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一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法

文檔序號:409467閱讀:233來源:國知局
專利名稱:一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法,具體是一株高效利用葡萄糖生長并產(chǎn)丁二酸重組菌株及其利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。
背景技術(shù)
丁二酸(又稱琥珀酸)作為一種C4平臺化合物,不僅被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、 染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè),還可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料,被美國能源部認(rèn)為是未來12 種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。目前工業(yè)應(yīng)用的丁二酸主要采用化學(xué)方法生產(chǎn),污染大、 成本高,制約了丁二酸作為大宗化學(xué)品的發(fā)展?jié)摿?。利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)琥珀酸、價(jià)格低廉、污染小,且在發(fā)酵過程中可吸收固定CO2,開辟了溫室氣體利用的新途徑,工藝過程具有綠色、能耗低、原子經(jīng)濟(jì)性高的優(yōu)點(diǎn),近年來成為研究的熱點(diǎn)。丁二的生產(chǎn)菌株很多,目前主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、ActinobaciIlus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens 和重組疋coli I。利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度,但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高,且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多,阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。大腸桿菌由于對營養(yǎng)條件需求簡單,并具有生長迅速、遺傳背景清楚、易調(diào)控、易改造等特點(diǎn),因此利用基因工程手段改造大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸備受關(guān)注?,F(xiàn)有的產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因改造策略主要有增強(qiáng)代謝途徑中的關(guān)鍵酶(如 PPC、PCK)、失活或敲除競爭途徑中的酶(如LDH、PFL)、引入新的代謝途徑(如乙醛酸循環(huán)) 等。其中,疋coli NZNlll由于同時(shí)失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶,丙酮酸的代謝支路大大減少,丙酮酸大量積累,最終導(dǎo)致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株疋coli AFPlll由于突變了葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因,菌株使用葡萄糖激酶系統(tǒng)進(jìn)行葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),使丙酮酸的積累不再是糖轉(zhuǎn)運(yùn)的限制因素,恢復(fù)了菌株在厭氧條件下利用葡萄糖的能力,且產(chǎn)物主要為丁二酸,在有氧厭氧兩階段發(fā)酵培養(yǎng)AFPlll過程中,丁二酸質(zhì)量收率達(dá)到96%,生產(chǎn)強(qiáng)度為1.21因此,在高產(chǎn)丁二酸大腸桿菌菌株構(gòu)建過程中,減少丙酮酸的積累是重組大腸桿菌高產(chǎn)丁二酸的關(guān)鍵因素之一。Stols等通過測定的蘋果酸酶對蘋果酸的Km值,認(rèn)為蘋果酸酶在特定的菌種中有可能催化從丙酮酸到蘋果酸的逆向反應(yīng),原因是該反應(yīng)方向在熱力學(xué)上是有利的。在 E. coli雙突變株NZNlll中超量表達(dá)Ascaris suum中的蘋果酸酶基因sfcA后,使蘋果酸酶逆向催化生成蘋果酸,減少了丙酮酸的大量積累,并以琥珀酸作為最終還原產(chǎn)物而大量積累。同時(shí),Wang等人構(gòu)建了萬.NZNlll/pTrc99a_麗*菌株,過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶基因ijndh、后,能使疋coli NZNlll在厭氧條件下利用葡萄糖,丁二酸產(chǎn)量增加了 5倍多, 并且大大降低了丙酮酸的積累。Hui Wu和Zhi-min Li等人利用NZNlll進(jìn)行兩階段發(fā)酵, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDH和ICL的酶活大大提高,使丙酮酸的量大大減少,流向乙醛酸循環(huán),從而使丁二酸的產(chǎn)量大幅度提高。Vemuri等人將Λ etli中的/77c基因引入NZNlll中,結(jié)果丙酮酸減少了 3倍,丁二酸產(chǎn)量增加了 52%。岳方方等人在JM1307中過量表達(dá)枯草芽孢桿菌中的 Pyc基因,結(jié)果丁二酸的產(chǎn)量增加了 I. 9倍,同時(shí)丙酮酸的量也有所減少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種能高效利用葡萄糖生長并產(chǎn)丁二酸的基因工程菌株及其構(gòu)建方法,并利用該菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸,達(dá)到菌株的構(gòu)建方法簡單方便,構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵方法簡單可行,易于工業(yè)化,產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的,從而大大降低生產(chǎn)成本, 提聞經(jīng)濟(jì)效益。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。一、本發(fā)明提供的一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株,其分類命名為大腸埃希氏菌 (.Escherichia co7i ) BA103,其保藏號登記號為 CCTCC NO M 2012032。二、本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA103的構(gòu)建方法,其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因,丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株,利用同源重組技術(shù)敲除基因(Glucose phophotransferase Enzyme IIBC (Glc))后,再過量表達(dá)丙酮酸羧化酶(PYC),得到能夠利用葡萄糖產(chǎn)丁二酸的大腸埃希氏菌BA103。本發(fā)明所述的重組菌株BA103的代謝途徑如圖I所示。進(jìn)一步地,所述的具體構(gòu)建步驟如下
(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因(A/M),丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7沒)活性的疋CWi NZNlll菌株為出發(fā)菌株,敲除其中的葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因,得到同時(shí)缺乏 IdhA ,pflB和ptsG的感受態(tài)菌株;
(2)合成一對5’端帶有酶切位點(diǎn)的引物,以ZaciococciAslactis subsp. cremoris NZ9000基因組DNA為模板,純化擴(kuò)增出的基因后,表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _Fc ;
(3)將步驟(2)所述的重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株,獲得陽性轉(zhuǎn)化子;
