專利名稱：一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效力的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞檢測技術(shù)，具體地說，涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法。
背景技術(shù)：
胳帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcord-mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是從胳帶組織中分離得到的ー種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。臍帶是懷孕期間連接母體與胎兒之間的組織，由兩條動脈、一條靜脈和粘液結(jié)締組織(Wharton’ s Jelly)構(gòu)成。臍帶膠、臍帶血管壁和血管周圍均富含基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和MSCs樣細(xì)胞(包括基質(zhì)細(xì)胞、血管周細(xì)胞等)。自2003年Mitchell等[I]首次自臍帶中成功地分離出基質(zhì)細(xì)胞并證實其神經(jīng)分化潛能后，對臍帶組織來源MSCs的研究引起了廣泛關(guān)注。
臍帶來自于胎兒生產(chǎn)后的廢棄物，從臍帶中獲取MSCs，資源豐富、質(zhì)量高、較純凈；比從成體組織中獲取MSCs細(xì)胞在供者來源、細(xì)胞數(shù)量及増殖潛能、病毒感染率方面都有明顯優(yōu)勢。另外UC-MSCs具有高度的分化潛能，良好的免疫調(diào)節(jié)能力，同時具有低免疫原性，異體移植時可避免排斥反應(yīng)，使其具有重要的研究和應(yīng)用前景，特別在治療免疫相關(guān)疾病方面均具有重要的臨床應(yīng)用價值。然而，由于細(xì)胞治療本身的特點，間充質(zhì)干細(xì)胞用于臨床治療還具有某些方面的限制因素。其中最典型的方面是缺乏有效而快捷的具有針對性的生物學(xué)效カ檢測手段。目前多數(shù)臨床前或臨床使用的間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品都是依據(jù)2006年國際細(xì)胞治療協(xié)會提出的三條定義間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)[2]，而缺乏針對某ー類疾病的可以定義細(xì)胞質(zhì)量或初歩判斷細(xì)胞治療效果的方法。為克服以上問題的不足，我們對UC-MSCs分泌的ー種糖蛋白-gal ect in-3 (半乳糖凝聚素-3)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，該蛋白是galectins(半乳糖凝聚素)家族的ー員，分子量為26kD，大量研究表明該蛋白可有效抑制T淋巴細(xì)胞的増殖，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡[3-7]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)UC-MSCs在核酸水平和蛋白水平均有較高劑量的galectin-3表達(dá)，而該蛋白在MSC的表達(dá)又分為分泌型的和膜表達(dá)型。我們通過RNA干擾試驗和Transwell小室共培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)分泌型的galectin-3在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮主要作用，我們同時檢測了該蛋白在連續(xù)數(shù)批UC-MSC上清中的表達(dá)，由此提出了ー種檢測MSC免疫抑制效カ的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ檢測手段的不足，建立ー套有效檢測UC-MSC免疫抑制能力的新方法。本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法，其特征在于通過檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量來判斷其免疫抑制效力。
在ー個特定的實施方案中，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且其判斷標(biāo)準(zhǔn)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量以2. 62ng/ml為閾值，低于此數(shù)值的判定為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制效カ不合格。優(yōu)選地,使用ELISA方法檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量。