專利名稱：一種利用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸是一種重要的有機(jī)酸，學(xué)名a -羥基丙酸，在分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此乳酸存在兩種異構(gòu)體，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作為一種重要的生物化工原料，L-乳酸被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、日用化工、有機(jī)化工等領(lǐng)域，覆蓋大量產(chǎn)品。乳酸可以通過(guò)化學(xué)合成或碳水化合物發(fā)酵得到，但是基于發(fā)酵法能夠?qū)Ｒ恍缘氐谩さ絃-乳酸或D-乳酸，因此發(fā)酵法被廣泛用于L-乳酸的生產(chǎn)。乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸具有光學(xué)純度高、發(fā)酵強(qiáng)度顯著提高等特點(diǎn)，因此，利用乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸成為大規(guī)模生產(chǎn)L-乳酸的趨勢(shì)。目前用于乳酸生產(chǎn)的原料主要有淀粉、糖蜜、乳清粉等。為了降低乳酸的制備成本，提高乳酸生產(chǎn)質(zhì)量，國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸生產(chǎn)的研究，主要集中在低價(jià)原料的開(kāi)發(fā)利用、提高發(fā)酵強(qiáng)度、優(yōu)化乳酸分離提取工藝這三個(gè)方面。發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸最早見(jiàn)于1841年的Boutron和Fremy的記載中，其生產(chǎn)方法是將麥芽或酸乳放入淀粉或牛乳中使其自然發(fā)酵，然后用碳酸鈣逐漸中和所產(chǎn)生的乳酸。實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)始于1881年的美國(guó)阿伏利公司，其以玉米、小麥、大米、紅薯等淀粉為原料，首先將淀粉糖化，加入碳酸鈣，然后加入乳酸菌發(fā)酵3-6天。工業(yè)上常用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵，其對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%以上，產(chǎn)品主要為DL-乳酸。常用于工業(yè)生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌主要有乳桿菌屬、明串株菌屬、鏈球菌屬。由于有些乳酸細(xì)菌能產(chǎn)生淀粉酶，所以應(yīng)用這類細(xì)菌發(fā)酵淀粉質(zhì)廢棄物，不必進(jìn)行糖化，可以直接發(fā)酵，有利于工藝的簡(jiǎn)化。已報(bào)道的能水解淀粉的乳酸細(xì)菌包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、纖維二糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、解淀粉乳桿菌、食淀粉乳桿菌和嗜淀粉乳桿菌等。目前工業(yè)上普遍采用的是德氏乳酸乳桿菌和嗜熱乳桿菌。發(fā)酵是一種復(fù)雜的生化過(guò)程，受很多因素的影響，如菌體自身的生產(chǎn)性能、培養(yǎng)基的配比、種子的質(zhì)量、發(fā)酵條件和發(fā)酵過(guò)程控制等都與目的產(chǎn)物的產(chǎn)出有密切的關(guān)系。在工業(yè)生產(chǎn)中，為了最大限度的發(fā)揮菌體的生產(chǎn)能力，應(yīng)該提供最優(yōu)的生產(chǎn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。因此，探索菌株高產(chǎn)特性充分表達(dá)的最優(yōu)培養(yǎng)條件是發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的方法，通過(guò)探索德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的最優(yōu)培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方法，使乳酸產(chǎn)量達(dá)到很高的水平，為進(jìn)一步利用高葡萄糖含量的廉價(jià)的碳源提供基礎(chǔ)。I. 一種利用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的方法，其特征在于將第三代種子液按10%(v/v)比例接入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的醫(yī)用葡萄糖注射瓶中，45°C靜置培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵初期加入一定量的碳酸鈣。2.步驟I所描述的方法，具體步驟如下
(I)用接種環(huán)從菌株冷藏斜面挑取一菌環(huán)接種到裝有60mL MRS活化液體培養(yǎng)基的IOOmL密封玻璃瓶中，420C，150rpm,密封培養(yǎng)24h。(2)第三代種子液的制備是以無(wú)菌吸管按5% (v/v)比例將MRS培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，42°C，150rpm密封培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)轉(zhuǎn)接三次，種子培養(yǎng)基的體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要逐步增大。(3)將第三代種子液按15% (v/v)比例接入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的醫(yī)用葡萄糖注射瓶中，45°C靜置培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵初期加入一定量的碳酸鈣。
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3.步驟2所述MRS活化液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏4，蛋白胨10，牛肉膏 8，吐溫 80 ImLjKH2PO4 2, NaAc 5，檸檬酸二銨 2,MgSO4 0. 2,MnSO4 0. 04，蒸餾水 1000mL。4.步驟2所述的純糖種子培養(yǎng)基(％):葡萄糖5%，蛋白胨0. 5%，酵母粉0. 5%,MgSO40. 05%, NaCl 0. 01%, KH2PO4 0. 05%。5.純糖發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖8%，蛋白胨0. 5%，蛋白粉0. 5%，MgSO4 0. 05%, NaCl0. 01%, KH2PO3 0. 05%。6 步驟2 (2)所述的最優(yōu)種齡為14h。7.步驟2 (3)所述的最優(yōu)接種量為15%。8 步驟2 (3)所述的最適pH為6.0。9.步驟 2 (3)所述的 CaCCU^加量 60g/L。


圖I不同接種量與乳酸產(chǎn)量之間的關(guān)系。圖2不同初始pH值與乳酸產(chǎn)量之間的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制。本發(fā)明使用的菌株德氏乳酸乳桿菌{Lactobacillus delbrueckii )購(gòu)買自上海艾研生物科技有限公司(菌株號(hào)2793ACCC10183)。實(shí)施例I
