專(zhuān)利名稱(chēng)：PAlb-uPA慢病毒載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及PAlb-UPA慢病毒載體，還涉及PAlb-UPA慢病毒載體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
除人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物外，人肝炎病毒并不存在天然的小動(dòng)物感染宿主，這嚴(yán)重阻礙 了對(duì)人肝炎病毒感染機(jī)制和抗病毒藥物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停褂檬鼙Ｗo(hù)的稀有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物受到倫理學(xué)及經(jīng)費(fèi)等諸多限制。因此建立廉價(jià)易得的小動(dòng)物模型是亟待解決的難題。近年發(fā)展起來(lái)的能攜帶人肝組織的小鼠動(dòng)物模型為肝炎病毒感染機(jī)制和抗病毒藥物研究提供了良好的平臺(tái)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型，是攜帶人肝組織的理想小鼠動(dòng)物模型。但是通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法獲得的尿激酶型纖溶蛋白酶轉(zhuǎn)基因小鼠，子代新生小鼠死亡率高、篩選難度大，大大阻礙了人嵌合肝小鼠模型的構(gòu)建、推廣和使用。因此，急需一種PAIb-uPA慢病毒載體，既能對(duì)體內(nèi)組織,又能對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行感染，可以用于制備尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型，提供攜帶人肝組織的受體小鼠。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供PAIb-uPA慢病毒載體，白蛋白啟動(dòng)子PAlb調(diào)控四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2特異表達(dá)于肝臟中，四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2在含有四環(huán)素類(lèi)化合物的條件下作用于含四環(huán)素操縱子的PTight啟動(dòng)子，最后通過(guò)PTight啟動(dòng)子調(diào)控尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA表達(dá)，由白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素操縱子受雙重控制，組織特異性高，調(diào)控方便，靈敏。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
所述PAIb-uPA慢病毒載體含有白蛋白啟動(dòng)子PAlb、尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA、白蛋白啟動(dòng)子PAlb啟動(dòng)的四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2和啟動(dòng)尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA表達(dá)的PTight啟動(dòng)子，所述四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2調(diào)控所述PTight啟動(dòng)子；
所述白蛋白啟動(dòng)子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；編碼所述四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的核酸序列如SEQ ID NO. 10所示；PTight啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。進(jìn)一步，所述PAIb-uPA慢病毒載體具有如SEQ ID NO. 7所示核苷酸序列。本發(fā)明目的之二在于提供PAIb-uPA慢病毒載體的制備方法，其制備方法簡(jiǎn)單，其技術(shù)方案為
PAIb-uPA慢病毒載體的制備方法，具體步驟如下a.從小鼠腎臟克隆尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA，并將克隆的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA連入pLVX Tight Puro載體的PTight啟動(dòng)子下游，得JGY-PLV-2載體；
b.克隆白蛋白啟動(dòng)子PAlb，并將克隆的白蛋白啟動(dòng)子PAlb連入pLVX-Tet-On載體的四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的上游，得JGY-PLV-I載體；
c.從步驟b所得JGY-PLV-I載體上切下含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用子rtTA/rtTA2s-M2的片段，然后連入pLKO. I克隆載體，得JGY-PLV-A載體；
d.從步驟c所得JGY-PLV-A載體切下含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后連入步驟a所得JGY-PLV-2載體的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA下游，得PAIb-uPA慢病毒載體。進(jìn)一步，所述步驟a中，將克隆的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA用XbaI和BamHI酶切，連入同樣經(jīng)XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro載體，得JGY-PLV-2載體。進(jìn)一步，所述步驟a中，尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的克隆，具體為以C57小鼠腎臟第一鏈cDNA為模板，以SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；再以第一次PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA。進(jìn)一步，所述步驟b中，將克隆的白蛋白啟動(dòng)子PAlb用ClaI和BamHI酶切，連入同樣經(jīng)ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On載體，得JGY-PLV-I載體進(jìn)一步，所述步驟b中，所述白蛋白啟動(dòng)子PAlb的克隆，具體為以含白蛋白啟動(dòng)子PAlb的質(zhì)粒為模板，以SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得白蛋白啟動(dòng)子PAlb。進(jìn)一步，所述步驟c為將步驟b所得JGY-PLV-I載體用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后連入同樣經(jīng)AgeI和AvrII酶切的pLKO. I克隆載體，得JGY-PLV-A載體。進(jìn)一步，所述步驟d為將步驟a所得JGY-PLV-A載體用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后連入同樣經(jīng)AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2載體中。本發(fā)明目的之三在于提供PAIb-uPA慢病毒載體的應(yīng)用，技術(shù)方案為
