專利名稱：一種檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種基于線粒體DNA T10609C單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒。
背景技術(shù)：
高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia, HAPC)是由高原低氧引起的以紅細(xì)胞過(guò)度代償性增生為主要特征的臨床綜合癥Velarde FL, Consensus statement on chronic and subacute high altitude diseases,《High Alt Med Biol》，2005,6 : 147-157。由于紅細(xì)胞異常增多，血液粘滯度顯著增高，微循環(huán)障礙，引起全身各臟器、組織廣泛損害，嚴(yán)重者可因血管栓塞而猝死。文獻(xiàn)報(bào)道，在海拔3000米 4700米高原地區(qū)，HAPC 的發(fā)病率為2. 43% 37. 5%，是高原居民中發(fā)病率最高、危害最大的的慢性高原病。HAPC 的發(fā)病具有明顯的種族差異和個(gè)體易感傾向，提示HAPC與遺傳因素有密切關(guān)系，Heights and haematology: the story of haemoglobin at altitude, ((Postgrad Med J)), 2007, 83 :148-151。高原環(huán)境影響機(jī)體的主要因素是缺氧，機(jī)體對(duì)高原低氧環(huán)境的習(xí)服也是圍繞著氧的攝取一運(yùn)輸一利用這條軸線來(lái)進(jìn)行的。線粒體是機(jī)體能量代謝的中心，是組織、細(xì)胞氧利用的關(guān)鍵場(chǎng)所，機(jī)體耗能的90%以上來(lái)自于線粒體的氧化磷酸化作用。線粒體作為細(xì)胞的‘動(dòng)力工廠’，在低氧引起細(xì)胞損傷和組織、細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的習(xí)服過(guò)程中的作用都是至關(guān)重要的高文祥，低氧大鼠腦線粒體體外轉(zhuǎn)錄活性的研究，《中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志》，2001 ； 17: 323- 326。因此，線粒體在HAPC的發(fā)生中起著重要的作用。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是一種新型的分子遺傳標(biāo)記,廣泛用于復(fù)雜疾病的易感性予頁(yè)測(cè)Kato, Mitochondrial DNA polymorphisms in bipolar disorder,《J Affect Disord)),2001,62: 151-164。高分辨率溶解曲線分析(high resolution melting analysis, HRM)是基于核酸的物理性質(zhì)，通過(guò)高分辨率的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料(LCGreen、SYTO 9和 Evagreen)與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況來(lái)實(shí)現(xiàn)的。不同SNP位點(diǎn)、雜合子與否等都會(huì)影響熔解曲線的形狀。因此，根據(jù)熔解曲線的形狀，HRM分析就能夠有效區(qū)分DNA的堿基變化，進(jìn)行基因分型。分型原理如下
(1)本技術(shù)方案在具有高分辨率的Rotor-gene6000 PCR-HRM儀上完成。軟件設(shè)置的程序包括兩個(gè)連續(xù)的部分，先通過(guò)PCR (聚合酶鏈反應(yīng))獲得含有待檢測(cè)突變位點(diǎn)DNA片段， 然后立即進(jìn)行HRM基因分型，經(jīng)儀器自帶軟件分析得出分型結(jié)果；
(2)檢測(cè)結(jié)果表明，熔解曲線形狀與危險(xiǎn)型對(duì)照DNA—致的待測(cè)樣本，其線粒體DNA 10609位點(diǎn)堿基為T ;熔解曲線形狀與保護(hù)型對(duì)照DNA —致的待測(cè)樣本，其線粒體DNA 10609位點(diǎn)堿基為C (見圖I)。HRM技術(shù)與傳統(tǒng)的基因分型手段相比有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)
(I)操作簡(jiǎn)單和目前的PCR技術(shù)基本一致，無(wú)需序列特異性探針，不受堿基位點(diǎn)局限，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，避免了交叉污染的可能性，對(duì)技術(shù)人員沒有特殊的專業(yè)要求。(2)高效靈敏度和特異性都非常高，達(dá)到近100%。(3)通量大而快依據(jù)儀器的情況,最多一次可以同時(shí)上樣384個(gè)樣本,并在60-90 分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。(4)廉價(jià)試劑與普通熒光定量PCR基本一致，并且HRM與PCR同時(shí)進(jìn)行，無(wú)需額外的試劑和儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于線粒體DNA T10609C單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，能用于高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感者的篩選，指導(dǎo)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的預(yù)防。