盡管之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)galectin-3表達(dá)與UC-MSC免疫抑制能力之間存在密切關(guān)系，但并沒有開發(fā)出ー套成熟的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)分泌型的galectin-3在UC-MSC免疫抑制過程中起主要作用，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出ー套有效檢測UC-MSC免疫抑制能力的方法。本發(fā)明的方法以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的分泌型galectin-3蛋白質(zhì)為檢測對象,相比膜表達(dá)型galectin-3蛋白質(zhì)的檢測,針對性強，定量準(zhǔn)確；并且由于不需要消化細(xì)胞，可適用于大規(guī)模連續(xù)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時免疫抑制效カ的檢測。本發(fā)明的方法檢測樣本處理簡便，并可使用儀器進(jìn)行自動或半自動 檢測。


圖1A. PCR結(jié)果分析hUC-MSC mRNA水平表達(dá)galecitn-3，其中I、3、5分別是三批細(xì)胞表達(dá)galectin-3的條帶,2、4、6為相應(yīng)細(xì)胞的β -actin。圖IB. real-time qPCR結(jié)果分析3批hUC-MSC于P2 P5不同代次mRNA水平表達(dá)galecitn-3。以β -actin作為內(nèi)參，對galectin-3的Cp值進(jìn)行2_Δα分析。圖2. Westernblot結(jié)果分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中g(shù)alecitn-3的表達(dá)。圖3. ELISA分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中g(shù)alecitn-3的表達(dá)。圖4.流式細(xì)胞儀分析hUC-MSC表面表達(dá)galectin-3的情況，其中空心部分表示同型對照表達(dá)情況，實心部分(M值)表示galectin-3表達(dá)。圖5A. real-time qPCR 結(jié)果分析 RNA 干擾后 hUC-MSC mRNA 水平表達(dá) galecitn-3，以β -actin作為內(nèi)參，contr組作為對照,對galectin-3的Cp值進(jìn)行分析；其中g(shù)al-3 ▼組表達(dá)量明顯低于contr組和NA組(P < O. 01)。圖5B. ELISA分析RNA干擾后hUC-MSC分泌至上清中的galecitn-3 (ng/ml),統(tǒng)計分析可知gal-3 ▼組表達(dá)量明顯低于contr組和NA組(P < O. 01)。圖5C. ELISA 分析 RNA 干擾后 RIPA 裂解 100 萬個 hUC-MSC 中的 galecitn-3 (ng/ml),其中g(shù)al-3▼組表達(dá)量明顯低于contr組和NA組(P < O. 01)。圖6. BrdU吸收法檢測各共培養(yǎng)組PHA-P刺激的PBMC增殖情況(以光吸收值表示)O 圖7. BrdU吸收法檢測各TranswelI共培養(yǎng)組PHA-P刺激的PBMC增殖情況(以光吸收值表示)。
具體實施例方式實施例I mRNA水平檢測galectin-3表達(dá)連續(xù)培養(yǎng)三批人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)，培養(yǎng)至P4代后，分別消化離心，用RNA提取試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)為cDNA后,用galectin-3引物分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴增(正向引物5 ' -CCAAAGAGGGAATGATGTTGCC-3 ,，反向引物5! -TGATTGTACTGCAACAAGTGAGC-3!)，并進(jìn)行瓊脂糖電泳分析(結(jié)果圖1A);選取相同批次P2 P4代細(xì)胞提取RNA后逆轉(zhuǎn)為cDNA，用real-time qPCR(實時定量PCR)分析，引物序列與PCR相同，并對real-time qPCR結(jié)果進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的分析(結(jié)果見圖IB)。由結(jié)果可知，hUC-MSC在mRNA水平表達(dá)gal ect in_3，且代次之間表達(dá)量無明顯差異。實施例2 Western blot 檢測 galectin-3 蛋白表達(dá)培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)體系為10ml，培養(yǎng)48h后收集上清液備用；細(xì)胞消化后離心計數(shù)，每100萬細(xì)胞加入Iml RIPA試劑(細(xì)胞裂解液，Sigma公司)裂解細(xì)胞。