專利名稱：同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)副產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)，具體涉及同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的引物及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
食品安全是公共衛(wèi)生問題中最應(yīng)重視的環(huán)節(jié)，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道全球每年發(fā)生食源性疾病的病例高達(dá)一億例，全球每年約有170萬兒童死于由食源性微生物污染引起的腹瀉病，成年人的感染病例達(dá)到數(shù)十億。研究發(fā)現(xiàn)，目前我國(guó)食品安全領(lǐng)域存在如下問題(1)微生物污染是影響我國(guó)食品安全的最主要因素。(2)在投入品供給，農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境，防疫體系，農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)、加工以及銷售等環(huán)節(jié)仍然存在安全隱患。(3)食品安全科技成果和技術(shù)儲(chǔ)備不足。(4)食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系、檢驗(yàn)檢測(cè)體系、認(rèn)證認(rèn)可體系等方面還存在明顯的不適應(yīng)性，食品安全管理體制和法律法規(guī)體系有待完善。(5)食物中毒和食源性疾病仍然對(duì)中國(guó)的食品安全構(gòu)成了明顯的威脅，重大食品安全事故屢有發(fā)生。為確保我國(guó)食品安全與食品貿(mào)易，必須大力加強(qiáng)食品檢驗(yàn)的力度，在我國(guó)建立、健全食品安全法規(guī)，加強(qiáng)食品安全監(jiān)控，提高檢測(cè)技術(shù)，使我國(guó)相應(yīng)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際接軌，特別是食品快速檢測(cè)技術(shù)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。世界衛(wèi)生組織將食源性疾病定義為，通過攝食進(jìn)入人體的，使人體患感染性或中毒性的疾病。人類有60%的疾病都與動(dòng)物疾病有關(guān)，近些年出現(xiàn)的新型疾病中，這一比例更是高達(dá)75%，在養(yǎng)殖業(yè)高度發(fā)達(dá)、人與動(dòng)物多層面接觸的今后，這一比例恐怕還會(huì)升高。常見的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、致病性大腸桿菌、葡萄球菌及毒素、變形桿菌屬、副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蠟樣芽抱桿菌、韋氏梭菌、彎曲桿菌、酵米面椰毒假單胞桿菌、結(jié)腸炎耶爾森氏菌、鏈球菌及志賀氏菌屬等。以上所述的致病菌目前還沒有一套可以同時(shí)檢測(cè)其是否存在的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一套可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的檢測(cè)用引物。本發(fā)明的另一目的是提供根據(jù)上述檢測(cè)引物設(shè)計(jì)的一種檢測(cè)方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
在各種食物中毒中，細(xì)菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。本發(fā)明針對(duì)在我國(guó)食物中毒中最常見的致病菌，研究出一種食物中毒診斷及食品檢測(cè)的有效方法。根據(jù)GB4789.1食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)總則和GB4789. 17肉與肉制品檢驗(yàn)中的相關(guān)要求以及結(jié)合我國(guó)目前食源性致病菌的發(fā)生發(fā)展情況，選取以下六種細(xì)菌作為檢測(cè)對(duì)象鼠傷寒沙門氏菌，甲型副傷寒沙門氏菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志賀氏菌，非01群霍亂弧菌，首先篩選出檢測(cè)上述各致病菌的PCR引物。同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的檢測(cè)用引物，核苷酸序列如下、invA 引物對(duì)SEQ ID NO: 1^2 (JnvA-up，down)；
力7ァ引物對(duì)SEQ ID NO:3^4 ihly-up, down)；iiorT 引物對(duì)SEQ ID NO:5 6 (toxR-up, down);
引物對(duì)SEQ ID NO:7^8 iipaH-up, down)；vcc 引物對(duì)SEQ ID NO:9 10 (vcc~up, down);
以上任何兩對(duì)以上引物組合,可以檢測(cè)該弓I物對(duì)所對(duì)應(yīng)的致病菌；