通過(guò)對(duì)318例漢族高原紅細(xì)胞過(guò)度增多患者和253例移居高原漢族健康対照的線粒體DNA的第10609位點(diǎn)基因分型，結(jié)合外界環(huán)境因素進(jìn)行Logistic回歸分析，研究線粒體DNA多態(tài)性與高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的相關(guān)性，尋找出敏感可信的高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感生物遺傳標(biāo)記。步驟是先通過(guò)對(duì)50例高原紅細(xì)胞過(guò)度增多患者和50例移居高原漢族健康的線粒體DNA的全長(zhǎng)擴(kuò)增、測(cè)序，初歩提示線粒體DNA的10609位點(diǎn)可能與移居高原漢族的血紅蛋白濃度相關(guān)。然后放大樣本量，采用PCR-HRM技術(shù)對(duì)上述線粒體DNA位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，同時(shí)收集受試者的基本的生理指標(biāo)和生活習(xí)慣(年齡、體重指數(shù)、吸煙飲酒習(xí)慣、 移居高原的海抜高度和高原暴露時(shí)間等)，最后結(jié)合外界因素，采用Logistic回歸分析線粒體DNA 10609位點(diǎn)多態(tài)性與高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的相關(guān)性。結(jié)果表明，在排除外界因素的影響后，線粒體DNA 10609C是移居高原漢族高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的保護(hù)因素(P < 0.01， OR=O. 391，95%CI 0. 191-0. 800)。結(jié)論:線粒體DNA 10609C是高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的保護(hù)因素，線粒體DNA 10609T是高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的危險(xiǎn)因素，線粒體DNA 10609位點(diǎn)多態(tài)性可以作為高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的遺傳易感標(biāo)志。因此，基于該多態(tài)性位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，采用PCR-HRM技術(shù)檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的易感性。本發(fā)明所述的ー種檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑
試劑一，引物混合液IOOiil ;上游引物和下游引物各50 混合，終濃度均為IOpmol/
上游引物 F :5’ -CTAGTATATCGCTCACACCTCA-3’，
下游引物 R:5’ -GGCGGCAAAGACTAGTATGG-3’ ；
試劑ニ，PCR 反應(yīng)混合液 IOOOii I ;成分有 IXPCR buffer, 2. 0 mM MgC12, 200 mM dNTPs, Hotstar Taq酶，Evagreen染料，余量為蒸懼水。所述的ー種檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，還包括
試劑三，線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為T的對(duì)照基因組DNA 50 U 1，濃度為 20 ng/uI ；
試劑四，線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為C的對(duì)照基因組DNA 50iU，濃度為 20 ng/uI。本發(fā)明能用于平原漢族人進(jìn)入高原前對(duì)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感者的篩選，指導(dǎo)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的預(yù)防和治療，減輕慢性高原病的威脅，有利于進(jìn)入高原人群的健康; 該試劑盒使用簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速。


圖I是HRM分型原理圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的說(shuō)明。所述的基于線粒體DNA T10609C單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，包括以下分離包裝的試劑
試劑一，引物混合液IOOiil ;上游引物和下游引物各50 混合，終濃度均為IOpmol/ u I ;序列如下
上游引物 F :5’ -CTAGTATATCGCTCACACCTCA-3’，
下游引物 R:5’ -GGCGGCAAAGACTAGTATGG-3’ ；
試劑ニ，PCR 反應(yīng)混合液 IOOOii I ;成分有 IXPCR buffer, 2. 0 mM MgC12, 200 mM dNTPs, Hotstar Taq酶，Evagreen染料，余量為蒸懼水；
試劑三，線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為T的對(duì)照基因組DNA(危險(xiǎn)型)50 U 1， 濃度為20 ng/ ill ;
