專(zhuān)利名稱(chēng)：一種安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪Mdna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)一種安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪MDNA的方法，涉及血液總DNA制備技術(shù)， 屬于動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因組DNA (genomic DNA)是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，是進(jìn)行基因操作的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，在基因組學(xué)研究中占有重要地位。脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA) 一類(lèi)帶有遺傳信息的生物大分子，由4種主要的脫氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMT和dTMP)通過(guò)3'，5'-磷酸二酯鍵連接而成。它們的組成和排列不同，顯示不同的生物功能，如編碼功能、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控功能等。為了進(jìn)行測(cè)序、雜交和基因的表達(dá)，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提。DNA的提取是分子生物學(xué)研究中的基本技術(shù)，DNA樣品的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要。經(jīng)典方法中，從樣品溶液中去除蛋白質(zhì)采用酚/仿抽提，其標(biāo)準(zhǔn)程序是酚抽提一次， 酚/仿抽提一次，氯仿抽提一次，有些情況下還要重復(fù)幾次，這樣就大大增加了工作量。同時(shí)，酚具有高度腐蝕性，易引起嚴(yán)重的燒傷；氯仿則作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有麻醉作用，對(duì)心、肝、腎有損害，吸入或經(jīng)皮膚吸收引起急性中毒。所以，傳統(tǒng)的操作方法對(duì)操作人員的身體傷害非常大。目前，雖然有相關(guān)的試劑盒，但是其中大部分均含有對(duì)身體不利的有毒有害物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪MDNA的方法，克服了現(xiàn)在常用的方法中有害溶劑對(duì)人體危害的影響，具有提取的基因組DNA質(zhì)量良好、且省時(shí)省力、降低成本等特本發(fā)明公開(kāi)的安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪MDNA的方法，采用以下技術(shù)方案 利用Triton X-100和SDS裂解血細(xì)胞，而無(wú)需蛋白酶K的處理，縮短了消化的時(shí)間、節(jié)
約了實(shí)驗(yàn)的成本；利用飽和NaCl沉淀蛋白質(zhì)，通過(guò)離心使蛋白質(zhì)分離出去，這就避免了有機(jī)溶劑對(duì)人體的危害和對(duì)環(huán)境造成污染。具體步驟如下
(1)取200-300份抗凝血和400-500份低鹽緩沖液加入I.5 ml離心管中，充分混勻， 室溫下I 000-1500 RPM離心8-12 min，棄上清；
(2)加入400-500份低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I000-1500 RPM離心3-8 min, M 復(fù)上一步驟；
(3)小心吸出上清，加入300份細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，60-70°C水浴8-12min ；
(4)加入70-80份飽和NaCl，充分混勻，室溫下10000-12000 RPM離心3-8 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
(5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000-12000 RPM離心2_5 min,棄上清；
(6)加入400-600份冰浴的70%-80%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10000—12000 RPM離心1-5min,棄上清；
(7)烘箱中 60-70 °C 干燥 5-15 min，加入 80-150 μ I ddH20，60-70 °C 水浴 10-20 min, -20°C保存。上述的試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 6-7. 8):12-13份Tris堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水。(2)細(xì)胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份Triton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液。
本發(fā)明的提取方法平均基因組DNA得率介于Rapid Method法和試劑盒法之間，基因組 DNA得率較理想，能較好地滿(mǎn)足研究的需要。DNA純度通常用A260/A280比值來(lái)檢測(cè)，本發(fā)明的提取方法測(cè)得的A260/A280比值為I. 35 I. 68，平均為I. 46 ;而Rapid Method法和試劑盒法的平均A260/A280比值分別為1.37、1.56。分子克隆中報(bào)道，沒(méi)有酚的核酸樣品其 A260/A280比值應(yīng)為I. 2左右。本發(fā)明的積極效果在于減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞；防止和抑制DNase 對(duì)DNA的降解；排除有機(jī)溶劑、金屬離子及其他核酸分子的污染；使蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等降低到最低程度；提取的DNA具有一定的長(zhǎng)度；純化后存在對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì)。是一種綠色、快速、操作簡(jiǎn)單的從動(dòng)物血液中提取基因組DNA的方法。克服了現(xiàn)在常用的方法中有害溶劑對(duì)人體危害的影響，避免了以往從血液中提取 DNA過(guò)程中，使用酚、仿、異丙醇等對(duì)身體有害的有機(jī)溶劑，同時(shí)也避免了使用蛋白酶K等昂貴的試劑，整個(gè)過(guò)程不到I小時(shí)，非常快速，且DNA質(zhì)量良好。所以本發(fā)明從科研人員的人身健康出發(fā)，并保證提取的基因組DNA質(zhì)量良好、且省時(shí)省力、降低成本。


圖I基因組DNA的電泳分析；
M λ DNA /EcoR I +Hind TTT Marker ； 1-4 :本發(fā)明的提取方法；5 Rapid Method 法；6 試劑盒法；
圖2基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳分析；
M DNA Marker ;1_4:本發(fā)明的提取方法5 Rapid Method法；6 :試劑盒法；0 :陰性對(duì)昭.
