專利名稱：一種檢測(cè)人壽命的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SNP領(lǐng)域，特別涉及與人類壽命相關(guān)的SNP。
背景技術(shù)：
SNP,單核苷酸多態(tài)性，是指染色體DNA序列的某個(gè)位點(diǎn)上的單個(gè)堿基(A，T，C或者G)發(fā)生的變異，是繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩種遺傳標(biāo)記之后出現(xiàn)了第三代遺傳標(biāo)記。SNP分布廣泛、數(shù)目多且相對(duì)穩(wěn)定地存在人類染色體上，與許多生物性狀的改變直接相關(guān)?，F(xiàn)有的許多調(diào)查顯示，人類基因組中存在與人壽命相關(guān)的SNP。在動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校芏鄦位虻淖儺惗寄軌驅(qū)е聞?dòng)物模型壽命的改變；然而自然界中人類和動(dòng)物的壽命則表現(xiàn)出非常復(fù)雜的特性。近年來(lái)，有關(guān)長(zhǎng)壽基因的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，候選基因篩查和全基因組掃描分析都被用于長(zhǎng)壽基因及位點(diǎn)的鑒定。目前公認(rèn)的與長(zhǎng)壽相關(guān)的位點(diǎn)區(qū)域有三個(gè)AP0E、F0X03A和AKT1，這三個(gè)位點(diǎn)在多個(gè)獨(dú)立人群試驗(yàn)中均得到了證實(shí)。全基因組掃描分析也鑒定了一些與長(zhǎng)壽相關(guān)的位點(diǎn)區(qū)域4q25、3p24-22、9q31-34、12q24等，但這些位點(diǎn)在多個(gè)獨(dú)立人群中沒(méi)有得到驗(yàn)證。由于基因存在一定程度上的遺傳異質(zhì)性，國(guó)外報(bào)道的與人壽命有關(guān)的SNP不一定存在于中國(guó)人的基因組中。因此，對(duì)我國(guó)的長(zhǎng)壽人群進(jìn)行深入研究，以發(fā)現(xiàn)中國(guó)人的長(zhǎng)壽基因，對(duì)于提升國(guó)民身體素質(zhì)、改善國(guó)民生活質(zhì)量具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了檢測(cè)人類壽命長(zhǎng)短的方法。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人壽命的試劑盒，它包括任選的用于檢測(cè)T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異的相關(guān)試劑。所述的試劑盒，包括檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑；所述的試劑盒還包括任選的用于擴(kuò)增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。上述檢測(cè)T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。上述檢測(cè)T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為測(cè)序用試劑、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法用試劑或者單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析用試劑。本發(fā)明還提供T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異在制備用于檢測(cè)人壽命的試劑中的用途。所述的試劑包括檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基 因rs4713607G — A變異的試劑；所述的試劑還包括任選的用于擴(kuò)增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。
上述檢測(cè)T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。上述檢測(cè)T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為測(cè)序用試劑、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法用試劑或者單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析用試劑。本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定來(lái)源于人的基因組DNA，樣品沒(méi)有限制，如體液(如血液、腹水和尿液)、組織細(xì)胞(如肝組織)等，通過(guò)提取和純化這些樣品均可制備基因組DNA。本發(fā)明首次闡明了 T0MM40基因rs2075650位點(diǎn)和HLA-DPB2基因rs4713607位點(diǎn)多態(tài)性與長(zhǎng)壽的相關(guān)性。使用本發(fā)明提供的試劑盒，可以預(yù)測(cè)待檢人群壽命長(zhǎng)短的傾向，對(duì)控制人類衰老的進(jìn)程有重要作用。待檢人群的T0MM40基因rs2075650位點(diǎn)若為A等位基因，他們長(zhǎng)壽的可能性增加2. 12，HLA-DPB2基因rs4713607位點(diǎn)若為A等位基因，他們長(zhǎng)壽的可能性增加I. 30倍。染色體DNA同一位置上的每個(gè)堿基類型叫做一個(gè)等位位點(diǎn)，SNP在人群中只有兩種等位型，故亦稱為雙等位標(biāo)記，其檢測(cè)是一種或“全/無(wú)”的檢測(cè)方式。SNP的檢測(cè)方法多種多樣，可分為測(cè)序法、雜交法、溶解法、電泳法、化學(xué)法、酶學(xué)法、物理法以及它們的組合方法，這些方法均是檢測(cè)核苷酸變異的常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段。這些方法中，測(cè)序法可以確定SNP位點(diǎn)的堿基類型，其他方法均僅能判斷SNP的有無(wú)。本發(fā)明公開(kāi)了 T0MM40基因rs2075650位點(diǎn)變異和HLA-DPB2基因rs4713607位點(diǎn)變異的堿基類型，且T0MM40基因和HLA-DPB2基因的序列已知，用現(xiàn)有檢測(cè)核苷酸變異的方法均可以檢測(cè)上述兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。