細(xì)胞上清液和RIPA裂解液同時做SDS-PAGE電泳，將電泳條帶用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western blot 分析，一抗為 goat 抗-galectin-3 抗體(R&D 公司)，ニ抗為 rabbit 抗 goatIgG(Abeam公司),結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知,hUC-MSC可表達(dá)galectin-3蛋白，并且此蛋白可分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液中。實施例3 ELISA檢測galectin-3蛋白表達(dá)連續(xù)培養(yǎng)3批人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)體系為10ml，培養(yǎng)48h收集上清液備用；48h末消化細(xì)胞，每100萬細(xì)胞加入Iml RIPA試劑裂解細(xì)胞。細(xì)胞上清液和RIPA裂解液同時做ELISA檢測(galectin-3ELISA試劑盒，Bender公司)，結(jié)果如圖3。進(jìn)ー步證明galectin-3蛋白可在hUC-MSC細(xì)胞中表達(dá)并可分泌至細(xì)胞外。實施例4流式細(xì)胞儀檢測galectin-3表達(dá)連續(xù)培養(yǎng)3批人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)48h后消化細(xì)胞，每100萬細(xì)胞加入5 μ I Alexa488 goat anti galectin-3抗體或同型對照,進(jìn)行流式細(xì)胞分析,檢測細(xì)胞表面galectin-3表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，galectin-3在細(xì)胞表面表達(dá)量可達(dá)47. 95%。實施例5對galectin-3進(jìn)行RNA干擾采用galectin-3 siRNA對hUC-MSC進(jìn)行RNA干擾；同時選擇siRNA的陰性序列作為RNA干擾的陰性對照。galectin-3 siRNA及陰性對照序列來源于 Sigma-Aldrich 公司，其中 galectin-3siRNA的序列(5' -3')如下sense CACUUUAACCCACGCUUCAdTdT,anti-sense UGAAGCGUGGGUUAAAGUGdTdT ；陰性對照序列(5' -3')如下sense :UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，anti-sense :ACGUGACACGUUCGGAGAATT。具體方法為同一來源的細(xì)胞等分為3份，貼壁培養(yǎng)24h后，其中兩份分別加入含有脂質(zhì)體(lipofectamine RNAi MAX, Invitrogen 公司)和 galectin-3 siRNA ( gal-3 T組)或陰性對照序列(NA組)的Opti-MEM溶液,另外ー份不做處理(contr組)。細(xì)胞加入siRNA培養(yǎng)24h后，分別檢測三份細(xì)胞mRNA水平、蛋白水平galectin-3表達(dá)情況。結(jié)果如圖5A-5C，gal-3 ▼組與NA組和contr組相比，hUC-MSC在mRNA水平、蛋白水平表達(dá)galectin-3均顯著降低(P < 0. 01)。經(jīng)RNA干擾后，mRNA水平表達(dá)抑制率為95. 1%，細(xì)胞內(nèi)galectin-3表達(dá)抑制率為6L 2%，細(xì)胞分泌galectin-3抑制率為82. 3%。、
實施例6 hUC-MSC( gal-3▼組/NA組/contr組)與PBMC共培養(yǎng)將6個不同批次的UC-MSC接種于24孔板，相同細(xì)胞各 做3個平行孔，其中2孔分別進(jìn)行g(shù)alectin-3和陰性對照序列的RNA干擾(gal-3 ▼組/NA組)，另一孔不做處理(contr組)。干擾24h后各組細(xì)胞一起與經(jīng)PHA-P刺激的PBMC共培養(yǎng)，48h后BrdU法檢測經(jīng)上述各組hUC-MSC共培養(yǎng)后PBMC的增殖作用，增殖量以O(shè)D值(A450nm-A690nm)表示。如圖6所示，PBMC經(jīng)PHA-P刺激后可顯著增殖(PP組)，然而與hUC_MSC共培養(yǎng)后，PBMC增殖明顯被抑制(NA組和contr組)。而經(jīng)galectin-3 siRNA干擾后，hUC-MSC抑制PBMC能力明顯降低(P < O. 01)。其中PP組為經(jīng)PHA-P刺激的PBMC單獨培養(yǎng)組，gal-3 T組/NA組/contr組為經(jīng)galectin-3 siRNA處理/陰性對照序列處理/不處理的hUC-MSC與經(jīng)PHA-P刺激的PBMC共培養(yǎng)組。gal-3 ▼組與NA組相比hUC-MSC對PBMC增殖抑制率降低了 69. 03 %。說明抑制率計算方法inhibitiongai—3T= (ODpp-ODgai—3T ) / ODpp,