所述PAIb-uPA慢病毒載體在制備尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型中的應(yīng)用。本發(fā)明有益效果在于本發(fā)明公開(kāi)了 PAIb-uPA慢病毒載體，該載體能夠用于構(gòu)建尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型，該載體白蛋白啟動(dòng)子PALb控制四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2表達(dá)，由四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s_M2在四環(huán)素類(lèi)抗生素誘導(dǎo)下與含有四環(huán)素操縱子的啟動(dòng)子PTight結(jié)合，啟動(dòng)下游尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA表達(dá)。白蛋白啟動(dòng)子PAlb特異性地表達(dá)于肝臟細(xì)胞中，從而能夠選擇性地表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA。四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2具有低反應(yīng)背景，低誘導(dǎo)高反應(yīng)特性，在無(wú)四環(huán)素類(lèi)抗生素誘導(dǎo)時(shí)，表現(xiàn)出極低的“剩余”基因表達(dá)或無(wú)表達(dá)；而在有極微量的四環(huán)素類(lèi)抗生素誘導(dǎo)時(shí)，運(yùn)用的I μ g的強(qiáng)力霉素能引起uPA mRNA極高的表達(dá)，調(diào)控方便，獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠在無(wú)四環(huán)素類(lèi)化合物條件下無(wú)尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因子代新生小鼠死亡率低、篩選簡(jiǎn)單；本發(fā)明還公開(kāi)了 PAIb-uPA慢病毒載體的制備方法和應(yīng)用，其制備方法簡(jiǎn)單，制得的PAIb-uPA慢病毒載體可以用于制備尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型，可以用于制備攜帶人肝組織的動(dòng)物模型提供小鼠受體。


圖I為本發(fā)明尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA和白蛋白啟動(dòng)子PAlb PCR擴(kuò)增結(jié)果(M :表示marker ;UPA表示尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA PCR擴(kuò)增條帶；PAlb表示白蛋白啟動(dòng)子PAlb PCR擴(kuò)增條帶)。圖2為本發(fā)明JGY-PLV-2載體圖譜。圖3為本發(fā)明JGY-PLV-I載體圖譜。圖4為本發(fā)明JGY-PLV載體圖譜。圖5為本發(fā)明JGYPLV慢病毒感染H2. 35小鼠肝細(xì)胞結(jié)果圖(左圖為未感染肝細(xì)胞，右圖為感染后肝細(xì)胞)。圖6為本發(fā)明熒光定量PCR檢測(cè)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝細(xì)胞中uPA基因的表達(dá)情況(強(qiáng)力霉素濃度分別為O μ g、I μ g、3 μ g、5 μ g、7 μ g、10 μ g)。圖7為本發(fā)明強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝細(xì)胞的uPA蛋白表達(dá)結(jié)果圖(強(qiáng)力霉素濃度分別為O μ g、l μ g、3 μ g、5 μ g、7 μ g、10 μ g)。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例I、PAIb-uPA慢病毒載體構(gòu)建
本發(fā)明使用的 Lenti-X Tet-on Advanced Inducible Expression System 試劑盒購(gòu)自 Clontech 公司(含有 pLVX Tight Puro 載體和 pLVX-Tet-On 載體);pMD19_T Simplevocter載體、PCR反應(yīng)試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、in-Fusion Dry-Down PCR克隆試劑盒和DNA聚合酶primeSTAR HS購(gòu)自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒RNAprep pure Tissue Kit和膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒大抽試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；Trizol抽提液、RNase H和FV膜購(gòu)自Invitrogen公司；pLK0. I克隆載體、凝聚胺Ploybrene和胰酶購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸(EDTA)和Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；293T細(xì)胞、P-eGFP質(zhì)粒和H2. 35小鼠肝細(xì)胞(ATCC)由本所保存。一、JGY-PLV-2 載體構(gòu)建
