專利名稱：蘋(píng)果種質(zhì)資源改良tp-m13-ssr分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及果樹(shù)分子生物學(xué)技術(shù)，具體地說(shuō)是蘋(píng)果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
蘋(píng)果屬(Mains Mill.)種質(zhì)資源豐富，品種類(lèi)型多祥，包括大量的野生種、半野生種及栽培品種。蘋(píng)果種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定是種質(zhì)資源保存和利用的前提，以往主要利用形態(tài)學(xué)觀察、同エ酶等方法進(jìn)行鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在蘋(píng)果種質(zhì)資源的研究中也得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。
自Litt和Luty首次將SSR技術(shù)(simple sequence repeat,即簡(jiǎn)單序列重復(fù)又稱微衛(wèi)星)用于進(jìn)行人類(lèi)遺傳學(xué)研究以來(lái)，SSR技術(shù)因多態(tài)性高、分布廣、重復(fù)性好、共顯性以及成本較低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，也因此而被應(yīng)用到蘋(píng)果種質(zhì)資源的鑒定中。傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物檢測(cè)采用的聚丙烯酰胺凝膠電泳技木，分析通量較低、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄的工作量過(guò)大。而熒光測(cè)序技術(shù)即毛細(xì)管電泳技術(shù)在SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)上的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和處理的自動(dòng)化，克服了銀染法的不足。但其ー個(gè)重要限制因素即是其成本過(guò)高，一旦實(shí)驗(yàn)需要增加另外的SSR位點(diǎn)時(shí)，又必須得重新合成新增位點(diǎn)的熒光引物，該技術(shù)也僅僅在少量材料和較少位點(diǎn)的研究中應(yīng)用較多。TP-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)是將SSR分子標(biāo)記技術(shù)、突光測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的聞通量、低成本的高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，如何能將兩次PCR程序合并為一次，不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系中，則可減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，并且可以進(jìn)一步的提聞實(shí)驗(yàn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
為了能夠?qū)P-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)中不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系中，井能將兩次PCR程序合并為一次，盡可能地減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)ー步的提高實(shí)驗(yàn)效率。本發(fā)明提出了蘋(píng)果種質(zhì)資源改良的TP-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的方案是
I、提取蘋(píng)果基因組DNA，并稀釋到20 ng/yL。2、SSR突光標(biāo)記反應(yīng)
(I) TP-M13-SSR 反應(yīng)體系
模板 DNA 2. Oul ；
Mg2+ (25mM) 1. 62ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 I =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 2 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 3 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；同一熒光標(biāo)記的M13接頭1. 8 ul ；
Buffer(IOX) 2. 25ul ；dNTP (25 mM) :0. 18 ul ；
Taq (5u/ul) :0.24 ul ；ddH20 2. 95 ul ；
Total 15 ulο(2) PCR 程序
94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，An. T退火30s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；94°C變性308，53で退火308，72で延伸458，16個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;4°C保存。不同引物擴(kuò)增所需要的An. T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定在同一體系中的三對(duì)引物具有相同 的退火溫度。三對(duì)具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15 ul的反應(yīng)體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應(yīng)，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)三對(duì)TP-M13-SSR引物的PCR擴(kuò)增及同一顏色的熒光標(biāo)記。3、TP-M13-SSR標(biāo)記的熒光檢測(cè)
TP-Ml3-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，不同熒光顏色標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(最多四色)在毛細(xì)管電泳儀(如ABI3730)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。4、數(shù)據(jù)分析
電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genotyper兩套軟件進(jìn)行分析，自動(dòng)獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細(xì)管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標(biāo)記。積極效果不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為ー次，減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)ー步的提高實(shí)驗(yàn)效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物可同時(shí)在毛細(xì)管電泳儀上檢測(cè)，改良之前一次能夠檢測(cè)384X4共計(jì)1536個(gè)樣品，而現(xiàn)在一次最多可檢測(cè)384X3X4共計(jì)4608個(gè)樣品，一次可多檢測(cè)3072個(gè)樣品。進(jìn)ー步地提高TP-M13-SSR熒光標(biāo)記分析通量，并且減少了操作步驟，最大限度地減少了因檢測(cè)流程較多而造成的實(shí)驗(yàn)誤差。
具體實(shí)施例方式利用毛細(xì)管電泳儀，將毛細(xì)管電泳技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，建立改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法，其實(shí)驗(yàn)流程和具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下
I、提取蘋(píng)果基因組DNA，并稀釋到20 ng/yL。2、SSR突光標(biāo)記反應(yīng)
(I)TP-M13-SSR 反應(yīng)體系
模板 DNA 2. Oul ；
