專利名稱：一種表達(dá)人抗體全基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體高效表達(dá)人抗體全基因的技術(shù)平臺(tái)。在具體應(yīng)用中將不限于本研究中所使用的載體及抗體基因。
背景技術(shù)：
抗體(Antibody)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白，抗體具有特異性強(qiáng)、副作用小、免疫原性低、生物活性單一等特點(diǎn)，由于其獨(dú)有的特征已迅速應(yīng)用于生物 學(xué)和醫(yī)學(xué)的很多領(lǐng)域。目前世界上有30多個(gè)抗體藥物已經(jīng)獲得批準(zhǔn)上市，主要集中在腫瘤、自身免疫性疾病和感染類疾病等方面。目前應(yīng)用的抗體藥物的種類主要有鼠源性抗體、人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體，鼠源性抗體由于能夠誘發(fā)人體產(chǎn)生人抗鼠抗體、半衰期短，引起過(guò)敏反應(yīng)和超敏反應(yīng)等缺點(diǎn)，影響其在腫瘤、器官移植等疾病和的診斷和治療上的應(yīng)用。人-鼠嵌合抗體和人源化抗體由于與抗原的結(jié)合能力弱，長(zhǎng)時(shí)間使用能誘發(fā)人體產(chǎn)生人抗鼠抗體也是其應(yīng)用受到限制，而人抗體具有更低的免疫原性、更好的安全性、更慢的清除周期，目前抗體藥物的發(fā)展主要方向是向全人抗體發(fā)展，有的抗體在臨床治療比較成功，但對(duì)于抗體的廣泛應(yīng)用還是受到生產(chǎn)能力的限制，提高抗體全基因的表達(dá)效率，包括在體內(nèi)的基因治療和體外哺乳細(xì)胞的大量表達(dá)等方面都將產(chǎn)生重要的意義。當(dāng)前，我國(guó)表達(dá)載體和細(xì)胞株改造都遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于歐美國(guó)家，所以治療性抗體藥物重點(diǎn)解決的問(wèn)題之一是建立高效表達(dá)抗體基因的載體?？贵w的基本結(jié)構(gòu)相似，都是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)通過(guò)二硫鍵連接而成，將重鏈和輕鏈構(gòu)建在載體上進(jìn)行高效的表達(dá)是關(guān)鍵所在，這樣就涉及到雙基因共表達(dá)的構(gòu)建策略。雙基因共表達(dá)的構(gòu)建策略主要有以下幾個(gè)方面(I)雙啟動(dòng)子的構(gòu)建策略，這種策略是用雙表達(dá)盒表達(dá)兩個(gè)基因，用各自獨(dú)立的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄不同的基因，啟動(dòng)子可以一樣也可以不一樣，載體上有兩個(gè)啟動(dòng)子和兩個(gè)PolyA。這種構(gòu)建策略的缺點(diǎn)是內(nèi)部啟動(dòng)子占用了載體上有限的克隆空間，為了增加克隆空間可以用兩個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)PolyA的構(gòu)建方案，這兩種方案在不同的載體中轉(zhuǎn)錄效果也不盡相同。真核載體常用的啟動(dòng)子有CMV、EF-la、hPGK、CAG、mPGK等，不同啟動(dòng)子有不同的轉(zhuǎn)錄效率，同時(shí)在不同組織中轉(zhuǎn)錄的效率也不盡相同；(2)引入IRES的構(gòu)建策略，兩個(gè)基因之間插入內(nèi)核糖體插入位點(diǎn)(internal ribosomal entry site, IRES)序列使其為同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)而轉(zhuǎn)錄為單個(gè)mRNA,但翻譯為兩種不同的蛋白質(zhì)。這種構(gòu)建方案能夠避免雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄時(shí)的相互干擾，但置于IRES下游基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比上游基因表達(dá)量的效率低很多；(3)融合表達(dá)的構(gòu)建策略，用連接肽(linker)將兩個(gè)基因相連，在一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控下翻譯出具雙功能的融合蛋白分子，但對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)需要輕、重鏈分別表達(dá)才能組裝成功能和立體結(jié)構(gòu)完整的IgG。除此之外還有供體/受體位點(diǎn)剪切構(gòu)建策略、Furin切割構(gòu)建策略、2A序列自我切割構(gòu)建策略等，這些構(gòu)建策略由于在體內(nèi)切割效率低，兩基因的表達(dá)效率也很不穩(wěn)定，還有部分剪切的調(diào)節(jié)機(jī)制還都不清楚。