取C57小鼠腎臟并提取總RNA，將提取的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。根據(jù)報(bào)道的尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinaseplasminogen activator, uPA)基因序列(Genbank clone MGC: 155950)設(shè)計(jì)引物，上游引物為 5’_atctctagacggtcagcatgggaacaagtg_3，(SEQ ID NO. I),下游引物為 5，_aatggatcctaccatgaaagtctggctggc_3，(SEQ ID NO·2)。以第一鏈cDNA為模板，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示序列為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為95 °C變性30秒，60 V退火30秒，68 V延伸90秒，共30個(gè)循環(huán)，得尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA片段。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，所得尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA長(zhǎng)度為1414bp，與報(bào)道的序列相同，因此克隆所得序列為尿激酶型纖溶酶原激 活劑基因uPA。根據(jù)擴(kuò)增所得尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA設(shè)計(jì)第二次擴(kuò)增引物，上游引物為5’- RcctRRaRaaRRatccRccaccatRaaaRtctRRctRRCR-3’ (SEQ ID NO. 3),劃線部分在uPA擴(kuò)增產(chǎn)物片段的5’端添加15個(gè)堿基序列，為連接載體時(shí)片段重組做準(zhǔn)備。下游引物為5’- gcgttcgcgatctagatcagaaggccagacctttct -3’ (SEQ ID NO. 4),用上述 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為95 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸90秒，共30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖I所示，獲得長(zhǎng)度為1340bp的PCR產(chǎn)物。將第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用XbaI和BamHI酶切，回收長(zhǎng)度為1360bp的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA酶切產(chǎn)物；同時(shí)用XbaI和BamHI酶切pLVX Tight Puro載體，并回收約7800bp的載體骨架，將回收的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA與pLVX Tight Puix)載體骨架用In-Fusion交換酶連接，尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA連入pLVX Tight Puro載體的含四環(huán)素操縱子的啟動(dòng)子PTight上游，連接條件為25°C反應(yīng)15分鐘，再42°C反應(yīng)15分鐘，然后4°C保存，得JGY-PLV-2載體，如圖2所示。
二、JGY-PLV-I 載體構(gòu)建
根據(jù)白蛋白啟動(dòng)子(albumin promoter, PAlb)設(shè)計(jì)引物,上游引物為5’ -_agatccagtttatc￡atctcgagaaccaaccaccggtgcggccgctctagcttccttag-3> (SEQ ID NO. 5)，劃線部分在PAlb擴(kuò)增產(chǎn)物片段的5’端添加的15個(gè)堿基序列，為連接載體時(shí)片段重組做準(zhǔn)備。下游引物為 5’-tagacatggtggatcccggggttgatagga_3’ (SEQ ID NO. 6),以本實(shí)驗(yàn)室保存的含PAlb啟動(dòng)子的PMD19質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為98°C變性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸2. 5分鐘，共30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖I所示，結(jié)果顯示獲得長(zhǎng)度為2399bp的條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與公開(kāi)的PAlb啟動(dòng)子序列相同，因此得PAlb啟動(dòng)子。將擴(kuò)增所得PAlb啟動(dòng)子用ClaI和BamHI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收條帶為2350bp的PAlb啟動(dòng)子；連接同樣經(jīng)ClaI和BamHI酶切pLVX-Tet_0n載體，連接使用In-Fusion交換酶連接,使白蛋白啟動(dòng)子PAlb連入pLVX_Tet_0n載體四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2 5’端，連接反應(yīng)為25°C反應(yīng)15分鐘，再42°C反應(yīng)15分鐘，最后4°C保存，得JGY-PLV-I載體，如圖3所示。三、PALb-uPA慢病毒載體構(gòu)建
取載體JGY-PLV-I 2 ii g用AgeI和AvrII酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含PAlb啟動(dòng)子的3270bp片段；同時(shí)取pLKO. I克隆載體2 ii g用AgeI和AvrII酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收大小約為6400bp的載體骨架，將回收的PAlb啟動(dòng)子和pLKO. I克隆載體骨架用T4連接酶連接，連接反應(yīng)在溫度為22°C條件下反應(yīng)I小時(shí)，得重組載體命名為JGY-PLV-A載體。取JGY-PLV-2載體約2 y g用AgeI和XhoI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收1780bp左右片段；同時(shí)取JGY-PLV-A載體2 y g用AgeI和XhoI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收大小約為9120bp的載體骨架。將回收的產(chǎn)物用T4連接酶連接，連接反應(yīng)在溫度為22°C條件下反應(yīng)I小時(shí)，得PALb-uPA慢病毒載體，命名為JGY-PLV載體，如圖4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，SEQ ID NO. 7所示核酸序列中，4411-6762位核苷酸為白蛋白啟動(dòng)子PAlb編碼區(qū)，如SEQ ID NO. 8所示；2965_4266位核苷酸為尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA JBSEQ ID NO. 9所示核酸序列；6766-7512位核苷酸為四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2編碼區(qū)，如SEQ ID NO. 10所示核酸序列；2629_2952位核苷酸為PTight啟動(dòng)子編碼區(qū)，如SEQ ID NO. 11所示。實(shí)施例2、PAlb-uPA慢病毒載體功能驗(yàn)證