其中i/ W引物對(duì)用于檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌{Salmonella typhimurium)和甲 型副傷寒沙門氏菌{Salmonella para typhi ), hly引物對(duì)用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌iListeria monocytogenes), toxR引物對(duì)用于檢測(cè)副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus ), 引物對(duì)用于檢測(cè)福氏志賀氏菌flexneri ), rcc 引物對(duì)用于檢測(cè)非ft/群霍亂弧菌(Cholerae non- 01、。以上引物是通過Blast、MegAlign和DNAStar程序篩選出的沙門氏菌inv基因簇保守序列(GenBank: FR775234. 2)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか保守序列(GenBank: NC_012488. 2)，副溶血性弧菌toxR基因保守序列(GenBank: L11929. 2)，福氏志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈基因ipaH7保守序列(GenBank: NC_004337. I),非01群霍亂弧菌Fee基因保守序列(GenBank:7)作為模板,用Primer Explorer V5軟件設(shè)計(jì)所得。本發(fā)明靶基因的選擇原則有ニ 選擇毒力基因，選擇位于細(xì)菌基因組的基因。因?yàn)楦鞣N致病菌與其同屬的非致病型在生化反應(yīng)上沒有區(qū)別，屬間基因組的同源性也很高，但與致病性相關(guān)的毒力基因特異性高。而在食品檢測(cè)上只有檢測(cè)出毒力才能認(rèn)定為致病菌，所以選擇毒力基因?yàn)榘谢颉＜?xì)菌屬于原核生物，其遺傳物物質(zhì)有基因組和質(zhì)粒兩類，很多毒力基因位于質(zhì)粒上。但質(zhì)粒不穩(wěn)定，可能在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，也容易在傳代培養(yǎng)中丟失。質(zhì)粒DNA與基因組DNA的大小相差很大，不能用同樣方法提取。所以選擇位于細(xì)菌基因組上的毒力基因?yàn)榘谢?。由于要在同一個(gè)PCR管體系中同時(shí)進(jìn)行至少兩個(gè)目的基因的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，且對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)的特異性要求較高。所以引物設(shè)計(jì)沒有普通引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，要設(shè)計(jì)出優(yōu)良的引物，需要在各種生物信息軟件評(píng)估的基礎(chǔ)上進(jìn)行費(fèi)時(shí)的篩選。由于所設(shè)計(jì)的引物具有高度的選擇特異性，在進(jìn)行病原檢測(cè)時(shí)，要求引物所針對(duì)的靶序列位點(diǎn)應(yīng)該相當(dāng)保守，這樣所建立的方法才具有適用性。研究中也可以設(shè)計(jì)一些簡(jiǎn)并引物以增強(qiáng)其應(yīng)用的廣泛性，但簡(jiǎn)并度高的引物會(huì)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)造成負(fù)面影響。對(duì)于ー些具有GC含量高、變異性強(qiáng)、弓丨物ニ聚體等特點(diǎn)的目的序列，沒有辦法設(shè)計(jì)出非常適用的引物，使多重檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用受到限制。由于所設(shè)計(jì)的引物要在下一步進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)要將各基因?qū)?yīng)的序列一同進(jìn)行比對(duì)分析。除了遵循引物設(shè)計(jì)的一般原則，引物對(duì)內(nèi)部和引物對(duì)之間也要盡量使Tm值相近，確保能在同一條件下均獲得較好的擴(kuò)增；各對(duì)引物內(nèi)部和引物對(duì)之間不能互補(bǔ)，尤其避免3’端的互補(bǔ)，以減少引物ニ聚體的形成；各引物與其他擴(kuò)增片段和模板有較好的特異性；擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小要有差異，確保能夠用瓊脂糖凝膠電泳方法區(qū)分開。設(shè)計(jì)好的引物序列提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，用以驗(yàn)證引物的理論特異性。
本發(fā)明要保護(hù)的另一技術(shù)方案是一種同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的檢測(cè)方法，該方法使用上面任意兩對(duì)以上檢測(cè)用引物對(duì)，以待檢樣品中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)以下條帶，表明待檢樣品中存在相應(yīng)的致病菌 214bp :副溶血性弧菌；
394bp :福氏志賀氏菌；
490bp :非01群霍亂弧菌；
568bp :鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌；
