專利名稱：一種去除污水中金屬鉻的基因的合成及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種去除污水中金屬Cr的基因的合成方法，屬于生物合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金屬鉻主要以三價(jià)和六價(jià)形式大量存在于工業(yè)廢水中，Cr ( VI)的毒性比Cr (III)高100多倍，由于鉻的毒性強(qiáng)，且不能被微生物降解，有可能在微生物的作用下轉(zhuǎn)化為金屬有機(jī)化合物，產(chǎn)生更大的毒性，通過食物鏈在生物體內(nèi)富集到相當(dāng)高的濃度，通過多種途徑吸入人體，嚴(yán)重威脅水生生物的生存和人類的健康，已經(jīng)成為各國治理廢水的重點(diǎn)。目前，對(duì)污染水體中鉻離子的處理技術(shù)有沉淀法、吸附法、離子交換法、微生物法、 鈦質(zhì)薄膜蒸發(fā)濃縮器法等。通常采用的是將毒性較大的Cr6+還原為毒性較小的Cr3+，然后通過沉淀法除去Cr3+。納米TiO2光催化法還原脫除水中絡(luò)離子，鉻離子的脫除率最高可達(dá)88. 41%，回收利用簡(jiǎn)單，但極易受pH的影響，對(duì)鉻離子的吸附不穩(wěn)定；稻草秸桿可將Cr(VI)從溶液中去除，且還可將其轉(zhuǎn)化成低毒的Cr，但受溫度、pH值的影響；以根霉吸附水體中的重金屬鉻，Cr(VI)的生物吸附不受溫度的影響，其去除率可達(dá)95%，但溶液的pH值會(huì)影響其吸附效果。然而這些技術(shù)都針對(duì)于含鉻污水排放之前工廠的內(nèi)部處理，對(duì)于被工廠處理過的低濃度含鉻廢水的生態(tài)凈化技術(shù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。其實(shí)，水生植物對(duì)水中的重金屬有吸附作用，可把水中的重金屬富集在植物的組織中，可以通過控制需凈化水體的物理、化學(xué)性狀，使植物能最有效地從水中吸收重金屬，降低水中的重金屬濃度，達(dá)到水體凈化的目的。假稻的根莖對(duì)Cr3+有較強(qiáng)的富集能力及耐受性，其對(duì)鉻的生物富集系數(shù)為57. 30 ;水葫蘆對(duì)污水中的鉻有很強(qiáng)的富集作用達(dá)到幾十萬倍；海藻對(duì)鉻的富集作用很強(qiáng)，其濃縮系數(shù)可達(dá)120000。但對(duì)于工廠達(dá)標(biāo)排放的低濃度含鉻廢水，目前還沒有一種能富集濃縮因子水平很高的生物，因此，我們有必要合成一種基因，將其應(yīng)用到水生植物中，能夠有效地富集污染水體中的低濃度鉻，從而有效地降低污染水體中的鉻含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)水生植物對(duì)達(dá)標(biāo)排放的低濃度含鉻廢水的富集濃縮因子水平不高，提供了一種基因的合成方法，將該耐鉻擬球蛋白基因注射到水體中槐葉萍的根部，使得槐葉萍能產(chǎn)生一種能與水體中的低濃度鉻結(jié)合能力相當(dāng)強(qiáng)的物質(zhì)，導(dǎo)致其對(duì)低濃度鉻具有富集濃縮作用，生物富集系數(shù)達(dá)到幾千或幾萬，從而把水環(huán)境中的低濃度鉻去除，解決了含鉻廢水的生態(tài)凈化問題。本發(fā)明所采用的原料為金魚藻、氯化鈣、氯化鉀、半知菌、魚孢菌、培養(yǎng)基，通過提取金魚藻中耐鉻基因片段、體外DNA重組、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選獲得含耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞，該蛋白基因細(xì)胞與氯化鈉以一定的質(zhì)量比，注射到水體中槐葉萍的根部，使得槐葉萍對(duì)鉻的生物濃縮達(dá)到幾千甚至幾萬，從而最大程度地去除水中低濃度鉻。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種富集污染水體中鉻的基因的合成方法，該方法采用金魚藻、氯化鈣、氯化鉀、半知菌、魚孢菌、培養(yǎng)基為原料，通過提取金魚藻中耐鉻基因片段、體外DNA重組、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選獲得含耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞，該蛋白基因細(xì)胞與氯化鈉以一定的質(zhì)量t匕,注射到水體中槐葉萍的根部。本發(fā)明中單胞球蛋白的生物制劑的合成過程
(I)培養(yǎng)基的制備
以質(zhì)量計(jì)，葡萄糖8 10g、磷酸氫二鉀0.2、.5g、硫酸鎂O. l、.2g、瓊脂l(Tl2g、氯化鈉O. 8 l.Og、硫酸鎂O. I、. 3g、磷酸氫二鉀O. 3、. 5g 牛肉膏5. (Γ6. Og 蛋白胨7. (TlO. Og;將上述物質(zhì)溶解，加蒸餾水定容至IOOOmL,分裝、在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)殺菌，殺菌條件為壓力105Kpa ;溫度120° C ;時(shí)間:20 30min，備用；
(2)耐鉻DNA片段提取
從金魚藻細(xì)胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，獲得耐鉻基因的DNA序列；
(3)體外DNA重組
從半知菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載體，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割形成開環(huán)質(zhì)粒，加入適當(dāng)?shù)腄NA連接酶，將耐鉻基因連接在質(zhì)粒環(huán)上，形成一個(gè)重組DNA分子；
(4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞與篩選
