專(zhuān)利名稱(chēng)：基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，還涉及基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)和鱗翅目昆蟲(chóng)模式生物，在我國(guó)已經(jīng)有5000多年的飼養(yǎng)和馴化歷史。蠶絲業(yè)在歷史上一直與農(nóng)并茂，為中華民族經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和文化的弘揚(yáng)都做出了巨大貢獻(xiàn)。蠶絲擁有雍容典雅的光澤、輕盈舒適的觸感、良好的衣料懸垂性和曲線性、適中的吸水性以及對(duì)人體肌膚的親和性等固有的優(yōu)良特性，長(zhǎng)久以來(lái)都深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，蠶絲也因此而被譽(yù)為“纖維皇后”。目前我國(guó)絲綢エ業(yè)年總產(chǎn)值達(dá)1350億元，占紡織エ業(yè)總產(chǎn)值的10%以上；繭絲產(chǎn)量和出ロ量分別占世界總額的70%和80%以上，年創(chuàng)匯超過(guò)50億美元，是在國(guó)際市場(chǎng)上處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的特色產(chǎn)業(yè)。全國(guó)共有種桑養(yǎng)蠶農(nóng)戶2000多萬(wàn)戶，遍布20余個(gè)省區(qū)。蠶業(yè)是目前我國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中的重要組成部分，其年出口創(chuàng)匯額在農(nóng)產(chǎn)品中位居前列，是農(nóng)民收入的重要來(lái)源。蠶絲產(chǎn)業(yè)在解決“三農(nóng)”問(wèn)題，特別是增加農(nóng)民收入、調(diào)整農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)上發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。然而，作為ー個(gè)古老的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，蠶桑絲綢生產(chǎn)技術(shù)與水平最近60年來(lái)都處于ー個(gè)平臺(tái)期。蠶品種的強(qiáng)健性、絹絲品質(zhì)、產(chǎn)量等主要經(jīng)濟(jì)性狀差等品種資源問(wèn)題一直沒(méi)有取得重大的突破，蠶絲服裝易發(fā)黃、變皺等固有缺陷沒(méi)有得到根本的解決。品種資源更新遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上生產(chǎn)需要，蠶絲業(yè)整體生產(chǎn)效益低下。這主要是因?yàn)?)經(jīng)過(guò)上百年的挖掘，基于傳統(tǒng)育種手段的增產(chǎn)潛力已經(jīng)發(fā)揮到極致，加之自然條件的特殊性和局限性，目前已很難突破品種資源本身的局限?，F(xiàn)存的家蠶品種雖然種類(lèi)和數(shù)量頗多，但是其遺傳背景単一，相互之間的經(jīng)濟(jì)性狀和生物學(xué)性狀并沒(méi)有顯著的差異。家蠶品種經(jīng)過(guò)百年更迭，在經(jīng)濟(jì)性狀和生物學(xué)性狀上都沒(méi)有顯著的改進(jìn)。2)作為紡織纖維，蠶絲因其價(jià)格昂貴使得眾多消費(fèi)者望而止步，加之蠶絲具有易發(fā)黃、起皺的缺點(diǎn)，使其在各種紡織纖維中并不占有很大的市場(chǎng)份額。在蠶絲產(chǎn)業(yè)幾乎停滯不前的近幾十年中，棉、毛等紡織纖維的研究和利用進(jìn)展良好，各種人造纖維異軍突起，對(duì)蠶絲產(chǎn)業(yè)造成了比較大的沖擊。3)長(zhǎng)久以來(lái)，人類(lèi)馴化和飼養(yǎng)家蠶的主要目的是繅絲織綢，所以現(xiàn)存的家蠶品種幾乎都是千篇一律的多絲量品種，其繭絲的成分和特性基本上沒(méi)有什么區(qū)別。在蠶業(yè)科技日新月異的今天，蠶絲越來(lái)越多的作為ー種多功能的生物材料而被重新認(rèn)識(shí)。家蠶是研究鱗翅目昆蟲(chóng)的理想模式生物和重要的生物反應(yīng)器。家蠶遺傳學(xué)和生理學(xué)的早期研究成果為昆蟲(chóng)信息素、激素、解剖學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)等方面的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)做出尤為重要的貢獻(xiàn)；在家蠶基因組框架圖、家蠶基因組精細(xì)圖、家蠶基因芯片和遺傳變異圖相繼解析之后，家蠶基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究在現(xiàn)代昆蟲(chóng)生物學(xué)研究中也起著舉足輕重的作用。