797bp :單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。本發(fā)明還保護(hù)一種同時(shí)檢測(cè)兩種致病菌的雙重PCR反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系為25ML，其中2XPCRmix 12. 5uL, 10umol/L的上、下游引物各0. 4ML，待檢測(cè)樣品DNA模板I. Oii L，超純水補(bǔ)足25ML ;所述上、下游引物為SEQ ID NO: TlO中任意兩種檢測(cè)用引物對(duì)中的上、下游引物，如果選擇引物對(duì)和/或引物對(duì)，其上、下游引物需各加IML ;所述致病菌為所選用引物對(duì)所對(duì)應(yīng)能檢測(cè)的致病菌。上述的雙重PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增方法，擴(kuò)增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個(gè)循環(huán)。當(dāng)檢測(cè)的致病菌種類增加時(shí)，上述PCR反應(yīng)體系的總體積及組分也有相應(yīng)變動(dòng)，作為一種能檢測(cè)三種以上致病菌的PCR體系優(yōu)選方案，這種同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的多重PCR反應(yīng)體系為50ML，其中2XPCRmix 12. 5 u L, 10 u mol/L的上、下游引物各0. 4ML，待檢測(cè)樣品DNA模板I. 0 ii L，超純水補(bǔ)足50ML ;所述上、下游引物為SEQ ID NO: TlO中任意三種以上檢測(cè)用引物對(duì)中的上、下游引物，如果選擇引物對(duì)和/或引物對(duì)，其上、下游引物需各加IML ;所述致病菌為所選引物對(duì)所對(duì)應(yīng)能檢測(cè)的致病菌。上述的多重PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增方法，擴(kuò)增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個(gè)循環(huán)。多重PCR體系中增加了引物和模板，影響反應(yīng)的因素增多，互相之間增加了干擾。因此增加了設(shè)計(jì)引物的難度。除此之外體系中各成分的量和循環(huán)參數(shù)也需在實(shí)驗(yàn)中做適當(dāng)調(diào)整，以減少非特異性擴(kuò)增的影響，平衡各產(chǎn)物的量，獲得清晰的各段電泳條帶。實(shí)際檢測(cè)中模板的量是不能確定的，因此引物的濃度和其他成分要保證充分供給，也不能過量，這對(duì)檢測(cè)結(jié)果有直接影響。因此在體系中重點(diǎn)調(diào)整的是引物的濃度。本發(fā)明的同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的檢測(cè)用引物特異性強(qiáng)，可用于制備農(nóng)副產(chǎn)品尤其是水產(chǎn)品致病菌的檢測(cè)試劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(I)本發(fā)明篩選出了多種特異性強(qiáng)的致病菌PCR擴(kuò)增引物，建立了一種同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的多重PCR方法，為快速、高效檢測(cè)農(nóng)副產(chǎn)品中多種致病菌提供了一種簡(jiǎn)便快速的方法。(2)本發(fā)明的 5 對(duì)弓丨物 invA-up，down, hly~up, down, toxR-up，down,ipaH-up, down，vcc-up，down只引起相應(yīng)祀基因的特異性擴(kuò)增,無任何非特異性擴(kuò)增，顯示了良好的特異性，在實(shí)踐中能夠避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。(3)本發(fā)明的檢測(cè)方法擴(kuò)增反應(yīng)快速、高效、簡(jiǎn)便，整個(gè)擴(kuò)增在不到2小時(shí)即可完成。
(4)本發(fā)明的5對(duì)引物在六種細(xì)菌單重PCR檢測(cè)中靈敏度都在103cfu/mL 104cfu/mL,顯示了高靈敏度。(5)能夠同時(shí)檢測(cè)多種致病性細(xì)菌通過對(duì)六種致病菌的特異基因片段的選擇，通過ー個(gè)多重PCR體系的建立和調(diào)試，成功同時(shí)擴(kuò)增出了六種菌，并且六種菌隨機(jī)組合的擴(kuò)增也成功，未出現(xiàn)相互間強(qiáng)抑制現(xiàn)象。


圖I.鼠傷寒沙門氏菌DNA為模板的引物i/o#/ 退火溫度梯度 實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳結(jié)果圖，注=Tio道從左起分別為退火溫度(°C): 50，50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55.8，56. 9，58. 1，59. I。圖2.甲型副傷寒沙門氏菌DNA為模板的引物invA-即，down退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳結(jié)果圖，注10道從左起分別為退火溫度(°C): 50，50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. 1，59. I。圖3.引物Aか-or i/o#/ 退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳結(jié)果圖，注f 10道從左起分別為退火溫度(°C) 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I, 59. 7。圖4. 3\嫩toxR-up, down退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳結(jié)果圖，注f 10道從左起分別為退火溫度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。圖5.引物退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳結(jié)果圖,注]Λ10道從左起分別為退火溫度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。