(0D值為各組平均值，其他共培養(yǎng)組抑制率算法相同)。抑制率降低率算法Δ inhibition= (inhibitiongai.3T-inhibition να) / inhibition να, η=6。以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)galectin-3 siRNA干擾后，hUC-MSC抑制PHA-P刺激的PBMC增殖能力明顯下降(P < 0. 01)，表明galectin-3的表達(dá)對于hUC-MSC免疫抑制有重要作用。實施例7 hUC-MSC ( gal-3 ▼組 /NA 組 /contr 組)與 PBMC 經(jīng) TranswelI 小室共培
養(yǎng)將6個不同批次的hUC-MSC接種于24孔板，相同細(xì)胞各做3個平行孔，其中2孔分別進(jìn)行g(shù)alectin-3 siRNA和陰性對照序列處理(gal-3 ▼組/NA組)，另一孔不做處理(contr組)。RNA干擾24小時后各孔細(xì)胞分別植入transwell小室，在小室中加入經(jīng)PHA-P刺激的PBMC，共培養(yǎng)48h后BrdU法檢測經(jīng)上述各組hUC-MSC共培養(yǎng)后PBMC的增殖作用，增
殖量以O(shè)D值表示。在transwell作用下，hUC-MSC主要通過分泌各種抗炎癥因子而對PBMC增殖產(chǎn)生抑制作用。如圖7所示，transwell存在情況下，hUC-MSC仍然可以顯著抑制PBMC増殖(NA組和contr組)。而經(jīng)galectin-3 siRNA干擾后，hUC-MSC抑制PBMC能力明顯降低(P< 0. 01)。gal-3 ▼組與NA組相比hUC-MSC對PBMC增殖抑制率降低了 79. 22%。經(jīng)RNA干擾后的hUC-MSC分泌至細(xì)胞外的galectin-3表達(dá)量降低，從而使其抑制PBMC增殖的能力降低率高達(dá)79%，說明分泌型的galectin-3在hUC-MSC免疫抑制過程中起主要作用，可作為檢測hUC-MSC免疫調(diào)節(jié)能力的標(biāo)志性因子。實施例8 hUC-MSC上清galectin-3含量檢測連續(xù)培養(yǎng)6批不同批號的hUC-MSC，按I. 5X IO6/瓶細(xì)胞接種于T75細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)體系為IOml培養(yǎng)液。從P2代開始至P6代，每批細(xì)胞傳代接種48小時后取Iml上清液，用galectin-3 ELISA試劑盒檢測上清液中g(shù)alectin-3的含量(如表I所示)。6批細(xì)胞在各代次間差異不顯著(P > 0. 05)，各批次和各代次細(xì)胞平均值(土標(biāo)準(zhǔn)差)為5. 23 (±0. 45)ng/ml。表I 6批次UC-MSC P2 P6代培養(yǎng)48小時后上清中g(shù)alectin-3含量
Γ MSCl ] MSC2 Γ MSC3 J MSC4 l' MSC5 [ MSC6 ] Mean [ Std.:
權(quán)利要求
1.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法，其特征在于通過檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量來判斷其免疫抑制效力。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法，其中所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量以2. 62ng/ml為閾值，低于此數(shù)值的判定為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制效カ不合格。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任ー項所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效カ的檢測方法，其中使用ELISA方法檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)效力的檢測方法，其特征在于通過檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中g(shù)alectin-3的含量來判斷細(xì)胞的免疫抑制能力強弱，針對性強，定量準(zhǔn)確；并且由于不需要消化細(xì)胞，可適用于大規(guī)模連續(xù)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時免疫抑制效力的檢測。本發(fā)明的方法檢測樣本處理簡便，并可使用儀器進(jìn)行自動或半自動檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102643909SQ20121009680
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者劉廣洋, 劉擁軍, 徐燚, 朱德琳, 聶艷波 申請人:天津和澤干細(xì)胞科技有限公司