專利名稱：一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法。
背景技術：
炭疽桿菌是一種桿狀、能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌，能夠引起人畜的炭疽病，如 果不及時治療，死亡率極高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性極強，對世界各地的人類健康及畜牧業(yè)都構成了嚴重威脅。炭疽桿菌的芽孢接觸到皮膚傷口、消化道或呼吸道上皮后，將感染并會導致皮膚炭疽、肺炭疽、腸道炭疽等疾病。肺炭疽最為嚴重，將很快導致疾病和死亡。炭疽桿菌還被用作生物戰(zhàn)劑和制造生物恐怖，對社會穩(wěn)定構成威脅。故炭疽桿菌相關研究一直廣受關注。定量蛋白質(zhì)組學是把一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進行精確的定量和鑒定的一門學科。這一概念的提出標志著蛋白質(zhì)組技術的不斷改進和完善。蛋白質(zhì)組學研究已從對蛋白質(zhì)簡單的定性向精確的定量方向發(fā)展。蛋白質(zhì)組定量的概念是試圖準確地測定蛋白質(zhì)組間相對含量的差別，而不在于測定其絕對的濃度。2002年，丹麥Mann實驗室建立了 SILAC技術，并首次將其應用于定量蛋白質(zhì)組研究，為全面、系統(tǒng)地定性和定量分析細胞復雜蛋白質(zhì)組提供了有效的方案。SILAC基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(重型)標記的必需氨基酸取代培養(yǎng)基中相應氨基酸，賴氨酸合成缺陷的菌株只能利用培養(yǎng)基中添加的賴氨酸，因而經(jīng)5-6個生長周期后，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸將會完全摻入到新合成的蛋白質(zhì)中替代原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按等比例混合，經(jīng)分離純化后即可進行定量質(zhì)譜鑒定。SILAC具有無可比擬的巨大優(yōu)勢它是一種體內(nèi)標記技術，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸與天然氨基酸化學性質(zhì)基本相同，對細胞無毒性，因而所標記的細胞和未標記細胞在生物學行為上幾乎沒有差異，所得實驗結(jié)果也自然更加接近樣品真實狀態(tài)，并且其標記效率可高達100%。因此，可以說，SILAC技術是定量蛋白質(zhì)組學研究的不二選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種制備重組菌A的方法。本發(fā)明提供的方法，為將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，即得到重組菌A。上述方法中，所述將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因通過同源重組實現(xiàn)。上述方法中，所述同源重組包括如下步驟I)將含有抗性篩選標記物基因的片段導入所述炭疽桿菌中，通過同源重組將所述抗性篩選標記物基因替換掉所述炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，得到同源重組后重組菌B ;所述含有抗性篩選標記物基因的片段具體通過重組載體導入炭疽桿菌中；所述含有抗性篩選標記物基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列I ;2)將所述重組菌B在37°C -40°c培養(yǎng)，以去除所述重組載體，得到重組菌C。
上述方法中，步驟I)中，所述含有抗性篩選標記物基因的片段通過重組載體導入炭疽桿菌中；所述重組載體為將序列表中的序列I所示DNA片段通過同源重組插入溫度敏感型穿梭質(zhì)粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質(zhì)粒具體為PKSV7 ；上述方法中，在所述步驟I)前，還包括將所述重組載體去甲基化的步驟。上述將所述重組載體去甲基化的方法包括如下步驟I)、將所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌D ；2)、從所述重組菌D中提取質(zhì)粒，得到去甲基化的重組載體。上述方法中，在所述步驟I)和步驟2)之間還包括將所述重組菌B經(jīng)過傳代培養(yǎng)的步驟。在所述步驟2)后，還包括將所述重組菌C分別在僅含有所述抗性篩選標記物培養(yǎng)基和僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取在僅含有所述抗性篩選標記物培養(yǎng)基生長且在僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養(yǎng)基上不生長的菌，得到重組菌A。上述方法中，所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ；所述抗性篩選標記物為壯觀霉素，其核苷酸序列為序列I自5’末端第934-2215位核苷酸；所述重組載體的抗性篩選標記物I為氯霉素。上述炭疽桿菌為炭疽桿菌A16。由上述的方法制備的重組菌A也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明提供的DNA分子，為如下⑴或⑵或(3):(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。 本發(fā)明的第三個目的是一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將上述的DNA分子插入溫度敏感型穿梭質(zhì)粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質(zhì)粒具體為PKSV7。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的方法構建了炭疽桿菌野生株A16的賴氨酸基因缺失株，其不能自身合成賴氨酸，只能從外源獲取。該缺失株的成功構建為進一步做定量蛋白質(zhì)組學研究奠定了基礎。