將重組得到的DNA導(dǎo)入用CaCl2處理的魚孢菌中，接種到15 20mL的培養(yǎng)基中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在37 37. 3° C，培養(yǎng)時(shí)間為15 18h ;再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的無菌離心管中，在4飛° C下以30(T350r/min的轉(zhuǎn)速離心2 3h，除去上層清液；再用3 5mL 0. ImoVLCaCl2溶液洗滌沉淀，靜置l(Tl5min，再4 6° C下以20(T400r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)35 45min，濾去上層清液，獲得細(xì)胞沉淀；并篩選含耐鉻基因的受體細(xì)胞，保存于4 6° C下備用。一種富集污染水體中低濃度鉻的基因的使用方法將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以體積比I :4 8溶解于0. 05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為0. 20g/L 0. 25g/L，注射4 6mL于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次，35 45天后檢測(cè)槐葉萍和水體中的鉻含量。本發(fā)明制備得到的耐鉻擬球蛋白基因，其特征在于，外觀為白色粉末狀，溶解度為99. 99%，半衰期為20天，給藥周期為5天，用量為0. 20g/L 0. 25g/L。本發(fā)明制備得到的耐鉻擬球蛋白基因，將其注射到水體中槐葉萍的根部，使得槐葉萍對(duì)鉻的生物濃縮達(dá)到幾千甚至幾萬，富集濃縮因子達(dá)到5120(Γ82000，周圍水環(huán)境中的鉻濃度小于0. lppm，解決了含鉻廢水的生態(tài)凈化問題。本發(fā)明的有益效果是
(O.溶解度為99. 99%，半衰期為20天，給藥周期為5天，用量為0. 20g/L 0. 25g/L ；
(2).成本低，操作簡(jiǎn)單，不會(huì)帶來二次污染；
(3).槐葉萍對(duì)鉻的富集濃縮因子達(dá)到51200 82000，水體中鉻含量從0.3 0. 5mg/L降到濃度小于0. lppm。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所采用的原料為以金魚藻、氯化鈣、氯化鉀、半知菌、魚孢菌、培養(yǎng)基為原料，通過提取金魚藻中耐鉻基因片段、體外DNA重組、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選獲得含耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞，該蛋白基因細(xì)胞與氯化鈉以一定的質(zhì)量比，注射到水體中槐葉萍的根部，使得槐葉萍對(duì)鉻的富集濃縮因子達(dá)到5120(Γ82000，水體中鉻濃度小于O. lppm。本發(fā)明具體合成步驟
(1)培養(yǎng)基的制備
以質(zhì)量計(jì)，葡萄糖8 10g、磷酸氫二鉀0.2、.5g、硫酸鎂O. l、.2g、瓊脂l(Tl2g、氯化鈉O. 8 l.Og、硫酸鎂O. I、. 3g、磷酸氫二鉀O. 3、. 5g 牛肉膏5. (Γ6. Og 蛋白胨7. (TlO. Og;將上述物質(zhì)溶解，加蒸餾水定容至IOOOmL,分裝、在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)殺菌，殺菌條件為壓力105Kpa ;溫度120° C ;時(shí)間:20 30min，備用；
(2)耐鉻DNA片段提取
從金魚藻細(xì)胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，獲得耐鉻基因的DNA序列；
(3)體外DNA重組
從半知菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載體，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割形成開環(huán)質(zhì)粒，加入適當(dāng)?shù)腄NA連接酶，將耐鉻基因連接在質(zhì)粒環(huán)上，形成一個(gè)重組DNA分子；
(4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞與篩選
將重組得到的DNA導(dǎo)入用CaCl2處理的魚孢菌中，接種到15 20mL的培養(yǎng)基中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在37 37. 3° C，培養(yǎng)時(shí)間為15 18h ;再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的無菌離心管中，在4飛° C下以30(T350r/min的轉(zhuǎn)速離心2 3h，除去上層清液；再用3 5mL 0. ImoVLCaCl2溶液洗滌沉淀，靜置l(Tl5min，再4 6° C下以20(T400r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)35 45min，濾去上層清液，獲得細(xì)胞沉淀；并篩選含耐鉻基因的受體細(xì)胞，保存于4 6° C下備用。一種富集污染水體中低濃度鉻的基因的使用方法將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以
體積比I :4 8溶解于0. 05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為0. 20g/L 0. 25g/L，注射4 6mL于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次，35 45天后檢測(cè)槐葉萍和水體中的鉻含量。實(shí)例I
(I)培養(yǎng)基的制備
以質(zhì)量計(jì)，取葡萄糖8g、磷酸氫二鉀0. 2g、硫酸鎂0. lg、瓊脂10g、氯化鈉0. 8g、硫酸鎂0. lg、磷酸氫二鉀0.3g、牛肉膏5. Og、蛋白胨7. 0g，將上述物質(zhì)溶解，加蒸餾水定容至IOOOmL,分裝、在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)殺菌，殺菌條件為壓力105Kpa ;溫度120° C ；時(shí)間20min,備用。(2)耐鉻DNA片段提取
