專利名稱：一種針對(duì)hUHRF1基因RNA干擾的重組慢病毒載體及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)，生物醫(yī)藥及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及針對(duì)hUHRFl (human ubiquitin-like protein containing PHD and RING domain I)基因的RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-hUHRFl)及其制備。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素造成，多步驟多階段發(fā)展的過程，基因組的不穩(wěn)定性或者是染色體數(shù)量上的改變(非整倍體)、染色體異位、基因擴(kuò)增等等是癌變細(xì)胞的重要特征。最新的研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組約25，000個(gè)基因中大約有350個(gè)基因?yàn)榘┗?。其中僅有極少一部分的功能已經(jīng)有所研究，而大部分功能未知的基因有待進(jìn)ー步的研究。hUHRFl基因位于人類染色體19pl3. 3上，由2，327個(gè)bp組成，含有18個(gè)外顯子，ー個(gè)2. 4kb大小的cDNA,編碼793個(gè)氨基酸,其結(jié)構(gòu)包括N端的類泛素(ubiquitin-like)模式，一個(gè)亮氨酸拉鏈模式(leucine zipper motif), PHD類型的鋅指模式(Zinc fingermotif of PHD finger type), SRA-YDG 結(jié)構(gòu)域和 C 端的環(huán)狀鋒指模式(Zinc finger motifof RING finger type)，在兩個(gè)鋅指模式中含有序列，即ー個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)，ー個(gè)cyclinA/E-⑶K2磷酸位點(diǎn)，兩個(gè)RB結(jié)合部位。hUHRFl是首先被克隆作為與細(xì)胞生長有關(guān)的核蛋白基因，并可能與細(xì)胞周期循環(huán)有密切的相關(guān)。目前，有關(guān)UHRF家族成員功能的研究主要集中在mUHRFl，已有的研究報(bào)道顯示mUHRFl基因具有參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定性等功能，最近研究發(fā)現(xiàn)，mUHRFl基因可能是與放射敏感性有關(guān)的新基因，因?yàn)榻档团咛ゼ?xì)胞HEK293中mUHRFl的表達(dá)，可以使細(xì)胞對(duì)X射線和紫外線的輻射敏感性明顯增加。hUHRFl與mUHRFl的蛋白序列存在73. 7%的同源性，提示hUHRFl基因可能也同樣具有調(diào)節(jié)胚胎細(xì)胞輻射敏感性的作用。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)是抑制基因表達(dá)的常用手段，又叫基因沉默。RNA干擾的原理是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA吋，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。RNA干擾過程主要有兩個(gè)步驟一、雙鏈RNA被細(xì)胞源性雙鏈RNA特異性的核酸酶切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，即小干擾RNA(smallinterference RNA, siRNA) ;ニ、siRNA的反義鏈與核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC),該復(fù)合體具有識(shí)別結(jié)合與小干擾RNA有同源序列的mRNA，并在特異位點(diǎn)將該mRNA切斷。RNA干擾技術(shù)目前在基因治療及研究中得到了廣泛的應(yīng)用，同時(shí)那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA本身可以進(jìn)一步開發(fā)成為RNAi藥物。shRNA(short hairpin RNA)即短發(fā)夾RNA包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列，其中ー個(gè)與目的基因互補(bǔ)，中間loop序列分隔組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表達(dá)。但是要將該技術(shù)應(yīng)用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)及表達(dá)效率等重要問題。目前基因治療的載體主要有非病毒載體及病毒載體，然而非病毒載體無法滿足長時(shí)間的表達(dá)，這ー缺陷無疑被病毒載體填補(bǔ)。近年來慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在研究中已經(jīng)取得了良好的開端。慢病毒載體(lentivirus-based vector, LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的ー種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但又有不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的組分特性，該病毒既可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞又可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。病毒基因組可以整合宿主中，使得基因長時(shí)間穩(wěn)定的表達(dá)，并且慢病毒具有較低的免疫源性，這使得慢病毒成為RNA干擾的最佳載體，目前廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控，基因治療等領(lǐng)域。本發(fā)明選用第三代復(fù)制缺陷型慢病毒載體是自殺性(self-inactivating, SIN)病毒,在體內(nèi)可以較長期的表達(dá)且安全性高,能很好的解決RNA干擾技術(shù)基因治療的靶向性、安全性、整合效率等問題。