圖I為序列I各序列組成的結(jié)構2為同源重組原理進行各片段連接示意3為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 a PCR鑒定4為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 a質(zhì)粒酶切5為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SCSllO菌落PCR圖6為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SCSI 10PCR鑒定7為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SCSllO質(zhì)粒酶切8為重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)A16鑒定圖9為目的菌株外部及內(nèi)部引物PCR鑒定圖10為突變株表型鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株A16/ ALysA: : spc的獲得一、A16/去甲基化pKLysAUSD的獲得I、重組質(zhì)粒pKLysAUSD的構建I)溫敏型質(zhì)粒線性化骨架質(zhì)粒溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7 :Smith K, Youngman P. Use of a newintegrational vector to investigate compartment-specific expression of theBacillus subtilis spoIIM gene [J] Biochimie，1992，74 :705-711.公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所獲得，含氯霉素抗性基因cat。將溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7(6. 9Kb)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI酶切線性化，得到線性化PKSV7。從凝膠上切下目標條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體片段，操作步驟按照說明書進行。2)目標基因(LysA)上下游同源臂的獲取
使用Primer premier 5. 0軟件,根據(jù)炭疽桿菌Ames株染色體上賴氨酸合成基因LysA基因(NC003997的第1361225-1362541位)上下游序列，設計LysA基因上下游同源臂序列的引物(LysU_HindF和LysU_R擴增up片段,LysD_F和LysD_EcoR擴增down片段,如表I所示)。表I研究中使用的引物
權利要求
1.一種制備重組菌A的方法，包括如下步驟將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，即得到重組菌A。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因通過同源重組實現(xiàn)。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其特征在于 所述同源重組包括如下步驟 1)將含有抗性篩選標記物基因的片段導入所述炭疽桿菌中，通過同源重組將所述抗性篩選標記物基因替換掉所述炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，得到同源重組后重組菌B ;所述含有抗性篩選標記物基因的片段具體通過重組載體導入炭疽桿菌中； 所述含有抗性篩選標記物基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 2)將所述重組菌B在37°C-40°C培養(yǎng)，以去除所述重組載體，得到重組菌C。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 所述重組載體為將序列表中的序列I所示DNA片段插入溫度敏感型穿梭質(zhì)粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質(zhì)粒具體為PKSV7。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 在所述步驟I)前，還包括將所述重組載體去甲基化的步驟。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 所述將所述重組載體去甲基化的方法包括如下步驟 1)、將所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌D； 2)、從所述重組菌D中提取質(zhì)粒，得到去甲基化的重組載體。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于 在所述步驟I)和步驟2)之間還包括將所述重組菌B經(jīng)過傳代培養(yǎng)的步驟。
在所述步驟2)后，還包括將所述重組菌C分別在僅含有所述抗性篩選標記物培養(yǎng)基和僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取在僅含有所述抗性篩選標記物培養(yǎng)基生長且在僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養(yǎng)基上不生長的菌，得到重組菌A。
8.根據(jù)權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于 所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ； 所述抗性篩選標記物為壯觀霉素； 所述重組載體的抗性篩選標記物I為氯霉素。
9.由權利要求1-8中任一所述的方法制備的重組菌A。
10.一種DNA分子，為加下(I)或⑵或(3): (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
或一種重組載體，為將所述的DNA分子插入溫度敏感型穿梭質(zhì)粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質(zhì)粒具體為PKSV7。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法。本發(fā)明提供方法，為將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因得到的重組菌。上述方法中，所述抗性篩選標記物基因為壯觀霉素抗性基因；所述壯觀霉素抗性基因的核苷酸序列具體為序列表中序列1自5’末端第1018-2147位核苷酸。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的方法構建了炭疽桿菌野生株A16的賴氨酸基因缺失株，其不能自身合成賴氨酸，只能從外源獲取。該缺失株的成功構建為進一步做定量蛋白質(zhì)組學研究奠定了基礎。
文檔編號C12N15/80GK102628019SQ201210099920
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權日2012年4月6日
發(fā)明者馮爾玲, 劉先凱, 朱力, 王恒樑, 王雪芳, 高飛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所