從金魚藻細(xì)胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，獲得耐鉻基因的DNA序列。⑶體外DNA重組
從半知菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載體，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割形成開環(huán)質(zhì)粒，、加入適當(dāng)?shù)腄NA連接酶，將耐鉻基因連接在質(zhì)粒環(huán)上，形成一個(gè)重組DNA分子。(4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞與篩選
將重組得到的DNA導(dǎo)入用CaCl2處理的魚孢菌中，接種到15mL的培養(yǎng)基中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在37° C，培養(yǎng)時(shí)間為15h ;再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的無菌離心管中，在4° C下以300r/min的轉(zhuǎn)速離心2h,除去上層清液；再用3mL O. Imol/LCaCl2溶液洗滌沉淀，靜置lOmin，再4° C下以200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)35min，濾去上層清液，獲得細(xì)胞沉淀；并篩選含耐鉻基因的受體細(xì)胞，保存于4° C下備用。將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以體積比I :4溶解于0.05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為O. 20g/L，注射4mL于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次，35天后檢測(cè)槐葉萍和水體中的鉻含量。結(jié)果表明該基因蛋白在槐葉萍內(nèi)對(duì)鉻的濃縮因子達(dá)到51200，檢測(cè)不到水體中鉻含量。
實(shí)例2
(I)培養(yǎng)基的制備
以質(zhì)量計(jì)，葡萄糖9g、磷酸氫二鉀0.3g、硫酸鎂O. 15g、瓊脂llg、氯化鈉0.9g、硫酸鎂O. 2g、磷酸氫二鉀O. 35g牛肉膏5. 5g蛋白胨8. 0g，將上述物質(zhì)溶解，加蒸餾水定容至IOOOmL,分裝、在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)殺菌，殺菌條件為壓力105Kpa;溫度120° C ;時(shí)間25min，備用。(2 )耐鉻DNA片段提取
從金魚藻細(xì)胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，獲得耐鉻基因的DNA序列。(3)體外DNA重組
從半知菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載體，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割形成開環(huán)
質(zhì)粒，加
入適當(dāng)?shù)腄NA連接酶，將耐鉻基因連接在質(zhì)粒環(huán)上，形成一個(gè)重組DNA分子。(4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞與篩選
將重組得到的DNA導(dǎo)入用CaCl2處理的魚孢菌中，接種到7mL的培養(yǎng)基中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在37. 1° C，培養(yǎng)時(shí)間為16h ;再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的無菌離心管中，在5° C下以320r/min的轉(zhuǎn)速離心2. 5h,除去上層清液；再用4mL0. lmol/L CaCl2溶液洗滌沉淀，靜置12min，再5° C下以250r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)40min，濾去上層清液，獲得細(xì)胞沉淀；并篩選含耐鉻基因的受體細(xì)胞，保存于5° C下備用。將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以體積比I :5溶解于0. 05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為0. 21g/L， 注射5mL于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次，38天后檢測(cè)槐葉萍和水體中的鉻含量。結(jié)果表明該基因蛋白在槐葉萍內(nèi)對(duì)鉻的濃縮因子達(dá)到58500。實(shí)例3
(I)培養(yǎng)基的制備
以質(zhì)量計(jì)，葡萄糖9g、磷酸氫二鉀0.4g、硫酸鎂0. 15g、瓊脂llg、氯化鈉0.9g、硫酸鎂0. 2g、磷酸氫二鉀0.4g牛肉膏5.6g蛋白胨9. 0g，將上述物質(zhì)溶解，力口蒸餾水定容至lOOOmL，分裝、在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)殺菌，殺菌條件為壓力105Kpa ;溫度120。C ;時(shí)間28min，備用。(2 )耐鉻DNA片段提取
從金魚藻細(xì)胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，獲得耐鉻基因的DNA序列。(3)體外DNA重組
從半知菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載體，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割形成開環(huán)
質(zhì)粒，加