Mg2+ (25mM) 1. 62ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 I =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 2 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；TP-Ml3-SSR 引物 3 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
同一熒光標(biāo)記的M13接頭1. 8 ul ；
Buffer(IOX) 2. 25ul ；dNTP (25 mM) :0. 18 ul ；
Taq (5u/ul) :0.24 ul ；ddH20 2. 95 ul ；
Total 15 ulο(2) PCR 程序
94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，An. T退火30s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；94°C變性308，53で退火308，72で延伸458，16個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;4°C保存。不同引物擴(kuò)增所需要的An. T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定在同一體系中的三對(duì)引物具有相同的退火溫度。三對(duì)具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15 ul的反應(yīng)體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應(yīng)，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)三對(duì)TP-M13-SSR引物的PCR擴(kuò)增及同一顏色的熒光標(biāo)記。3、TP-M13_SSR標(biāo)記的熒光檢測(cè)
TP-Ml3-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，不同熒光顏色標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。4、數(shù)據(jù)分析
電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genotyper兩套軟件進(jìn)行分析，自動(dòng)獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細(xì)管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標(biāo)記。至此，一次毛細(xì)管電泳可檢測(cè)四次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，即可檢測(cè)4X3對(duì)TP-Ml3-SSR引物對(duì)384X 12共計(jì)4608個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增的熒光標(biāo)記產(chǎn)物，減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)一步的提聞實(shí)驗(yàn)效率?；驹硎前褦U(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度相差較大、但具有相同退火溫度的三對(duì)TP-M13-SSR引物放到同一 PCR體系中，添加具有相同熒光顏色M13接頭，采用兩套具有不同退火溫度的循環(huán)一次PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物的純化，利用毛細(xì)管電泳儀對(duì)其進(jìn)行熒光檢測(cè)，自動(dòng)獲取PCR產(chǎn)物數(shù)據(jù)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)蘋(píng)果種質(zhì)資源三對(duì)TP-M13-SSR引物的熒光標(biāo)記和檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.蘋(píng)果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法，利用毛細(xì)管電泳儀，將毛細(xì)管電泳技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，建立改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法，其特征是 實(shí)驗(yàn)步驟 1)、提取蘋(píng)果基因組DNA，并稀釋到20ng/yL； 2)、SSR突光標(biāo)記反應(yīng) (DTP-M13-SSR 反應(yīng)體系 模板 DNA 2. Oul ； Mg2+ (25mM) 1. 62ul ；TP-Ml3-SSR 引物 I =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；TP-Ml3-SSR 引物 2 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；TP-Ml3-SSR 引物 3 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ； 同一熒光標(biāo)記的M13接頭1. 8 ul ；Buffer(IOX) :2. 25ul ；dNTP (25 mM) :0. 18 ul ；Taq (5u/ul) :0.24 ul ；ddH20 2. 95 ul ；Total 15 ul ； (2)PCR 程序 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，An. T退火30s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；94°C變性308，53で退火308，72で延伸458，16個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ;4°C保存；不同引物擴(kuò)增所需要的An. T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定在同一體系中的三對(duì)引物具有相同的退火溫度； 三對(duì)具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15 ul的反應(yīng)體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應(yīng)，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)三對(duì)TP-M13-SSR引物的PCR擴(kuò)增及同一顏色的熒光標(biāo)記； 3)、TP-M13-SSR標(biāo)記的熒光檢測(cè) TP-Ml3-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，不同熒光顏色標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)； 4)、數(shù)據(jù)分析 電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genot yper兩套軟件進(jìn)行分析，自動(dòng)獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細(xì)管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提出的是蘋(píng)果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法。不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)一步的提高實(shí)驗(yàn)效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物可同時(shí)在毛細(xì)管電泳儀上檢測(cè)，改良之前一次能夠檢測(cè)384×4共計(jì)1536個(gè)樣品，而現(xiàn)在一次最多可檢測(cè)384×3×4共計(jì)4608個(gè)樣品，一次可多檢測(cè)3072個(gè)樣品。進(jìn)一步地提高TP-M13-SSR熒光標(biāo)記分析通量，并且減少了操作步驟，最大限度地減少了因檢測(cè)流程較多而造成的實(shí)驗(yàn)誤差。適宜作為蘋(píng)果種質(zhì)資源分類(lèi)的試驗(yàn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102653790SQ201210095250
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者劉鳳之, 劉立軍, 王大江, 王昆, 高源 , 龔欣 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所