(4)利用步驟(3)的陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)丙酮酸羧化酶(PYC),得到可高效利用葡萄糖代謝產(chǎn)丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA103。三、利用本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA103發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法,其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式,有氧階段提高生物量,厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。進(jìn)一步地,具體步驟如下將大腸埃希氏菌BA103按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng),當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體0D_至0. 4 0. 6用0. 5 mM的IPTG誘導(dǎo)至 0D_=3時(shí),按3倍菌泥接種量轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。其中所述的有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中有氧培養(yǎng)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)基;所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是以葡萄糖為碳源的產(chǎn)丁二酸大腸桿菌用發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因,丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌NZNlll為出發(fā)菌株,利用同源重組技術(shù)敲除葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因,并表達(dá)Zaclactis subsp. cremoris NZ9000 中的/77c基因,通過兩階段發(fā)酵,得到了高效利用葡萄糖產(chǎn)丁二酸的優(yōu)良菌株疋coli BA103。


圖I本發(fā)明所述的重組菌株BA103的兩階段代謝途徑;
其中,黑色粗線方塊處表示敲除失活的酶;虛線部分表示新構(gòu)建的途徑。圖2線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖3同源重組陽性重組子的電泳鑒定圖。圖4重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _FC的構(gòu)建圖譜。圖5 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖6重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _FC的單酶切鑒定圖。本發(fā)明的微生物分類命名為大腸埃希氏菌co7i ) BA103,其保藏日期為2012年2月23日,保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心,簡稱為CCTCC,保藏地址是中國·武漢·武漢大學(xué);保藏編號CCTCC NO M 2012032。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明,但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明的生物材料的來源的說明
I、質(zhì)粒來源
本發(fā)明所述的表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a的來源是購自Introvegen公司。本發(fā)明所述的氯霉素抗性基因的來源是pKD3,購自Introvegen公司。本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)表達(dá)λ重組酶的質(zhì)粒的來源是pKD46,購自Introvegen 公司。本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒的來源是pCP20,購自Introvegen 公司。2、基因組模板來源
Lactococcus lactis cremoris NZ9000,購自中國微生物菌種網(wǎng)(www. mum800. com)。3、出發(fā)菌株'E. coli NZNlll的感受態(tài)菌株的來源有兩處
(1)Biotechnol Bioeng, 2001,74:89 95。申請人首先通過查閱到該生物材料的上述文獻(xiàn)出處,并聯(lián)系了發(fā)表人系美國芝加哥大學(xué)的David P. Clark教授,并郵件請求其贈與該生物材料,并免費(fèi)獲得了該生物材料;且申請人保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料;
(2)該生物材料還在中國專利(申請?zhí)?6198547.X,申請日1996. 10. 31,授權(quán)曰2003年 I月I日,授權(quán)公告號CN1097632C)的專利文獻(xiàn)中公開并獲得授權(quán)。4、引物的設(shè)計(jì)及合成自行設(shè)計(jì)并外包金斯瑞生物技術(shù)公司合成。實(shí)施例I
本實(shí)施例說明利用同源重組技術(shù)敲除出發(fā)菌株NZNlll中葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因,得到消除氯霉素抗性菌株的過程。I、利用LB培養(yǎng)基,于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 O. 6, 制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。
2、將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌NZNlll。電擊條件為200 Ω,25 μ F, 電擊電壓2. 3 kV,電擊時(shí)間4 5 ms ο電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷I mL的SOC培養(yǎng)基,150 r/min、30°C培養(yǎng)I h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌 NZNlll (pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入10 mM的L-阿拉伯糖,于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出λ
重組酶,制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。4、以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因?yàn)槟0?,利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng),以質(zhì)粒PKD3為模板,并設(shè)計(jì)兩端帶有同源片段的擴(kuò)增引物,擴(kuò)增出線性DNA同源片段,引物序列如下
上游帶同源臂引物H1-P1,下劃線為同源片段
5’ -ATCGCAGCGTACATGTTTAACCGTTTCTACCGTATTAAGCTGCCTGAGTATCGTGTAGGCTGGAGCTGCT TC-3,。下游帶同源臂引物H2-P2,下劃線為同源片段