作為合成和分泌絲蛋白的唯一器官，家蠶絲腺是昆蟲(chóng)中蛋白質(zhì)合成能力最強(qiáng)的生物器官，一頭家蠶可生產(chǎn)純蛋白質(zhì)O. 5g以上。無(wú)論是在基礎(chǔ)研究，還是在藥物、化妝品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，提取或表達(dá)純化的蛋白都扮演著極其重要的角色。飼養(yǎng)ー頭蠶的成本不足I角錢(qián)，卻能吐O. 5g的絲蛋白，而如果能用基因工程手段讓家蠶吐出O. 5g純蛋白，這對(duì)于蠶絲產(chǎn)業(yè)、甚至生物產(chǎn)業(yè)都將產(chǎn)生革命性的推動(dòng)作用。也正是這ー奇特的生物學(xué)現(xiàn)象和應(yīng)用前景吸引著眾多生物學(xué)家自分子生物學(xué)發(fā)端以來(lái)就長(zhǎng)期致カ于家蠶絲蛋白的表達(dá)調(diào)控和家蠶生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)。要突破傳統(tǒng)育種的局限，獲得品種選育的革命性突破；徹底克服蠶絲的固有缺陷，恢復(fù)蠶絲的紡織纖維市場(chǎng)中生機(jī)；開(kāi)發(fā)新型多功能蠶絲材料，促進(jìn)單ー的蠶絲產(chǎn)業(yè)向更為廣闊的非絹絲產(chǎn)業(yè)擴(kuò)展，這些都是現(xiàn)代蠶業(yè)中亟須解決的關(guān)鍵問(wèn)題。在分子農(nóng)業(yè)時(shí)代，這些問(wèn)題的解決離不開(kāi)對(duì)家蠶重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的功能解析和遺傳改造。要最大程度的發(fā)揮家蠶在鱗翅目昆蟲(chóng)研究中的模式作用，推動(dòng)家蠶生物反應(yīng)器的進(jìn)ー步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，也離不開(kāi)轉(zhuǎn)基因、基因組編輯和遺傳改造等重要的分子工具。盡管轉(zhuǎn)基因和RNAi等目前廣泛應(yīng)用的分子改良工具在家蠶中已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用，但是轉(zhuǎn)基因和RNAi并不能徹底刪 除基因組的中的核酸序列，而目前能直接對(duì)家蠶內(nèi)源基因進(jìn)行編輯和改造的技術(shù)還未見(jiàn)報(bào)道，更沒(méi)有長(zhǎng)片段基因組序列刪除的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)及其應(yīng)用和該刪除系統(tǒng)的應(yīng)用，利用該刪除系統(tǒng)能夠在基因組中刪除目的基因長(zhǎng)片段，獲得遺傳變異大的品種，為育種提供豐富的遺傳資源。為實(shí)現(xiàn)上述目的，技術(shù)方案為
I.基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，所述刪除系統(tǒng)由剪切目的基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN和單鏈寡核苷酸ssODNs組成，所述內(nèi)切酶TALEN由剪切所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和剪切所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R組成；所述單鏈寡核苷酸ssODNs由所述目的基因的靶序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和距離所述靶序列上游或下游至少I(mǎi)個(gè)堿基的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸組成。進(jìn)ー步，所述靶序列為T(mén)(Nn)A的核苷酸序列，N為A，G，T和C中的任ー堿基，η為24至65之間的任一數(shù)字。進(jìn)ー步，所述目的基因?yàn)榧倚Q油蠶基因BmBlos2，所述靶序列如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。進(jìn)ー步，所述核酸酶TALEN-L如SEQ ID NO. 3所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述核酸酶TALEN-R如SEQ ID NO. 4所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。