圖I是Snapshot檢測(cè)SNP rs2075650位點(diǎn)的基因分型圖譜圖2是Snapshot檢測(cè)SNP rs4713607位點(diǎn)的基因分型圖譜
圖3是通過(guò)PCR擴(kuò)增含有所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的DNA片段的反應(yīng)條件 圖4單堿基引物延伸反應(yīng)的反應(yīng)條件
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。用于下列實(shí)施例中表示試劑均為市售品，其英文縮寫(xiě)如下。需要時(shí)，用高壓鍋(120°C，20分鐘)滅菌EDTA 乙二胺四乙酸二鈉SDS :十_■燒基硫酸納TE IOmM Tris-HCl (pH7. 5)、ImM EDTA (pH8. 0)dNTP :脫氧核苷三磷酸實(shí)施例I樣本收集和基因組DNA的提取樣本是由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院人類疾病基因研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集。共計(jì)收集95歲以上長(zhǎng)壽樣本233例，平均年齡99. 7±6. I歲，其中男性占41. 2%；對(duì)照樣本669例，平均年齡53. 2±9. 2歲，其中男性占42. 9%。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書(shū)，這一研究也得到了倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 根據(jù)下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5ml人外周血在3000rpm離心分離30分鐘除去血清。接著加入0. 2% NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在3000rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入IOmM Tris-HCl (pH8. 0)和IOmM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10%SDS, 25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16 y I和20 yl，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37°C過(guò)夜溫育懸液。過(guò)夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酹/氯仿溶液混合,接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘，除去水層。最后,用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC (pH5. 2)，兩倍量的冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀。用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。最后將所得的基因組DNA溶解于TE中，然后定量測(cè)定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液濃度校正至50ng/yl，置_20°C冰箱保存。實(shí)施例2 T0MM40基因rs2075650位點(diǎn)和HLA-DPB2基因rs4713607位點(diǎn)多態(tài)性的分析T0MM40基因rs2075650和HLA-DPB2基因rs4713607單核苷酸多態(tài)性的基因型分析可以用現(xiàn)有的SNP檢測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)，如，測(cè)序方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法，Snapshot檢測(cè)方法等。本發(fā)明采用Snapshot基因分型技術(shù)對(duì)rs2075650和rs4713607兩個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟如下I、PCR :95°C變性5分鐘；95°C 30秒、55°C退火30秒、72°C延伸45秒，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7分鐘，4°C保溫。2、純化I =PCR產(chǎn)物各取3 ill (另加3 U I ddH20補(bǔ)足9 U I),加入混合液3 U I (SAP2 iil，I 10Exo I 酶 I ill)。I : IOExol 酶的配制方法I 體積 Exol 酶，I 體積 SAP IOXbuffer,8 體積 ddH20。程序37°C Ih, 75°C 15min。3、Snapshot 反應(yīng)Snapshot Multiplex I U I, PCR 純化產(chǎn)物 I U I, Snapshot 引物每個(gè)為 0. 2u I, ddH20 補(bǔ)足 I。程序96°C I 分鐘，96°C 10 秒，50°C 5 秒，60°C 30 秒，25個(gè)循環(huán)，4°C保溫。4、純化2 :每個(gè)反應(yīng)加SAP 0. 5-l.OiU，程序:37°C I小時(shí)，75°C 15分鐘，4°C保溫。5、liU上述產(chǎn)物加9iU HD。程序95°C，5分鐘，迅速置于冰上，冷卻后上機(jī)檢測(cè)。PCR 引物對(duì) A(rs2075650)F:5，-GTGGCAGTGAGATTTGAGCA-3’R:5， -TGGGTAAGGACACCAGGAAG-3，PCR 引物對(duì) B (rs4713607)F:5，-TTCTCAGATGGTTCCCTTGG-3’R:5， -TGAAAGAATGGGGACGAAAG-3，
所得到的擴(kuò)增序列如下序列I (rs2075650) 282bp GGCAGTGAGATTTGAGCAagcaaaggccctggccctgtctaactaggctgtactgcctctttacaggtggaatcctttgtgagatgttctgctgtgggtctctggagagagctgggggtggtagggaaggaagagatgagagtt