圖3基因組DNA的酶切產(chǎn)物電泳分析；
M λ DNA /EcoR I +HindIII Marker ; 1-3:基因組 DNA ;E: EcoR I ；B: BamH I。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
實(shí)施例I:
試劑的配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 6)800ml蒸餾水溶解I. 21gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 38g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸鈉)，Iml Triton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。操作步驟
1)取梅花鹿的200μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心10 min，棄上清；
2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000 RPM離心2 min,棄上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10 000 RPM離心I min，棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。實(shí)施例2 試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 6)800ml蒸餾水溶解I. 21gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 38g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸鈉)，Iml Triton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。操作步驟
1)取馬鹿的200μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻， 室溫下I 000 RPM離心10 min，棄上清；
2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000 RPM離心2 min,棄上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10 000 RPM離心I min，棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。實(shí)施例3 試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 7) 800ml蒸餾水溶解I. 27gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 5g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 78g MgCl2、0. 46gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入O. 8克SDS (十二烷基硫酸鈉)，O. 8ml Triton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。
操作步驟
1)取(馴鹿、坡鹿、水鹿、麋鹿、點(diǎn)鹿、白唇鹿)各200μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心10 min，棄上清；
2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000 RPM離心2 min,棄上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10 000 RPM離心I min，棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min，既得，_20°C保存。實(shí)施例4 試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7.6)800ml蒸餾水溶解I. 3克Tris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 3g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 74g MgCl2、0. 46gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入I. 2g SDS (十二烷基硫酸鈉)，I. 2ml Triton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。操作步驟
1)取豬的200μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心10 min,棄上清；
2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000 RPM離心2 min,棄上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10 000 RPM離心I min，棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。實(shí)施例5 試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 8)800ml蒸餾水溶解I. 22gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 29g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 74g MgCl2、0. 49gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入I. Ig SDS (十二烷基硫酸鈉)，I. ImlTriton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。操作步驟
I)取牛的200 μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心10 min,棄上清；2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000 RPM離心2 min,棄上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10 000 RPM離心I min，棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。實(shí)施例6 試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 8)800ml蒸餾水溶解I. 29gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 29g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0· 74g MgCl2、0. 5gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入I. Ig SDS (十二烷基硫酸鈉)，I. ImlTriton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。操作步驟
1)取羊的200μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心10 min,棄上清；
2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000 RPM離心2 min,棄上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10 000 RPM離心I min，棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。實(shí)施例7 試劑配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 8) 800ml蒸餾水溶解I. 19gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 4g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0. 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細(xì)胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入O. 9gSDS (十二烷基硫酸鈉)，O. 9mlTriton X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)。操作步驟
1)取雞的200μ I抗凝血和400 μ I低鹽緩沖液加入I. 5 ml離心管中，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心10 min,棄上清；
2)加入500μ I低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下I 000 RPM離心5 min，重復(fù)上一步驟；
3)小心吸出上清，加入300μ I細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I飽和NaCl，充分混勻，室溫下12 000 RPM離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5 ml離心管中；