進(jìn)ー步，所述單鏈寡核苷酸ssODNs由所述靶序列的連續(xù)40個(gè)核苷酸和距離所述靶序列上游795個(gè)堿基的連續(xù)60個(gè)核苷酸組成。進(jìn)ー步，所述單鏈寡核苷酸ssODNs如SEQ ID NO. 17所示核苷酸。2.所述基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)在靶細(xì)胞基因組中改造目的基因的應(yīng)用。進(jìn)ー步，所述靶細(xì)胞為家蠶卵細(xì)胞。進(jìn)一步，所述目的基因?yàn)轷瓜阌拖慊駼tnBlos20本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用TALEN和ssODNs技術(shù)，通過(guò)TALEN具有特異剪切核酸靶序列的特點(diǎn)，在目的基因內(nèi)部設(shè)計(jì)含有識(shí)別靶序列的蛋白質(zhì)，并在識(shí)別靶序列蛋白質(zhì)的上游設(shè)置有核定位信號(hào)NLS和核酸酶FokI，使目標(biāo)蛋白能夠定位于細(xì)胞核中，并識(shí)別靶序列處通過(guò)核酸酶FokI發(fā)生剪切；同時(shí)還利用單鏈寡核苷酸ssODNs對(duì)核酸序列具有修復(fù)功能，通過(guò)ssODNs與靶序列上游或下游序列結(jié)合，在基因組中完成刪除和修復(fù)，最后能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)片段刪除，其操作簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)任意序列進(jìn)行刪除，還可以利用基因同源性原理同時(shí)實(shí)現(xiàn)多基因一次性刪除，能夠獲得遺傳變異大的品種，提供豐富的遺傳資源。


圖1顯示了家蠶油蠶基因ガ的結(jié)構(gòu)示意圖和剪切目的基因靶序列的內(nèi)切酶TALEN的識(shí)別位點(diǎn)，其中數(shù)字表示外顯子或內(nèi)含子的長(zhǎng)度，ATG和TAA分別表示起始和終止密碼子，下劃線表示TALEN的識(shí)別模塊。圖2顯示了家蠶油蠶基因ガ敲除以后家蠶的表型，其中WT表示野生型的家蠶個(gè)體，mutant表示突變體。圖3顯示了注射了 B3后產(chǎn)生的突變序列，其中a圖表示家蠶油蠶基因他 ガAxsJ的部分結(jié)構(gòu)示意圖，上方的箭頭表示PCR和測(cè)序引物的位置，b圖表示來(lái)自與不同蛾圈的突變個(gè)體的序列，以“〉”開(kāi)頭的標(biāo)識(shí)表示不同的蛾圈編號(hào)，是“Λ”、“Μ”和“I”分別表示缺失、堿基替換和插入，其后的數(shù)字表示缺失、替換或插入的堿基數(shù)，“X”及后面的數(shù)字表示相應(yīng)序列的條數(shù)，下劃線的序列為T(mén)ALEN的識(shí)別位點(diǎn)。圖4顯示了家蠶油蠶基因ガ的結(jié)構(gòu)示意圖和目的基因刪除結(jié)果。其中a圖顯示了家蠶油蠶基因み 5705^的結(jié)構(gòu)示意圖，黑線表示ssODNs的設(shè)計(jì)；b圖顯示了共注射后TALEN和ssODNs后的PCR結(jié)果，目的條帶的大小為556bp，底部的數(shù)字表示突變的效率。
具體實(shí)施例方式 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)描述。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中使用的家蠶品種為“N4”，由中國(guó)西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)提供。一、家蠶油蠶基因ガ序列分析
從silkDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載家蠶油蠶基因ガ 的序列(編號(hào)為BGIBMGA002101)。序列分析顯示該基因包括四個(gè)長(zhǎng)分別為180bp，131bp，112bp和608bp的外顯子以及三個(gè)長(zhǎng)分別為2465bp，663bp和2703bp的內(nèi)含子，第一外顯子包括125bp的非翻譯區(qū)和55bp的編碼區(qū)，其結(jié)構(gòu)如圖I所示。按照基因敲除的一般原則，該基因的第二和第三外顯子為理想的靶標(biāo)位點(diǎn)，本實(shí)施例以第二外顯子和第三外顯子為靶序列。ニ、第三外顯子TALEN序列的設(shè)計(jì)