入適當(dāng)?shù)腄NA連接酶，將耐鉻基因連接在質(zhì)粒環(huán)上，形成一個(gè)重組DNA分子。(4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞與篩選
將重組得到的DNA導(dǎo)入用CaCl2處理的魚孢菌中，接種到18mL的培養(yǎng)基中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在37. 2° C，培養(yǎng)時(shí)間為17h ;再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的無菌離心管中，在5° C下以335r/min的轉(zhuǎn)速離心2. 5h,除去上層清液；再用4mLO. lmol/L CaCl2溶液洗漆沉淀,靜置14min,再6° C下以300r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)40min,濾去上層清液，獲得細(xì)胞沉淀；并篩選含耐鉻基因的受體細(xì)胞，保存于5° C下備用。將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以體積比I :6溶解于O. 05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為O. 23g/L，注射5mL于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次，42天后檢測(cè)槐葉萍和水體中的鉻含量。結(jié)果表明該生物制劑在黑魚體內(nèi)對(duì)氮的濃縮因子達(dá)到69500。
權(quán)利要求
1.一種富集污染水體中低濃度鉻含量的基因蛋白的合成及其應(yīng)用，其特征在于具體制備過程為 (I)培養(yǎng)基的制備 以質(zhì)量計(jì)，葡萄糖8 10g、磷酸氫二鉀0.2、.5g、硫酸鎂O. l、.2g、瓊脂l(Tl2g、氯化鈉O. 8 l.Og、硫請(qǐng)酸鎂O. I、. 3g、磷酸氫二鉀O. 3、. 5g、牛肉膏5. (Γ6. Og、蛋白胨7.(Γ10.[微軟用戶I]； 將上述物質(zhì)溶解，加蒸餾水定容至IOOOmL,分裝、在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)殺菌，殺菌條件為壓力105Kpa ;溫度120° C ;時(shí)間:20 30min，備用； (2)耐鉻DNA片段提取 從金魚藻細(xì)胞中提取DNA分子，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，獲得耐鉻基因的DNA序列； (3)體外DNA重組 從半知菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載體，用BgI II型限制性內(nèi)切酶切割形成開環(huán)質(zhì)粒，加入DNA連接酶，將耐鉻基因連接在質(zhì)粒環(huán)上，形成一個(gè)重組DNA分子； (4)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞與篩選 將重組得到的DNA導(dǎo)入用CaCl2處理的魚孢菌中，接種到15 20mL的培養(yǎng)基中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在37 37. 3° C，培養(yǎng)時(shí)間為15 18h ;再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的無菌離心管中，在4飛° C下以30(T350r/min的轉(zhuǎn)速離心2 3h，除去上層清液；再用3 5mL O. ImoVLCaCl2溶液洗滌沉淀，靜置l(Tl5min，再4 6° C下以20(T400r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)35 45min，濾去上層清液，獲得細(xì)胞沉淀；并篩選含耐鉻基因的受體細(xì)胞，保存于4 6° C下備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種富集污染水體中低濃度鉻含量的基因蛋白的合成及其應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用方法為將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以體積比I :4 8溶解于O. 05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為O. 20g/L 0. 25g/L，注射Γ6ιΛ于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次，35天后，檢測(cè)到槐葉萍對(duì)低濃度鉻的富集的濃縮因子可達(dá)51200 82000。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富集污染水體中低濃度鉻含量的基因蛋白的合成及其應(yīng)用，該方法采用金魚藻、氯化鈣、氯化鉀、半知菌、魚孢菌、培養(yǎng)基為原料，通過提取金魚藻中耐鉻基因片段、體外DNA重組、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選獲得含耐鉻基因的細(xì)胞，即耐鉻擬球基因蛋白。本發(fā)明的使用方法為將該耐鉻擬球蛋白基因的細(xì)胞以體積比14~8溶解于0.05mo/L氯化鈉溶液中，其中，耐鉻擬球蛋白基因的濃度為0.20g/L~0.25g/L，注射4~6mL于槐葉萍的根部，給藥期為15天，三天注射一次。本發(fā)明通過將耐鉻擬球基因蛋白注射到水體中槐葉萍的根部，35天后，槐葉萍對(duì)鉻的富集濃縮因子達(dá)到51200~82000。
文檔編號(hào)C12N15/89GK102628051SQ20121009558
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月2日
發(fā)明者謝芳, 雷思宇, 雷春生 申請(qǐng)人:常州亞環(huán)環(huán)?？萍加邢薰?br>