腺相關(guān)病毒(AAV)是一種復(fù)制缺陷型病毒,是一種安全有效的基因轉(zhuǎn)移載體,在正常細(xì)胞中并不發(fā)生產(chǎn)毒性感染，其載體中不含任何AAV的結(jié)構(gòu)基因，載體基因組中含有的唯一病毒序列是非編碼的反向末端重復(fù)序列(ITR)，因而轉(zhuǎn)導(dǎo)后不合成天然的病毒蛋白，目前rAAV2已用于多種人類疾病的基因治療研究?，F(xiàn)在各種血清型AAV載體都是在2型AAV(AAV2)基礎(chǔ)上改造的“雜合”載體，即使用AAV2的ITRs以及全部或部分AAV2的R印基因，換上其他血清型AAV的Cap蛋白。AAV2/1載體具有AAV2的ITR和AAVl的外殼，其具有野生型AAVl病毒的細(xì)胞親嗜性、感染特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AAV2/1載體轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌的效率明顯高于AAV2載體，外源基因的表達(dá)水平高10倍以上，表達(dá)時(shí)間也明顯提前。將AAV2/1載體進(jìn)行肌肉注射后，實(shí)驗(yàn)中可以明確地觀察到目的基因的表達(dá)范圍比AAV2更寬，甚至擴(kuò)散到整塊肌肉。AAV作為載體具有安全性好、宿主范圍廣、物理性質(zhì)穩(wěn)定、易于運(yùn)輸和保存、可長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因等這些特點(diǎn)，使用重組AAV載體表達(dá)抗體全基因用于基因治療和疫苗研究等方面具有很好的前景。在抗體藥物治療和應(yīng)用中，很重要的一點(diǎn)是要提高抗體的表達(dá)量，同時(shí)也要避免啟動(dòng)子相互干擾，以免造成不同基因表達(dá)水平的不一致?？贵w全基因的表達(dá)，由于輕鏈表達(dá)量大于重鏈表達(dá)量才能更好更多的組裝成完整的抗體，所以應(yīng)該嘗試多種雙基因載體構(gòu)建的方案，而且不同的構(gòu)建方案在不同的載體在表達(dá)抗體時(shí)，其表達(dá)效率不盡相同。基于以上理論，為建立AAV載體高效表達(dá)抗體全基因技術(shù)平臺(tái)。我們采用了多種雙基因表達(dá)策略并獲得一種高效表達(dá)抗體全基因的最佳方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供利用AAV載體系統(tǒng)構(gòu)建包含人抗體重鏈和輕鏈全基因的高效雙基因表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明以HIV人中和抗體2G12全基因?yàn)槟Ｐ停肁AV2/1穿梭表達(dá)載體pSNAV(AAV2/l的包裝和pSNAV載體來(lái)源于本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司，參見附圖I)(伍志堅(jiān)，吳小兵等.一種高效的重組腺伴隨病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng).中國(guó)科學(xué)C輯，2001，31(5)423-430)構(gòu)建高效表達(dá)人抗體全基因的AAV載體表達(dá)系統(tǒng)。研究思路是通過(guò)多種雙基因表達(dá)的構(gòu)建策略(參見附圖3)，在細(xì)胞水平上比較表達(dá)2G12的效果(參見附圖4)，在此過(guò)程中構(gòu)建了 pSNAV/eLcH載體(參見附圖2)，轉(zhuǎn)染此載體于BHK 21細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)2G12的細(xì)胞株BHK21/2G12。本專利對(duì)此表達(dá)系統(tǒng)在SCID小鼠體內(nèi)進(jìn)行了免疫驗(yàn)證，結(jié)果證明此系統(tǒng)不僅在細(xì)胞水平有很好表達(dá)抗體的效果，同時(shí)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)也能夠長(zhǎng)期高效的表達(dá)(參見附圖5)。本發(fā)明為AAV載體表達(dá)抗體全基因在抗體治療、高產(chǎn)細(xì)胞株等方面提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。此發(fā)明在載體構(gòu)建時(shí)，在載體的多克隆位點(diǎn)引入便于各種抗體輕重鏈基因插入的酶切位點(diǎn)，載體的多 克隆位點(diǎn)插入的酶切位點(diǎn)及其順序?yàn)镋coR I-Not I--Sfi I，因?yàn)檫@三個(gè)酶切位點(diǎn)是人基因中比較稀有的酶切位點(diǎn)，在表達(dá)其它的人抗體基因時(shí)就不需為加入新酶切位點(diǎn)而改造載體。此外利用Sfi I內(nèi)切酶識(shí)別序列的特殊性，在重鏈兩端都是SfiI，僅用Sfi I酶單切就可以將其構(gòu)建在載體上，而且不改變其方向。(參見附圖3)此發(fā)明建立了雙抗體ELISA法定量測(cè)定人IgG含量的方法，該方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，背景低，可直接定量測(cè)定血清及純化樣品等各種培養(yǎng)物中人抗體的含量。