根據(jù)家蠶油蠶基因ガ〃沿的序列特征，我們選擇第三外顯子上的序列作為T(mén)ALEN作用的靶序列，家蠶蠶油蠶基因BmBlos2第三外顯子核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，根據(jù)TALEN原理將結(jié)構(gòu)為T(mén)(Nn)A的核苷酸序列為T(mén)ALEN識(shí)別靶序列，其中N為A，G，T和C中的任ー堿基，η為24至65之間的任一數(shù)字。按照上述原理設(shè)計(jì)TALEN識(shí)別的靶位點(diǎn)為5’ -tcaccaagtacgcagatctaaggagcctagccgcgaacctgaacaagaccctta—3^ (SEQ 丄D NO. 2)，劃1 部分為T(mén)ALEN識(shí)別模塊，黑體部分表示間隔序列，其中5’端劃線核苷酸序列為5’端識(shí)別序列，對(duì)應(yīng)SEQ ID NO. 2所示的1-20位核苷酸，3’端劃線核苷酸序列為3’端識(shí)別序列，對(duì)應(yīng)SEQ ID NO. 2所示的36-54位核苷酸序列。分別將5’端識(shí)別序列和3’端識(shí)別序列按照A=NI, T=NG, G=NN, C=HD規(guī)律設(shè)計(jì)識(shí)別靶序列的蛋白質(zhì)的可變序列，并在蛋白質(zhì)上游偶聯(lián)核定位信號(hào)NLS，下游偶聯(lián)核酸酶FokI，分別得到由核定位信號(hào)NLS、識(shí)別5’端識(shí)別序列的蛋白質(zhì)和核酸酶FokI依次串聯(lián)組成的核酸酶TALEN-L和由核定位信號(hào)NLS、識(shí)別3’端識(shí)別序列的蛋白質(zhì)和核酸酶FokI依次串聯(lián)組成核酸酶TALEN-R。根據(jù)核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的氨基酸序列設(shè)計(jì)編碼核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的核苷酸序列，編碼核酸酶TALEN-L的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其中第82-102位核苷酸編碼核定位信號(hào)NLS，第120-2826位核苷酸編碼識(shí)別5’識(shí)別序列的蛋白質(zhì)，第2833-3420位核苷酸編碼內(nèi)切核酸酶FokI，編碼核酸酶TALEN-R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，其中第76-96位核苷酸編碼核定位信號(hào)NLS，第114-2820位核苷酸編碼識(shí)別3 ’識(shí)別序列的蛋白質(zhì)，第2826-3414位核苷酸編碼核酸酶FokI。三、編碼TALEN-L 和 TALEN-R 的 mRNA 的制備
分別人工合成編碼核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的核苷酸序列(SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4)，再用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI雙酶切后連接經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pET28a，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒對(duì)，命名為pET28a-B3L和pET28a_B3R。將所得重組質(zhì)粒對(duì)分別用Xho I酶切消化后用MessageMax T7 mRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Epicentre)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,體外轉(zhuǎn)錄條件為■ 在溫度為37°C條件下孵育30分鐘，加IuL DNA酶，再繼續(xù)孵育15分鐘。然后將反應(yīng)液用Epicentre A-plus加尾試劑盒(購(gòu)自Epicentre)進(jìn)行加A反應(yīng)，反應(yīng)條件為在溫度為37°C條件下孵育30分鐘，然后用MEGAClear試劑盒(購(gòu)自Ambion)進(jìn)行純化，得編碼核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的mRNA,將所得核酸酶TALEN-L的mRNA和核酸酶TALEN-R的mRNA混合物命名B3，于_80°C保存?zhèn)溆谩Ｋ?、B3顯微注射