試劑四，線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為C的對(duì)照基因組DNA(保護(hù)型)50 U 1， 濃度為20 ng/ u I o試劑盒內(nèi)的PCR反應(yīng)相關(guān)試劑和Evagreen染料能在寶生物工程(大連)有限公司和Biotium公司購(gòu)買到，引物由深圳華大基因公司合成。線粒體DNA 10609位點(diǎn)多態(tài)性為T 或C的對(duì)照DNA來(lái)自于人體血液白細(xì)胞的基因組DNA (來(lái)自高原血庫(kù))，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證了其線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為T或C。試劑盒的使用說(shuō)明
第一歩，采用OMEGA公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)D3392-02)提取待測(cè)個(gè)體靜脈血白細(xì)胞基因組總DNA，然后用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量；
第二歩，PCR反應(yīng)體系配制，共配制三管
第一個(gè)PCR管為待測(cè)樣本，去待測(cè)個(gè)體的DNA 1111，試劑ー1111，試劑ニ 23 iil，混勻。第二個(gè)PCR管為危險(xiǎn)型對(duì)照DNA，取試試劑一 I iil，試劑ニ 23 iil，劑三I iil，混勻。第三個(gè)PCR管為保護(hù)型對(duì)照DNA，取試試劑一 I ，試劑ニ 23 ，劑四I ，混勻。第三步，將第二步的已經(jīng)混勻的三個(gè)PCR分別放入Rotor-gene 6000 PCR-HRM儀中，均按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)95°C變性2分鐘一(95°C變性15秒一58°C退火15秒 —72°C延伸15秒，熒光讀板)X重復(fù)40次一70°C至95 °C的HRM (升溫方式每0. 1°C維持2秒)
第四步，應(yīng)用Rotor-gene 6000 PCR-HRM儀自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)待測(cè)樣本的 HRM形狀與對(duì)照DNA的HRM的相似性，由軟件自動(dòng)分析出待測(cè)樣本線粒體DNA 10609位點(diǎn)的
5基因型。當(dāng)HRM形狀與試劑三相似時(shí)線粒體DNA 10609位點(diǎn)為T，為高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感個(gè)體；當(dāng)HRM形狀與試劑四相似時(shí)線粒體DNA 10609位點(diǎn)為C，見圖I。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑試劑一，引物混合液IOOiil ;上游引物和下游引物各50 混合，終濃度均為IOpmol/上游引物 F :5’ -CTAGTATATCGCTCACACCTCA-3’，下游引物 R :5’ -GGCGGCAAAGACTAGTATGG-3’ ；試劑ニ，PCR 反應(yīng)混合液 IOOOii I ;成分有 IXPCR buffer, 2. 0 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, Hotstart Taq 酶，Evagreen 染料，余量為蒸懼水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，還包括 試劑三，線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為T的對(duì)照基因組DNA50 U 1，濃度為 20 ng/uI ；試劑四，線粒體DNA 10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為C的對(duì)照基因組DNA 50 U 1，濃度為 20 ng/uI。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測(cè)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑試劑一，引物混合液100μl；上游引物和下游引物各50μl混合，終濃度均為10pmol/μl；試劑二，PCR反應(yīng)混合液1000μl；成分有1×PCRbuffer，2.0mMMgCl2,200mMdNTPs，HotstartTaq酶，Evagreen染料，余量為蒸餾水。還包括試劑三，線粒體DNA10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為T的對(duì)照基因組DNA50μl，濃度為20ng/μl；試劑四，線粒體DNA10609位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性為C的對(duì)照基因組DNA50μl，濃度為20ng/μl。本發(fā)明能用于平原漢族人進(jìn)入高原前對(duì)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多易感者的篩選，指導(dǎo)高原紅細(xì)胞過(guò)度增多的預(yù)防和治療，減輕慢性高原病的威脅，有利于進(jìn)入高原人群的健康；該試劑盒使用簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605089SQ20121009480
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者劉福玉, 蔣春華, 高鈺琪 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)