8s進行振蕩混勻，制備成用于單分子擴增的乳濁液體系P5。ニ、EPCR 擴增采用EPCR單分子擴增技術(shù)對上述建立的乳濁液體系(Pl、P2、P3、P4、P5)分別進行擴增。其中，各體系進行EPCR的反應(yīng)流程和方法，以及EPCR擴增反應(yīng)結(jié)束后的破乳釋放均如之前實施例的步驟三中所述，在此不再贅述。為比較磁珠在擴增反應(yīng)中的利用效率，分別將各反應(yīng)體系中破乳釋放并經(jīng)過清洗的磁珠懸浮液平均分為兩部分，保留其中的一半，對其中的一半進行富集回收操作，以大體積的塑料珠(40 50iim)作為富集微珠對擴增產(chǎn)物進行富集，得到富集產(chǎn)物。其中，富集微珠上固定有捕獲探針(SEQ ID NO 9) 富集之前，利用富集微珠與類似之前步驟2中表面只固定了少量乃至只有一個模板序列的磁珠混合，發(fā)現(xiàn)只有很少數(shù)磁珠被富集出來，因此在富集過程中，可認(rèn)為表面沒有結(jié)合擴增產(chǎn)物而只有原來固定的模板序列的磁珠對擴增產(chǎn)物的富集結(jié)果影響不大，在可接受的誤差范圍之內(nèi)。富集結(jié)束后，利用Thermo Scientific的Nanodrop DRlOOO對各反應(yīng)體系的富集產(chǎn)物以及相當(dāng)于各體系富集時的相同量Myone磁珠原液進行吸光度測量。首先將Myone磁珠原液進行梯度稀釋后檢測，測得一條磁珠濃度與260nm處吸光度OD26tl的關(guān)聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)直線圖。然后再對各反應(yīng)體系中的富集產(chǎn)物進行OD26tl測量，分別得到OD26tlI、0D26Q2、0D26(i3、0D26Q4和0D26(I5，將測得的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)直線進行比對，得到各體系經(jīng)過富集后得到的磁珠相對數(shù)量，進而可以得到各體系中富集產(chǎn)物與磁珠原液的濃度比值。
本實施例中，得到的數(shù)據(jù)表明，體系Pl中富集產(chǎn)物與磁珠原液的比值為48. 6%，從上述實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果分析可以得知，使用本發(fā)明所述的技術(shù)方案進行擴增和測序，可以增加固相載體表面結(jié)合擴增產(chǎn)物的數(shù)量，提高固相載體的利用效率，降低成本；測序時可以提高測序的檢測信號，降低對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下能提高測序的準(zhǔn)確性。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明典型的應(yīng)用但不限于基于固相載體進行擴增及進行核酸測序，任何其他類似的應(yīng)用均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所 作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于固相載體進行擴增的方法，所述固相載體的表面固定有至少ー個模板序列，其特征在于，所述方法包括以下步驟 A.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體； B.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得到擴增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，步驟A所述引物包括用于對所述模板序列進行擴增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是與模板序列5’端互補結(jié)合的核酸序列，所述下游引物是與模板序列3’端序列相同的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在干，步驟B中所述的擴增方式是單分子擴增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，所述單分子擴增方式包括乳液PCR擴增、滾環(huán)擴增和橋式PCR擴增的任ー種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，所述引物結(jié)合于固相載體表面的方式為 引物與固相載體表面攜帯的基團進行配對連接，實現(xiàn)直接結(jié)合； 或通過連接子攜帯的基團分別與引物和固相載體表面攜帯的基團進行配對連接，實現(xiàn)間接結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，所述配對連接的方式采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/碘こ酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少ー種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，所述固相載體的材質(zhì)采用玻璃、硅膠、陶瓷、塑料和金屬中的至少ー種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，在步驟A之前還包括步驟 AO.將模板序列通過基團配對方式結(jié)合于固相載體表面，得到固定有至少ー個模板序列的固相載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于 所述引物及模板序列與固相載體采用不同的基團配對進行結(jié)合，所述固相載體表面或連接子帶有至少兩種基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于固相載體進行擴增的方法，其特征在于，步驟B之后還包括步驟 B’ .對擴增產(chǎn)物進行純化回收。
11.一種基于固相載體進行核酸測序的方法，所述固相載體固定有至少ー個模板序列，其特征在于，所述核酸測序的方法包括以下步驟 A.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體； B.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得到擴增產(chǎn)物； C.根據(jù)堿基互補原則對擴增產(chǎn)物進行核酸測序，得核酸序列信息。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基于固相載體進行核酸測序的方法，其特征在干，步驟A中所述引物包括腫瘤類易感基因引物、心血管疾病類易感基因引物、營養(yǎng)指導(dǎo)基因引物和單基因疾病檢測引物中的任ー種。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基于固相載體進行核酸測序的方法，其特征在于，所述步驟C包括以下步驟 Cl.將擴增產(chǎn)物變性形成單鏈，得固定于固相載體的單鏈核酸片段； C2.根據(jù)堿基互補原則對單鏈核酸片段進行核酸測序，得核酸序列信息。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的基于固相載體進行核酸測序的方法，其特征在于，所述核酸測序的方法是大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的基于固相載體進行核酸測序的方法，其特征在于，所述大規(guī)模循環(huán)平行測序的方法為基于聚合酶合成為基礎(chǔ)的合成測序法，或者是基于絡(luò)合連接為基礎(chǔ)的連接測序法。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，提供一種基于固相載體進行擴增及進行核酸測序的方法。所述固相載體表面固定有至少一個模板序列，所述方法包括以下步驟A.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體；B.對擴增載體上的模板序列進行擴增，得到擴增產(chǎn)物。該方法基于表面固定有模板序列的固相載體進行擴增，能夠?qū)U增產(chǎn)物固定于固相載體表面，提高固相載體表面的擴增產(chǎn)物結(jié)合量；同時，利用該擴增方法得到的固相載體進行測序，能增強測序的檢測信號，降低對檢測儀器的要求，在同等檢測條件下提高測序的準(zhǔn)確性。
文檔編號C12N15/10GK102604934SQ201210093518
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