因此慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾效應(yīng)在靶細(xì)胞內(nèi)長期存在，可為更好發(fā)揮干擾作用創(chuàng)造條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供一種針對(duì)hUHRFl基因RNA干擾的重組慢病毒載體，該載體是自身失活的第三代慢病毒載體SIN，其特征在于，所述的載體SIN含有pGCSIL-GFP/U6-ShhUHRFl重組載體，所述的pGCSIL_GFP/U6_ShhUHRFl重組載體是在pGCSIL-GFP載體的 多克隆位點(diǎn)中連接了雙鏈DNA片段；所述的雙鏈DNA片段的序列為以下序列中的ー種(其中S代表正義鏈，AS代表反義鏈)(l)hUHRFl-homo-704 hUHRFl-homo-704-S 5 ’ -GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-704-AS 5，-AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，(2) hUHRFI-homo-1766 hUHRFl-homo-1766-S 5， -GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1766-AS 5， -AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3) hUHRF I-homo-1984 hUHRFl-homo-1984-S 5，-GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1984-AS 5， -AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供所述的針對(duì)hUHRFl基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，根據(jù)hUHRFlmRNA序列，設(shè)計(jì)合成了雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種(l)hUHRFl-homo-704 hUHRFl-homo-704-S 5， -GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-704-AS 5， -AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，(2)hUHRFI-homo-I766
hUHRFl-homo-1766-S
5-GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3’h UHRFl-homo-1766-AS 5， -AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3) hUHRF I-homo-1984 hUHRFl-homo-1984-S5， -GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1984-AS 5， -AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，然后將所述的DNA片段連接到pGCSIL-GFP載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建成pGCSIL-GFP/U6-Sh hUHRFl 重組載體；再將 pGCSIL_GFP/U6_Sh hUHRFl 重組載體、pHelperl. O、pHelper 2. O三種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，獲得所述的重組慢病毒載體。
作為優(yōu)選，在所述的雙鏈DNA片段末端引入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)。作為優(yōu)選，用BamH I和EcoRI酶將pGCSIL-GFP載體酶切，回收大片段后將其與所述雙鏈DNA片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取重組陽性克隆。該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能特異性降低hUHRFl基因的表達(dá)，從而可能應(yīng)用于基因治療或基因功能研究。本發(fā)明提供的LV-sh-hUHRFl最重要特征在于提供靶向性hUHRFl基因抑制效應(yīng)，并用重組慢病毒載體作為載體，使得干擾效果得到持續(xù)性作用。整個(gè)制備過程全部使用質(zhì)粒，避免傳統(tǒng)方法腺病毒污染。本發(fā)明通過篩選最有效hUHRFl干擾序列，合成其雙鏈DNA，連接到慢病毒骨架質(zhì)粒載體中，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T細(xì)胞，制備出hUHRFl干擾重組慢病毒載體LV-sh-hUHRFl。本發(fā)明的有益之處是I、本發(fā)明采用的pGCSIL-GFP載體含有U6啟動(dòng)子，能夠在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)有干擾作用的小RNA。同時(shí)該質(zhì)粒能表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白GFP，方便病毒包裝時(shí)轉(zhuǎn)染效率，以及感染宿主細(xì)胞的感染效率的檢測。pHelper I. O質(zhì)粒中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2. O質(zhì)粒中含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白。將以上三種載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞能高效組裝自身失活的第三代慢病毒載體(SIN)，増加了兩個(gè)安全特性其一構(gòu)建了自身失活(SIN)的慢病毒載體，即刪除了 U3區(qū)的3’LTR，使載體失去HIV-I增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA。第二個(gè)特點(diǎn)是去除了 tat基因代之以異源啟動(dòng)子序列，這樣原始的HIV基因，組中的9個(gè)基因在構(gòu)建的HIV慢病毒載體中只保留了 3個(gè)(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒載體系統(tǒng)更加安全。2、本發(fā)明針對(duì)hUHRFl靶基因根據(jù)在線原則設(shè)計(jì)出四個(gè)有效干擾序列，通過重組的慢病毒干擾載體系統(tǒng)構(gòu)建包裝獲得LV-sh-hUHRFl，通過檢測靶細(xì)胞中hUHRFl基因mRNA表達(dá)水平，篩選出最有效干擾片段，不僅克服非病毒載體的低轉(zhuǎn)染效率，也避免了重組腺病毒產(chǎn)生的免疫原性，表達(dá)時(shí)間較短等缺點(diǎn)，能整合到宿主的基因組中并穩(wěn)定表達(dá)，不會(huì)導(dǎo)致插入失活，使得干擾作用更加持續(xù)，具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長時(shí)程表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，為有關(guān)hUHRFl基因的進(jìn)ー步研究奠定良好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并能廣泛用于體內(nèi)基因治療及基因功能研究。