ggtgtggggttgg ；|G/^ gtggagtgtgacagcgtttctcttctccagagctgtttcccattcagatggagggtgt
caagctcacagtcaacaaagggttgagtaaccattttcaggtgagcCTTCCTGGTGTCCTTACCCA
序列2 (rs4713607) 297bp TTCTCAGATGGTTCCCTTGGaaattgcctttctaattctgggggattattttctataggcctacctgatatgcctatttaaaaagctgggctgatcttaca IG/N tgcttgcaaaggtttagtaaaaaagccatgcccttgtgcaaaagaaaatgagtcacttttctcttcaaagtcctgaggttaaaggagttccagtgtttcagagtgcactccagaggggtgcaag ctgaagctggtctgtcacccatctagaaaaagaagtgagaataaaagtatcCTTTCGTCCCCATTCTTTCASnapshot 引物 ICrs2O7565O)5， -GAGAGTTGGTGTGGGGTTGG-3’Snapshot 引物 II (rs4713607)5’ -ACCTGATATGCCTATTTAAAAAGCTGGGCTGATCTTACA-3’圖I 圖2為Snapshot檢測(cè)rs2075650和rs4713607的基因型圖。實(shí)施例3 T0MM40基因rs2075650位點(diǎn)和HLA-DPB2基因rs4713607位點(diǎn)多態(tài)性與長(zhǎng)壽的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)方法利用SPSS 13. 0軟件進(jìn)行分析,檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè),數(shù)量變量采用t檢驗(yàn)，質(zhì)量變量采用卡方檢驗(yàn)。雙側(cè)P <0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異顯著。結(jié)果如下I)入選樣本基本臨床資料
臨床資料對(duì)照__長(zhǎng)壽人群
人數(shù)169" 233
~^齡53.2±9.2 99.7±6.1**注**，P<0.01。2) SNP位點(diǎn)多態(tài)性與長(zhǎng)壽密切相關(guān)rs2075650
/Utr 基因型等位基因頻率出 分組---G A -- P 值 OR 值(95%CI)
GG AG AA____G__A___
對(duì)照 12 125 532 149 1189 0.111 0.889
--------0.00048 2.12 (1.38-3.26)
長(zhǎng)壽 0 丨 26 丨 207 丨 26 丨 440 0.056 0.944 __rs2075650的A等位基因可使長(zhǎng)壽的可能性顯著增加(0R = 2. 12，95 % Cl =I. 38-3. 26)，即長(zhǎng)壽可能性增加2. 12倍。見(jiàn)圖I。rs4713607
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人壽命的試劑盒，其特征在于它包括任選的用于檢測(cè)T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異的相關(guān)試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于它包括檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑；還包括任選的用于擴(kuò)增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為測(cè)序用試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法用試劑或者單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析用試劑。
6.T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異在制備用于檢測(cè)人壽命的試劑中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的試劑包括檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑；所述試劑還包括任選的用于擴(kuò)增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G— A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G— A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為測(cè)序用試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的檢測(cè)T0MM40基因rs2075650G—A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法用試劑或者單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析用試劑。
全文摘要
一種檢測(cè)人壽命的試劑盒，本發(fā)明涉及SNP領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人壽命的試劑盒，它包括任選的用于檢測(cè)TOMM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異的相關(guān)試劑。本發(fā)明還提供了TOMM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異在制備用于檢測(cè)人類壽命的試劑中的用途。本發(fā)明首次闡明了TOMM40基因rs2075650位點(diǎn)和HLA-DPB2基因rs4713607位點(diǎn)多態(tài)性與長(zhǎng)壽的相關(guān)性。使用本發(fā)明提供的試劑盒，可以預(yù)測(cè)待檢人群壽命，對(duì)控制人類衰老的進(jìn)程有重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102618650SQ20121009853
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者劉小琦, 楊正林, 石毅, 魯芳 申請(qǐng)人:四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(四川省人民醫(yī)院)