圖6.引物退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳結(jié)果圖，注]Λ10道從左起分別為退火溫度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。圖7.引物invA-up，down對(duì)幾種菌的擴(kuò)增電泳結(jié)果圖,注1為陰性對(duì)照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.鼠傷寒沙門氏菌，3.甲型副傷寒沙門氏菌，4.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志賀氏菌，7.非Ol群霍亂弧菌。圖8.引物i/o#/ 對(duì)六種菌的擴(kuò)增電泳結(jié)果圖，注I為陰性對(duì)照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.甲型副傷寒沙門氏菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志賀氏菌，7.非Ol群霍亂弧菌。圖9.引嫩hly-up, down對(duì)六種菌的擴(kuò)增電泳結(jié)果圖，注I為陰性對(duì)照，cT 道分別為不同菌株基因組模板2.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志賀氏菌，7.非Ol群霍亂弧菌。圖10.引物ioi-UR i/o#/ 對(duì)六種菌的擴(kuò)增電泳圖，注I為陰性對(duì)照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.副溶血性弧菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，6.福氏志賀氏菌，7.非02群霍亂弧菌。圖11.引物ipaH-up’ down對(duì)六種菌的擴(kuò)增電泳圖，注I為陰性對(duì)照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.福氏志賀氏菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，6.副溶血性弧菌，7.非02群霍亂弧菌。圖12.引物ゐ_對(duì)六種菌的擴(kuò)增，注I為陰性對(duì)照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.非01群霍亂弧菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，6.副溶血性弧菌，7.福氏志賀氏菌。
圖13.鼠傷寒沙門氏菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果，f 8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖14.甲型副傷寒沙門氏菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果，f 8道分別為108、107、106、105、104、IO3UO2UO1CfuM^圖15.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果，廣8道分別為108、107、106、105、IO4UO3UO2UO1Cfu/!!!!^圖16.副溶血性弧菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果，1 8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖17.福氏志賀氏菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果，f 8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖18.非01群霍亂弧菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果，廣8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖19. 二重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，1,2擴(kuò)增和基因，3,4擴(kuò)增和基因，5，6擴(kuò)增invA和基因，7，8擴(kuò)增invA和rcc基因。圖20. 二重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I，2擴(kuò)增in W和基因，3，4擴(kuò)增invA和toxR基因，5，6擴(kuò)增invA和基因，7，8擴(kuò)增invA和rcc基因。圖21. 二重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I，2擴(kuò)增hly和toxR基因，3，4擴(kuò)增hly和ipaH基因，5，6擴(kuò)增hly和Mc基因。圖22. 二重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I, 2擴(kuò)增toxR和基因，3，4擴(kuò)增toxR和wc基因，5，6擴(kuò)增ipaHM MC基因。圖23. 二重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I擴(kuò)增in vA和toxR基因，2擴(kuò)增in vA和ipaH基因，3擴(kuò)增invA和MC基因，4擴(kuò)增hly和toxR基因，5擴(kuò)增hly和toxR基因，6擴(kuò)增hly和toxR基因。圖24. 