一、PAlb-uPA慢病毒載體病毒包裝取生長(zhǎng)良好的293T細(xì)胞，經(jīng)消化、洗滌，并用Opti-MEM選擇培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，然后分傳到不同的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，備用；然后取兩支50mL無(wú)菌離心管，其中一支加入0.5mL濃度為0. 5mg/ mL的PAlb-uPA慢病毒載體JGY-PLV、I mL濃度為0. 2mg/mL的病毒包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒PMD2.G和0. 5 mL濃度為0.2mg/ mL的病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)質(zhì)粒psPAX2，再加入Opti-MEM培養(yǎng)基定容至18mL，備用；另一支加入0.5 mL Fran-EZ溶液和17. 5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，然后加入第一支試管中，邊加邊搖直到完全加入，得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染液。然后將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染液滴加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)后收集病毒，得慢病毒JGYPLV，并于-80°C保存。二、JGYPLV慢病毒感染
將制備的JGYPLV慢病毒感染用DMEM (低糖)培養(yǎng)基做適當(dāng)稀釋(終濃度3. OX 104)，再加入1:2000稀釋的凝聚胺(ploybrene)，共同感染H2. 35小鼠肝細(xì)胞，在溫度為3 3 °C、10 %的CO2的條件下培養(yǎng)8 -12小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基或含有強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基DMEM，強(qiáng)力霉素終濃度分別為0 ii g、I ii g、3 ii g、5 ii g、7 ii g、10 ii g，在溫度為37 °C、5% CO2培養(yǎng)的條件下誘導(dǎo)48小時(shí)后，在熒光纖維鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖5所示。結(jié)果顯示，經(jīng)JGYPLV慢病毒感染后H2. 35小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，不再貼壁生長(zhǎng)，表明JGYPLV慢病毒感染的小鼠肝細(xì)胞能夠過(guò)量表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA。并用熒光定量PCR檢測(cè)JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝細(xì)胞中尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的表達(dá)情況，檢測(cè)尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的熒光定量引物為，上游引物為 uPAF :5’ - tgaagtttgaggtggagcag-3’ (SEQ ID NO. 12);下游引物為 uPAR:5，- caggcagatggtctgtatgg-3’ (SEQ ID NO. 13)；以小鼠 GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，上游引物為5’ -acaactttggcattgtggaa-3’ (SEQ ID NO. 14)，下游引物為5’ -gatgcagggatgatgttctg-3’ (SEQ ID NO. 15)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)感染H2. 35小鼠肝細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA表達(dá)存在量效關(guān)系，當(dāng)強(qiáng)力霉素濃度低于5 y g時(shí)，隨著濃度升高尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的表達(dá)量升高，當(dāng)強(qiáng)力霉素濃度高于5 Ug時(shí)，uPA基因的表達(dá)進(jìn)入平臺(tái)增長(zhǎng)期，其濃度升高對(duì)uPA基因的表達(dá)量影響較小。同時(shí)檢測(cè)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝細(xì)胞的尿激酶型纖溶酶原激活劑uPA的表達(dá)，western blot分析結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，JGYPLV慢病毒感染H2. 35小鼠肝細(xì)胞中尿激酶型纖溶酶原激活劑uPA表達(dá)隨強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)濃度的增加而升聞，在強(qiáng)力霉素濃度10 y g時(shí)uPA蛋白表達(dá)量最聞。由此可知，本發(fā)明構(gòu)建的PAlb-uPA慢病毒載體經(jīng)包裝后感染H2. 35小鼠肝細(xì)胞，在四環(huán)素類(lèi)抗生素強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下能夠過(guò)量表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活劑uPA，可以用于制備PAlb-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得制備尿激酶型 纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型，為制備攜帶人肝組織的動(dòng)物模型提供小鼠受體。