選擇多化性家蠶品種“N4”，在溫度為25°C、相対濕度75%±5%、光周期為12小時(shí)光照+12小時(shí)黑暗的條件下中，用桑葉飼養(yǎng)。羽化后收集同時(shí)化蛾的雌雄蠶蛾，在溫度為25°C、光強(qiáng)為5(Γ155 μ mol/m2/s的條件下交配4小時(shí)后拆對(duì)，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上產(chǎn)卵，所得蠶卵直接用于顯微注射。用濃度為T(mén)OOng/yL的B3用顯微注射儀(FemtoJet5247顯微注射儀，購(gòu)自Eppendorf)注射所得蠶卵中的521粒蠶卵，每粒蠶卵注射量約IOnL0注射后的蠶卵用無(wú)毒膠水封住注射ロ，并用體積百分比為35%的甲醛蒸氣中消毒5分鐘，置于25°C、相対濕度為85%、光周期為12小時(shí)光照+12小時(shí)黑暗的環(huán)境中催青孵化，將孵化的GO代蟻蠶人工飼料收集飼養(yǎng)至化蛾。五、突變個(gè)體篩選
在521粒注射蠶卵中，經(jīng)人工飼養(yǎng)獲得126頭五齡幼蟲(chóng)，其中28頭表現(xiàn)出嵌合體的表型，如圖2所示。將獲得的126個(gè)GO代蠶蛾，通過(guò)自交或回交獲得41蛾圈Gl代蠶卵，將41個(gè)蛾圈催青并單獨(dú)飼養(yǎng)至Gl代三齡幼蟲(chóng)觀察，在其中的6個(gè)蛾圈中發(fā)現(xiàn)277頭具有表型為油蠶的家蠶突變體。六、可遺傳突變個(gè)體的測(cè)序分析
選取表型為油蠶的家蠶突變體51個(gè)，提取基因組，選取選取突變位點(diǎn)附近序列設(shè)計(jì)PCR 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 引物上游引物為 B3-F364 :5，-tccaatttgagggcaatgctac-3’(SEQ ID NO. 5),下游引物為 B3-R315 :5，-atttcaccacctcattcaactaagat-3，(SEQ IDNO. 6) ;PCR 擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性 4 min ;94°C變性 30s，59。。退火 30s，72。。延伸 45s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。同時(shí)選取突變位點(diǎn)附近序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，測(cè)序引物如SEQID NO. 6所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)、純化，然后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明所選取的51個(gè)家蠶突變個(gè)體在第三外顯子靶序列處均發(fā)生了突變，突變包括變異、缺失或小片段的插入，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. 7-16，部分結(jié)果如附圖3所示。
七、ssODNs序列的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)第三外顯子靶序列和刪除片段上游序列即第二外顯子，設(shè)計(jì)一條單鏈寡核苷酸(Single-stranded oligonucleotides, ssODNs), ssODNs 由第三外顯子革巴序列的 3’ 識(shí)別序列和距離3’識(shí)別序列上游792位的60個(gè)連續(xù)核苷酸組成，具體序列為5’-tgtCaCCgagCtgttcgagtttcgaagtcctggatccacatgatcctgtgatcagtcggtgccgcgaacctgaacaagacccttaatgaatacaacgaga-S^SEQ ID NO. 17)，其中1_60位核苷酸為刪除片段上游序列和61-100位核苷酸為根據(jù)TALEN切割位點(diǎn)下游序列構(gòu)成，下劃線部分為轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN的3’端識(shí)別位點(diǎn)。ノV、ssODNs和B3的顯微共注射
利用上述制備蠶卵的方法制備蠶卵，取402粒蠶卵進(jìn)行顯微注射，具體為用濃度為700ng/l·! L的B3與濃度為IOOmM的ssODNs按體積比為I :1混合，然后用顯微注射儀(FemtoJet 5247顯微注射儀，Eppendorf )注射，每粒蠶卵注射量約10nL。注射后的蠶卵用無(wú)毒膠水封住注射ロ，并用體積百分比為35%的甲醛蒸氣中消毒5分鐘，然后置于25°C、相対濕度85%的高濕度環(huán)境中催青孵化，孵化得到61頭GO代蟻蠶，經(jīng)人工飼料收集共得到35頭五齡蠶,其中I頭表型為嵌合體(部分表皮表現(xiàn)出透明的表型，部分表皮為正常的乳白色)，為突變體。