二重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I擴(kuò)增in vA和toxR基因，2擴(kuò)增in vA和ipaH基因，3擴(kuò)增invA和MC基因，4擴(kuò)增hly和toxR基因，5擴(kuò)增hly和toxR基因，6擴(kuò)增hly和toxR基因。圖25.三重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I，2擴(kuò)增in vA、ipaH和wc基因，3，4擴(kuò)增in vA、vcc 和 toxR 基因，5，6 擴(kuò)增 invA、toxR 和基因，7, 8 擴(kuò)增 invA、hly 和 vcc 基因，9，10擴(kuò)增 invA、ipaHM 基因，11，12 擴(kuò)增 invA、hly 和 toxR 基因。圖26.三重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I, 2擴(kuò)增invA、hly和toxR基因，3，4擴(kuò)增invA、 和 hly 基因，5，6 擴(kuò)增 invA、hly 和 vcc 基因，7，8 擴(kuò)增 invA、toxR 和基因，9, 10
擴(kuò)增 invA、vcc 和 tiorT 基因，11，12 擴(kuò)增 invA、和 vcc 基因。圖27.三重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I, 2擴(kuò)增A7_f、ipaHM 基因，3，4擴(kuò)增從F、toxR 和 vcc 基因，5，6 擴(kuò)增 hly.、和 vcc 基因，7，8 擴(kuò)增 fcc、toxR 和基因。圖28.四重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I，2擴(kuò)增in vA、hly、ipaH和toxR基因，3，4擴(kuò)增hly、toxR.、和 vcc 基因。圖29.四重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，1,2,3擴(kuò)增hly、toxR、ipaHM vcc基因。圖30.五重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I, 2, 3, 4擴(kuò)增invA、hly、toxR、ipaH和vcc基因。圖31.五重PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，I, 2, 3,擴(kuò)增invA、hly、toxR、ipaH取vcc基因。、
圖32.五重 PCR 電泳檢測(cè)結(jié)果，I, 2, 3, 4, 5, 6 擴(kuò)增 invA.、hly.、toxR、ipaH和 rcc基因，1，2擴(kuò)增invA、hly基因引物量為toxR、か成和基因2倍，3，4擴(kuò)增invA、hly基因引物量為toxR、ipaim vcc基因3倍，5，6擴(kuò)增invA、hly基因引物和模板量均為toxR、
和vcc基因2倍。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑和常規(guī)操作步驟。實(shí)施例I五種致病菌檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)與篩選
I.I實(shí)驗(yàn)材料
主要工具酶類、生化試劑及試劑盒
LB肉湯、各種生化管、李氏增菌液等試劑購(gòu)自廣州環(huán)凱生物試劑有限公司。Taq DNA聚合酶(Fermentas)，溶菌酶，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)，普通瓊脂糖凝膠，DNA回收試劑盒(天根)，PGM-T19連接含試劑盒(含載體，連接酶)購(gòu)自廣州市寶泰克生物科技有限公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(天根)，EB替代染料(北京普利菜)；Tip和Tip盒、離心管、玻璃試管、平皿、三角瓶等耗材購(gòu)自廣州市韻薈試驗(yàn)儀器公司；其他試劑均為分析純常規(guī)試劑。LB固體培養(yǎng)基在LB肉湯基礎(chǔ)上加入比例為15g L_1的瓊脂粉，混勻煮沸熔化滅菌。營(yíng)養(yǎng)肉湯NB培養(yǎng)基(IL):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，ρΗ7· 4。實(shí)驗(yàn)菌株來源及編號(hào)見表I 表I實(shí)驗(yàn)菌株及來源
菌種名稱菌種編號(hào)來源
,SHSf —黃埔出入境檢驗(yàn)撿顧
CMCC_15黃埔出入境檢驗(yàn)檢顧
!SI=S 置哪湖翻出入境檢驗(yàn)檢顧
歷mm龍出入境麵檢顧
(01)■卿廁黃埔出入境檢驗(yàn)纖
——畫禪皿_黃埔出入境檢驗(yàn)薩_
感受態(tài)細(xì)蟲 菌E-COH華獻(xiàn)業(yè)大學(xué)動(dòng)物糇學(xué)院家禽·究室
1.2引物設(shè)計(jì)
PCR擴(kuò)增菌特異靶基因的選用沙門氏菌inv基因簇-編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白基因W，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか，副溶血性弧菌ioi基因，福氏志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈基因iPaH7,非01群霍亂弧菌基因。
于NCBI網(wǎng)站檢索相應(yīng)基因序列,用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)多重引物，詳見表2。引物由北京奧科生物工程技術(shù)有限公司合成，合成后的引物用超純水稀釋成10mmol/mL溶液，-20 °C保存。引物序列如下
表2引物及相關(guān)信息
權(quán)利要求