本實(shí)施例說(shuō)明不同種齡的種子對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響，采用10、12、14、16、18小時(shí)五個(gè)時(shí)間段的種子液進(jìn)行發(fā)酵研究，接種量均為15%。探討不同種齡的種子對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響。種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間，選擇合適的接種種齡非常重要。由表I可知，接種量為15%，種齡為14h的種子產(chǎn)酸效果最好。表I不同種齡的種子對(duì)乳酸發(fā)酵的影響
種齡(h)IlO |12 |14 |16 |18
最終乳酸產(chǎn)量(g/L) |25. 3|30. 6丨38. 9丨35. 2|29. 8
實(shí)施例2
本實(shí)施例說(shuō)明不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響，將已經(jīng)活化三代的種子液以1%、5%、10%、15%、20%、25%接種量轉(zhuǎn)接入150mL純糖發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵72h后測(cè)定乳
酸的產(chǎn)量。
由圖I可以看出，當(dāng)接種量為15%時(shí)得到的乳酸產(chǎn)量最高，當(dāng)接種量分別為1%、5%、10%及15%時(shí)，發(fā)酵液中的最終乳酸的產(chǎn)量是隨著接種量的增加而增加的，說(shuō)明加大了接種量，乳酸菌的濃度增高，有利于乳酸的快速進(jìn)行；接種量在20%、25%時(shí)，發(fā)酵液中的乳酸產(chǎn)量反而下降，可能是隨著接種量的增加，由種子培養(yǎng)基中帶來(lái)的代謝廢物增多，且菌體生長(zhǎng)過(guò)快，細(xì)胞衰亡加速，從而影響乳酸產(chǎn)量。實(shí)施例3
本實(shí)施例說(shuō)明不同發(fā)酵液初始PH值對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響，調(diào)節(jié)純糖發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別為4. O、4. 5、5. O、5. 5、6. O、6. 5、7. 0，發(fā)酵72小時(shí)后測(cè)定發(fā)酵液乳酸含量。微生物生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段的最適pH值通常是不一樣的，這不僅與菌種特性有關(guān)，也與產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。由圖2可知，在初始pH值為6. 0時(shí)，乳酸的產(chǎn)量相對(duì)較高，因此，本文將發(fā)酵培養(yǎng)基初始最適pH值定為6.0。實(shí)施例4
本實(shí)施例說(shuō)明碳酸鈣的不同添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響，在上面其他最優(yōu)條件下，在純糖發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L及70g/L的CaCO3進(jìn)行發(fā)酵
培養(yǎng)，測(cè)定乳酸產(chǎn)量。有表2可見(jiàn)，隨著CaCO3濃度的加大，乳酸的產(chǎn)量逐漸上升，超過(guò)60g/L時(shí)開(kāi)始下降，可以認(rèn)為當(dāng)CaCO3濃度達(dá)到60g/L時(shí)，基本可以滿足條件發(fā)酵液中pH值的要求。表2碳酸鈣濃度對(duì)乳酸發(fā)酵的影響
權(quán)利要求
1.一種利用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的方法，其特征在于將第三代種子液按10%(v/v)比例接入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的醫(yī)用葡萄糖注射瓶中，45°C靜置培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵初期加入一定量的碳酸鈣。
2.權(quán)利I所述的方法，其具體步驟如下 用接種環(huán)從菌株冷藏斜面挑取一菌環(huán)接種到裝有60mL MRS活化液體培養(yǎng)基的IOOmL密封玻璃瓶中，42°C，150rpm，密封培養(yǎng)24h ； 第三代種子液的制備是以無(wú)菌吸管按5% (v/v)比例將MRS培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，42°C，150rpm密封培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)轉(zhuǎn)接三次，種子培養(yǎng)基的體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要逐步增大； 將第三代種子液按15% (v/v)比例接入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的醫(yī)用葡萄糖注射瓶中，45°C靜置培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵初期加入一定量的碳酸鈣。
3.權(quán)利2所述的方法，其特征在于MRS活化液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏4，蛋白胨 10，牛肉膏 8，吐溫 80 lmL，KH2P04 2,NaAc 5，檸檬酸二銨 2,MgSO4 O. 2,MnSO4 0.04，蒸懼水1000mL。
4.權(quán)利2所述的方法，其特征在于純糖種子培養(yǎng)基(％):葡萄糖5%，蛋白胨O.5%，酵母粉 O. 5%, MgSO4 O. 05%, NaCl O. 01%, KH2PO4 O. 05%。
5.權(quán)利2所述的方法，其特征在于純糖發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖8%，蛋白胨O.5%，蛋白粉 O. 5%, MgSO4 O. 05%, NaCl O. 01%, KH2PO3 O. 05%。
6.權(quán)利2(2)所述的方法，其特征在于最優(yōu)種齡為14h。
7.權(quán)利2(3)所述的方法，其特征在于最優(yōu)接種量為15%。
8.權(quán)利5所述的方法，其特征在于最適pH為6.O。
9.權(quán)利2(3)所述的方法，其特征在于CaCO3添加量60g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用德氏乳酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的方法，通過(guò)對(duì)菌株培養(yǎng)條件的研究，確定了菌株最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件好氧環(huán)境下培養(yǎng)平板，種齡16h，接種量10%，裝液量120mL、250mL，45℃靜置培養(yǎng)，發(fā)酵液初始pH值為6.0,發(fā)酵6h后一次性添加50g/L的碳酸鈣。此最優(yōu)條件下發(fā)酵可以提高葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)C12P7/56GK102787145SQ20121010220
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者張斌 申請(qǐng)人:蘇州百趣食品有限公司