5, -TTCGCTGGTACCTGTCGCTTTTGCATCTTCAGTCGCGTCTTCACGACCCGGCATGGGAATTAGCCATGGT CC-3,。反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(100 11101/^1^各0.5 yL;模板DNA(100 ng/ μ L) O. 5 μ L ; 10 X buffer 5 μ L ;dNTPs (10 mM)各 I μ L ;DMS0 (100%) 2.5 μ L ; Pyrobest DNA 聚合酶(2· 5 U/ μ L) I μ L ;ddH20 36/35. 5 μ L ;總體積 50 μ L。反應(yīng)條件94°C,2min ; (94°C 45 sec ;50°C 45 sec ;72°C 90 sec;10 個循環(huán)); (94°C 45 sec ;50°C 45 sec ;72°C 90 sec;15 個循環(huán));72°C,5 min。線性DNA片段的鑒定如圖2。5、電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)λ重組酶的大腸桿菌NZNlll(pKD46)感受態(tài), 并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子,并進(jìn)行了 PCR鑒定,電泳圖如圖3所示。6、陽性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20,于42°C熱激表達(dá)FLP重組酶后即可消除氯霉素抗性。利用一對平板,進(jìn)行平行點(diǎn)樣,能夠在無抗性平板上生長,但不能在抗性平板上生長的均極為已經(jīng)敲除抗性的菌株。實(shí)施例2
本實(shí)施例說明構(gòu)建表達(dá)外源丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒,得到菌株coli BA103,如圖4所示的原理構(gòu)建。I、構(gòu)建pTrc99auc質(zhì)粒,其過程包括
(I)合成帶有AfcoI和AiI酶切位點(diǎn)的引物,
上游引物5’ - CATGCCATGGTCAGCTGATGAGAAACGTCGAGAAG -3’ ;
下游引物5’ _ AAAACTGCAGGGTCATCTCTTCAAAGCCAAAACGA-3’。Lactococcus lactis cremoris NZ9000基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因片段,反應(yīng)條件為94°C,5 min ; (94°C 45 s,53°C 45 s,72°C 300 s, 35個循環(huán));72°C, 10 min。純化擴(kuò)增出的/7_^基因后,表達(dá)質(zhì)粒用?1'1^99&分別用價(jià)01和/ >^1雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc。PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物片段如圖5瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖所示。使用單酶切重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _Fc,得到8185bp的片段,結(jié)果見圖6,酶切結(jié)果表明重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _Fc構(gòu)建成功。
2、將質(zhì)粒pTrc99auc導(dǎo)入同時(shí)缺乏的感受態(tài)菌株,獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明的新構(gòu)建菌株coli BA103。實(shí)施例3
本實(shí)施例說明在大腸桿菌NZNlll中敲除葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因并導(dǎo)入質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc后,能夠高效利用葡萄糖,同時(shí)主要的產(chǎn)物是丁二酸,無甲酸和乳酸的積累,而且大幅度地減少了副產(chǎn)物丙酮酸的生成。將大腸埃希氏菌BA103按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng),當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至O. 4 O. 6用O. 5 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D6(I(I=3時(shí),按3倍菌泥接種量轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵48h。有氧階段培養(yǎng)基為LB+ Amp +Chl+Kna (氨節(jié)青霉素、氯霉素、卡那霉素各50 μ g/ mL) ο厭氧血清瓶發(fā)酵用培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L) +堿式碳酸鎂0.48g + Amp +Chl+Kna(氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素各50 μ g/mL) +0. 5mM IPTG。厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結(jié)果見表I。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株,其分類命名為大腸埃希氏菌coli) BA103,其保藏編號為 CCTCC NO M 2012032。
2.權(quán)利要求I所述的產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株大腸埃希氏菌BA103的構(gòu)建方法,其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因,丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株, 利用同源重組技術(shù)敲除基因后,再過量表達(dá)丙酮酸羧化酶,得到能夠利用葡萄糖產(chǎn)丁二酸的大腸埃希氏菌BA103。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法,其特征在于具體包括以下步驟Cl)以缺乏基因,/7/7沒基因活性的菌株為出發(fā)菌株,敲除其中的葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因,得到同時(shí)缺乏IdhA ,pflB和ptsG的感受態(tài)菌株;(2)合成一對5’端帶有酶切位點(diǎn)的引物,純化擴(kuò)增出的基因后,表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a 用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _Fc ;(3)將步驟(2)所述的重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株,獲得陽性轉(zhuǎn)化子;(4)利用步驟(3)的陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)丙酮酸羧化酶,得到可利用葡萄糖代謝產(chǎn)丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA103。
4.利用權(quán)利要求I所述的大腸埃希氏菌BA103發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法,其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式,有氧階段提高生物量,厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于具體步驟是將大腸埃希氏菌BA103按體積比1%接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng),當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體0D_至O. 4 O. 6 用O. 5 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3時(shí),按3倍菌泥接種量轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。具體是高效利用葡萄糖產(chǎn)丁二酸基因工程菌株EscherichiacoliBA103菌株及其構(gòu)建方法及其產(chǎn)丁二酸的方法。通過表達(dá)外源丙酮酸羧化酶,使重組大腸桿菌能夠利用葡萄糖代謝生長,大幅度提高丁二酸的得率及生產(chǎn)強(qiáng)度,減少副產(chǎn)物丙酮酸的生成。
文檔編號C12N1/21GK102604880SQ20121009671
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者劉嶸明, 姜岷, 張常青, 梁麗亞, 茍冬梅, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請人:南京工業(yè)大學(xué)
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