1.同時(shí)檢測(cè)多種水產(chǎn)品致病菌的引物，其特征在于核苷酸序列如下 invA 引物對(duì)SEQ ID NO: I 2 ； hly 引物對(duì)SEQ ID NO:3 4 ； ioi 引物對(duì)SEQ ID NO: 5^6 ； 引物對(duì)SEQ ID NO :7 8 ； vcc 引物對(duì)SEQ ID NO :9 10 ； 以上任何兩對(duì)以上引物組合,可以檢測(cè)該弓I物對(duì)所對(duì)應(yīng)的致病菌； 其中invA引物對(duì)用于檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌和/或甲型副傷寒沙門氏菌引物對(duì)用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，引物對(duì)用于檢測(cè)副溶血性弧菌，引物對(duì)用于檢測(cè)福氏志賀氏菌，KCC引物對(duì)用于檢測(cè)非見群霍亂弧菌。
2.一種同時(shí)檢測(cè)多種水產(chǎn)品致病菌的檢測(cè)方法，其特征在于使用權(quán)利要求I所述的任何兩對(duì)以上檢測(cè)用引物對(duì)，以待檢樣品中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)以下條帶，表明待檢樣品中存在相應(yīng)的致病菌 . 214bp :副溶血性弧菌； .394bp :福氏志賀氏菌； .490bp :非01群霍亂弧菌； .568bp :鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌； .797bp :單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
3.一種同時(shí)檢測(cè)兩種致病菌的雙重PCR反應(yīng)體系，其特征在于反應(yīng)體系為25μ ，其中.2 XPCRmix 12. 5μ L，10 μ mol/L的上、下游引物各O. 4μ ，待檢測(cè)樣品DNA模板I. O μ L，超純水補(bǔ)足25μ ； 所述上、下游引物為權(quán)利要求I所述的任意兩種檢測(cè)用引物對(duì)中的上、下游引物，如果選擇引物對(duì)和/ WLhly引物對(duì)，其上、下游引物需各加WL ； 所述致病菌為選擇的權(quán)利要求I所述引物對(duì)所對(duì)應(yīng)能檢測(cè)的致病菌。
4.權(quán)利要求3所述同時(shí)檢測(cè)兩種致病菌的雙重PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增方法，其特征在于擴(kuò)增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個(gè)循環(huán)。
5.一種同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的多重PCR反應(yīng)體系，其特征在于反應(yīng)體系為50μ ，其中.2 XPCRmix 12. 5μ L，10 μ mol/L的上、下游引物各O. 4μ ，待檢測(cè)樣品DNA模板I. O μ L，超純水補(bǔ)足50μ ； 所述上、下游引物為權(quán)利要求I所述的任意三種以上檢測(cè)用引物對(duì)中的上、下游引物，如果選擇引物對(duì)和/或hly引物對(duì)，其上、下游引物需各加WL ;所述致病菌為選擇的權(quán)利要求I所述引物對(duì)所對(duì)應(yīng)能檢測(cè)的致病菌。
6.權(quán)利要求5所述同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的多重PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增方法，其特征在于擴(kuò)增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個(gè)循環(huán)。
7.權(quán)利要求I所述同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的引物在制備農(nóng)副產(chǎn)品致病菌檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。所述引物的核苷酸序列為invA引物對(duì)，用于檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌；hly引物對(duì)，用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；toxR引物對(duì)，用于檢測(cè)副溶血性弧菌；ipaH引物對(duì)，用于檢測(cè)福氏志賀氏菌；以及vcc引物對(duì)，用于檢測(cè)非O1群霍亂弧菌。本發(fā)明同時(shí)公開了一種利用上述各引物對(duì)建立的多重PCR擴(kuò)增體系，使用這一體系可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出待檢樣品中是否有相應(yīng)致病菌，整個(gè)檢測(cè)過程用時(shí)不到2小時(shí)，簡(jiǎn)單方便，且每對(duì)引物特異性都很高，不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，可以做成試劑盒等，在農(nóng)副產(chǎn)品致病菌檢測(cè)中非常適用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102634580SQ20121009654
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者呂英姿, 孫寶麗, 張凌俊, 畢英佐, 謝青梅 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)