圖I為慢病毒骨架質(zhì)粒pGCSIL-GFP載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為LV-sh-hUHRFl病毒感染MCF-7細(xì)胞72h后對(duì)hUHRFl基因表達(dá)干擾效果圖片。陰性對(duì)照組，加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組樣品；hUHRF I-homo-704 組，加 hUHRF I-homo-704 病毒感染的細(xì)胞組樣品；hUHRFl-homo-1615 組，加 hUHRFl-homo-1615 病毒感染的細(xì)胞組樣品；hUHRFl-homo-1776 組，加 hUHRFl-homo-1776 病毒感染的細(xì)胞組樣品；hUHRF I-homo-1984 組，加 hUHRF I-homo-1984 病毒感染的細(xì)胞組樣品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)ー步的說明。實(shí)施例I :針對(duì)基因hUHRFl的慢病毒載體構(gòu)建I、寡核苷酸的設(shè)計(jì)及合成利用Invitrogen公司的在線RNAi系列設(shè)計(jì)軟件BLOCK-iT RNAi Designer,設(shè)計(jì)針對(duì)hUHRFl基因mRNA序列(ΝΜ_001048201)的4個(gè)干擾靶序列(參見下表)，并合成相應(yīng)的雙鏈DNA (上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。LV3-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)。正義鏈模板的5’端添加了 GATCC，與BamHI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5’端添加了 AATTC，與EcoRI酶切后形成的粘端互補(bǔ)。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)hUHRFl基因RNA干擾的重組慢病毒載體，該載體是自身失活的第三代慢病毒載體SIN，其特征在于，所述的載體SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh hUHRFl重組載體，所述的pGCSIL-GFP/U6-ShhUHRFl重組載體是在pGCSIL_GFP載體的多克隆位點(diǎn)中連接了雙鏈DNA片段；所述的雙鏈DNA片段的序列為以下序列中的ー種(1)hUHRFl-homo-704hUHRFトhomo-704-S 5，-GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-704-AS 5，-AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，(2)hUHRFI-homo-I766hUHRFトhomo-1766-S 5，-GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1766-AS 5，-AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3)hUHRFI-homo-I984hUHRFトhomo-1984-S 5，-GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-1984-AS 5，-AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，。
2.權(quán)利要求I所述的針對(duì)hUHRFl基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，根據(jù)hUHRFlmRNA序列，設(shè)計(jì)合成了雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的ー種(1)hUHRFl-homo-704hUHRFトhomo-704-S 、 5，-GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-704-AS 、5，-AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，、(2)hUHRFI-homo-I766hUHRFトhomo-1766-S 、、5，-GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1766-AS 、5，-AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3)hUHRFI-homo-I984hUHRFトhomo-1984-S 、 5，-GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-1984-AS 、 5，-AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，然后將所述的DNA片段連接到pGCSIL-GFP載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建成pGCSIL_GFP/U6_Sh hUHRFl重組載體；再將pGCSIL-GFP/U6-ShhUHRFl重組載體、pHelperl. 0、pHelper 2. O三種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，獲得所述的重組慢病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對(duì)hUHRFl基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，在所述的雙鏈DNA片段末端引入BamH I和EcoRI酶切位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對(duì)hUHRFl基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，用BamH I和Eco RI酶將pGCSIL-GFP載體酶切，回收大片段后將其與所述 雙鏈DNA片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取重組陽性克隆。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)hUHRF1基因RNA干擾的重組慢病毒載體及其制備。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了針對(duì)hUHRF1基因的ShRNA的慢病毒載體，將合成的針對(duì)ShRNA的DNA片段通過慢病毒載體介導(dǎo)，還與pHelper 1.0、pHelper 2.0兩種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，獲得重組慢病毒載體后，轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)針對(duì)hUHRF1基因的RNA干擾。采用的自身失活的第三代慢病毒載體(SIN)，具有安全可靠、可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長時(shí)程表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想載體。本發(fā)明的慢病毒載體，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7干擾效果達(dá)70-85％，因此本發(fā)明重組慢病毒載體為有關(guān)hUHRF1基因的進(jìn)一步研究奠定良好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并能廣泛用于體內(nèi)基因治療及基因功能研究。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102643860SQ20121009390
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者殷浩金 申請(qǐng)人:常熟市常福有機(jī)復(fù)合肥有限公司