提取所得嵌合突變體和20頭表現(xiàn)正常的個(gè)體的基因組設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 引物上游引物為 5’-ttggtccagtaggtttgaagtaggt_3’ (SEQ ID NO. 18),下游引物如SEQ ID NO. 10 ;PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4 min ;94°C變性30s，59で退火30s，72で延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min, PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測(cè)所得PCR條帶為556bp，與未發(fā)生突變的1351bp相比，目的基因中刪除了 795bp片段，由此可知，嵌合體表型的家蠶個(gè)體中發(fā)生了長(zhǎng)片段刪除，刪除序列為目的基因在ssODNs的缺失部分，其比例為2. 2%，結(jié)果如圖4所示。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，其特征在于所述刪除系統(tǒng)由剪切目的基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN和單鏈寡核苷酸ssODNs組成，所述內(nèi)切酶TALEN由剪切所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和剪切所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R組成；所述單鏈寡核苷酸ssODNs由所述靶序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和距離所述靶序列上游或下游至少I(mǎi)個(gè)堿基的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，其特征在于所述靶序列為T(mén)(Nn)A的核苷酸序列，N為A, G, T和C中的任一堿基，η為24至65之間的任一數(shù)字。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，其特征在于所述目的基因?yàn)榧倚Q油蠶基因他沿AxsJ ，所述靶序列如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，其特征在于所述核酸酶TALEN-L如SEQ ID NO. 3所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述核酸酶TALEN-R如SEQ ID NO. 4所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，其特征在于所述單鏈寡核苷酸ssODNs由所述靶序列的連續(xù)40個(gè)核苷酸和距離所述靶序列上游795個(gè)堿基的連續(xù)60個(gè)核苷酸組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，其特征在于所述單鏈寡核苷酸ssODNs如SEQ ID NO. 17所示核苷酸。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)在靶細(xì)胞基因組中改造目的基因的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述靶細(xì)胞為家蠶卵細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的基因?yàn)榧倚Q油蠶基因BmBlos ο
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了基于TALEN和ssODNs的基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)，由剪切目的基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN和單鏈寡核苷酸ssODNs組成；該系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確識(shí)別結(jié)構(gòu)為T(mén)(Nn)A的靶序列，并在基因組中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段刪除，還公開(kāi)了基因組長(zhǎng)片段刪除系統(tǒng)的應(yīng)用，具有刪除效率高，徹底改變基因組遺傳信息，獲得遺傳變異大的品種，為育種提供豐富的遺傳資源。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102618528SQ201210095048
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者夏慶友, 張圣欞, 徐漢福, 馬三垣 申請(qǐng)人:西南大學(xué)