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.PAlb-UPA慢病毒載體，其特征在于所述PAlb-UPA慢病毒載體含有白蛋白啟動(dòng)子PAlb、尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA、白蛋白啟動(dòng)子PAlb啟動(dòng)的四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2和啟動(dòng)所述尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA表達(dá)的PTight啟動(dòng)子，所述四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2調(diào)控PTight啟動(dòng)子； 所述白蛋白啟動(dòng)子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；編碼所述四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的核酸序列如SEQ ID NO. 10所示；PTight啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PAlb-uPA慢病毒載體，其特征在于所述PAlb-uPA慢病毒載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
3.權(quán)利要求I或2所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下 a.從小鼠腎臟克隆尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA，并將克隆的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA連入pLVX Tight Puro載體的PTight啟動(dòng)子下游，得JGY-PLV-2載體； b.克隆白蛋白啟動(dòng)子PAlb，并將克隆的白蛋白啟動(dòng)子PAlb連入pLVX-Tet-On載體的四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的上游，得JGY-PLV-I載體； c.從步驟b所得JGY-PLV-I載體上切下含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用子rtTA/rtTA2s-M2的片段，然后連入pLKO. I克隆載體，得JGY-PLV-A載體； d.從步驟c所得JGY-PLV-A載體切下含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后連入步驟a所得JGY-PLV-2載體的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA下游，得PAlb-uPA慢病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟a中，將克隆的尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA用XbaI和BamHI酶切，連入同樣經(jīng)XbaI和BamHI 酶切的 pLVX Tight Puro 載體，得 JGY-PLV-2 載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟a中，尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的克隆，具體為以C57小鼠腎臟第一鏈cDNA為模板，以SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；再以第一次PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟b中，將克隆的白蛋白啟動(dòng)子PAlb用ClaI和BamHI酶切，連入同樣經(jīng)ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On 載體，得 JGY-PLV-1 載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟b中，所述白蛋白啟動(dòng)子PAlb的克隆，具體為以含白蛋白啟動(dòng)子PAlb的質(zhì)粒為模板，以SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6所示序列為弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得白蛋白啟動(dòng)子PAlb。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟c為將步驟b所得JGY-PLV-I載體用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后連入同樣經(jīng)AgeI和AvrII酶切的pLKO. I克隆載體，得JGY-PLV-A載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法，其特征在于所述步驟d為將步驟a所得JGY-PLV-A載體用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白啟動(dòng)子PAlb和四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后連入同樣經(jīng)AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2載體中。
10.權(quán)利要求I所述PAlb-UPA慢病毒載體在制備尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了PAlb-uPA慢病毒載體，該載體含有白蛋白啟動(dòng)子PAlb和尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA，白蛋白啟動(dòng)子PAlb的四環(huán)素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2和調(diào)控尿激酶型纖溶酶原激活劑基因uPA的PTight啟動(dòng)子；還公開(kāi)了PAlb-uPA慢病毒載體的制備方法和應(yīng)用，其制備方法簡(jiǎn)單，制得的慢病毒載體能夠用于制備尿激酶型纖溶蛋白酶小鼠肝損傷模型，為臨床研究人肝炎病毒感染機(jī)制和抗病毒藥物提供了有效的研究平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102628063SQ201210102188
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者李俊剛, 毛青, 白家駟 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院