5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000RPM離心2 min，棄上清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10000 RPM離心I min,棄上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。試驗(yàn)例I :
基因組DNA的質(zhì)量評(píng)估。(I)瓊脂糖凝膠電泳
為了評(píng)估基因組DNA的完整性，分別取梅花鹿、馬鹿、馴鹿、水鹿、白唇鹿、麋鹿、點(diǎn)鹿、 豬、牛、羊、雞的DNA樣品3 ul，0. 7%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果并拍照保存。見(jiàn)圖I。(2)分光光度法
為了評(píng)估基因組DNA的濃度和純度，分別取梅花鹿、馬鹿、馴鹿、水鹿、白唇鹿、麋鹿、點(diǎn)鹿、豬、牛、羊、雞的DNA樣品各10 ul于190 ul ddH20中，充分混勻，分光光度計(jì)分別測(cè)定其A260和A280的吸光值，計(jì)算得到DNA樣品的濃度和純度。DNA純度通常用A260/A280比值來(lái)檢測(cè)，本發(fā)明的提取方法測(cè)得的A260/A280比值為I. 35 I. 68，平均為I. 46 ;而Rapid Method法和試劑盒法的平均A260/A280比值分別為I. 37、I. 56。分子克隆中報(bào)道，沒(méi)有酚的核酸樣品其A260/A280比值應(yīng)為I. 2左右。這說(shuō)明本發(fā)明的提取方法提取的DNA純度較好。結(jié)果如下表
動(dòng)_名稱(chēng)左家梅花 東車(chē)悔 Ε悪I實(shí)施PJ I實(shí)》例iDNA隨 < OD) !.35 s^4aDM A樽學(xué) (Hg/2O Oui) IM 4 23藥 Κ電》藥 m TO W. ^ 無(wú)彌 Ife 完S、死雜K興a湖梅芘IiI實(shí)施《I!.685 21憲整、無(wú)鄯歡音海馬鹿I實(shí)施W 2!.4 2UZTC整■·無(wú)鄭歡甘爾馬Bi Sfi 例 2.394拜S、Λ 歡天山馬, I實(shí)臟《21.4 54 $7完整、無(wú)》歓P可爾.泰馬I!I實(shí)關(guān)21.011-92培a木馬g1實(shí)施《21.474 3芫S、無(wú)》 IJiIftI實(shí)施《31.564 19完整、無(wú)》歡水廳1.534 12憲塗..先輙K被鏖I實(shí)旌閔31.464 02秀S、無(wú)你R! ir ；!I實(shí)施《33.3 $完S、無(wú) 歡!實(shí)關(guān)3I >10SIiffi}實(shí)施《3L5I3 93完S、無(wú)彌歡Sf·i 實(shí) SPli1.4 3I 65完磬、無(wú)彌黻牛I 實(shí)1.543-61芫整、無(wú)齚黻蘋(píng)|買(mǎi)施ftu1.3 -J 78完靈、ft Sf K5 I實(shí)α例？3.40I 58.、無(wú)辭
(3)PCR擴(kuò)增
為了驗(yàn)證本發(fā)明的提取方法提取所得基因組DNA是否影響PCR擴(kuò)增，對(duì)本發(fā)明的提取方法提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以梅花鹿基因組為例說(shuō)明，得到的PCR產(chǎn)物如圖2所
/Jn οPCR 試劑的工作濃度Taq 酶 5U/ul，10PCR buffer 包含 500 mM KCl 和 15 mM MgC12，dNTPs 100 μ M，牛特異性引物20 μ M。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR System 9700上進(jìn)行， 15 ul 體系ddH20 9.3ul、10 X Buffer I. 5ul、dNTPs 2. Oul、引物 I 和引物 2 各 0.5ul、7^ 酶 0.2ul、DNA 模板 I. Oul。
PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s, 30 cycles ；72°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后取5 ul PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)中記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖2中可知，所有的DNA樣品均擴(kuò)出了 124 bp左右的tRNA_Val_16S rRNA目的片段，而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)出目的片段?？梢?jiàn)，本發(fā)明的提取方法提取所得基因組DNA具有較好的質(zhì)量，無(wú)抑制Taq酶活性的物質(zhì),適用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。與Rapid Method法相比，以本發(fā)明的提取方法提取所得基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得的PCR產(chǎn)物量更多。(4)基因組DNA的酶切反應(yīng)
為了驗(yàn)證本發(fā)明的提取方法提取所得基因組DNA是否影響酶切反應(yīng)，以梅花鹿基因組為例，使用EcoR I和BamH I限制性酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切(圖3)。反應(yīng)體系為1ul EcoR I 或BamH I，2 ul IOK buffer(200 mM Tris-HCl ρΗ8· 5， 100 mM MgCl2,10 mM DTT，I 000 mM KCl),6 ul 基因組 DNA，補(bǔ)加 ddH20 至終體積為 10 ul。 混勻后37 1水浴反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后取5 ul酶切產(chǎn)物在O. 7%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)中記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖中可知，提取的基因組DNA經(jīng)過(guò)EcoR I和BamH I酶切后，電泳圖中僅有非常弱的彌散條帶，說(shuō)明本發(fā)明提取的基因組DNA是限制性酶的良好底物，可以成功地進(jìn)行酶切。
權(quán)利要求
1.一種安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪MDNA的方法，包括以下步驟(1)取200-300份抗凝血和400-500份低鹽緩沖液加入到離心管中充分混勻，室溫下 1000-1500 RPM 離心 8-12 min，棄上清；(2)加入400-500份低鹽緩沖液，充分混勻，室溫下1000-1500RPM離心3_8 min，重復(fù)上一步驟；(3)吸出上清，加入300份細(xì)胞裂解液，移液器吹打混勻，60-70°C水浴8-12min ；(4)加入70-80份飽和NaCl，充分混勻，室溫下10000-12000RPM離心3-8 min，將上清轉(zhuǎn)移到離心管中；(5)加入2倍體積室溫下的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫下10000-12000RPM離心2_5 min,棄上清；(6)加入400-600份冰浴的70%-80%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10000-12000RPM離心1-5 min,棄上清；(7)烘箱中60-70 °C 干燥 5-15 min,加入 80-150 μ I ddH20,60-70 °C 水浴 10-20 min, -20 °C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪MDNA的方法，其特征在于所述的試劑配制(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8):12-13份Tris堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；(2)細(xì)胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種安全快速?gòu)难褐刑崛』蚪MDNA的方法，利用TritonX-100和SDS裂解血細(xì)胞，利用飽和NaCl沉淀蛋白質(zhì)，通過(guò)離心使蛋白質(zhì)分離出去，減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞；防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；排除有機(jī)溶劑、金屬離子及其他核酸分子的污染；使蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等降低到最低程度；提取的DNA具有一定的長(zhǎng)度；純化后存在對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì)。是一種綠色、快速、操作簡(jiǎn)單的從動(dòng)物血液中提取基因組DNA的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102604935SQ201210100069
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者吳瓊, 楊福合, 査代明, 蘇偉林, 榮敏, 邢秀梅 申請(qǐng)人:邢秀梅