圖I為表達(dá)載體pSNAV質(zhì)粒圖譜圖2為表達(dá)最佳的載體pSNAV/ELCH質(zhì)粒圖譜圖3為pSNAV載體采用14種不同方案表達(dá)2G12輕、重鏈的構(gòu)建示意4為pSNAV/2G12采用14種雙基因構(gòu)建方案的表達(dá)量的比較5為AAV-2G12在SCID小鼠體內(nèi)不同時(shí)間的平均表達(dá)量
具體實(shí)施方案實(shí)施例I :pSNAV表達(dá)2G12各種表達(dá)方案的構(gòu)建步驟I. pSNAV表達(dá)2G12質(zhì)粒的構(gòu)建步驟(I)去除AAV穿梭表達(dá)載體pSNAV中的酶切位點(diǎn)Sfi I Sfi I酶切載體pSNAV，用T4 DNA polymerase將粘末端酶切位點(diǎn)平滑化，再用T4 DNA Iigase連接為無(wú)Sfi I酶切位點(diǎn)的pSNAV。(2)在載體pSNAV的多克隆位點(diǎn)插入linker :為便于將IgG的輕鏈(L)和重鏈⑶插入載體，設(shè)計(jì)含有EcoR I-Not I-Sfi I的linker39，其兩端擁有EcoR I和Bgl II酶切位點(diǎn)的粘末端，與載體pSNAV相連接為pSNAV/linker39。linker39設(shè)計(jì)的引物如下:Linker 39F 5 '…aattcataagaatgcggccgctataggccaactaggcca…3 ' (SEQ IDNO. I)Linker 39R 5 '…gatctggcctagttggcctatagcggccgcattcttatg…3 ' (SEQ IDNO. 2)(3)2G12輕鏈中EcoR I酶切位點(diǎn)的突變及擴(kuò)增。2G12輕鏈長(zhǎng)712bp，EcoR I酶切位點(diǎn)是gaattc，在不改變氨基酸的基礎(chǔ)上將輕鏈中g(shù)aa改為gag，使EcoR I不能識(shí)別。引物如下2G12_Lc F :5'…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 3)EcoRI R:5'…ctgatggtgagagtgaactctgtcccagatccac…3' (SEQ ID NO. 4)EcoRI F :5'…gtggatctgggacagagttcactctcaccatcag…3' (SEQ ID NO. 5)2G12_Lc R:5'…gaatgcggccgcctaacactctcccctgttg... 3' (SEQ ID NO. 6)⑷2G12輕鏈加Poly A的擴(kuò)增和EcoR I酶切位點(diǎn)的突變2G12-Lc/pA連接在一起共長(zhǎng)880bp，同時(shí)將輕鏈上EcoR I酶切位點(diǎn)突變，識(shí)別序列是gaattc，在不改變氨基酸的基礎(chǔ)上將輕鏈中g(shù)aa改為gag，使EcoR I不能識(shí)別。2G12_Lc/pA F :5'…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 7)EcoRI R:5'…ctgatggtgagagtgaactctgtcccagatccac…3' (SEQ ID NO. 4)EcoRI F :5'…gtggatctgggacagagttcactctcaccatcag…3' (SEQ ID NO. 5)2G12_Lc/pA R:5'…gaatgcggccgcgatccagacatgataagatac…3' (SEQ ID NO. 8)(5)PO^j^|2G12-H(Sfi I, Sfi I)、IRES (Not I, Sfi I)、hPGK(Not I, Sfi I)、CMV(Not I, Sfi I)和 EF-I a (Not I, Sfi I)。引物如下IRES (Not I, Sfi I)
IRES F :5'…tagcggccgcacgcgtcgagcatgcatctag…3' (SEQ ID NO. 9)IRES R :5'…taggcctacaaggcccgggttgtggcaagcttatcatc…3' (SEQ ID NO. 10)H(Sfi I, Sfi I)2G12_Hc F :5'…taggccttgtaggcctccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 11)2G12_Hc R 5 '…atggcctagttggcctcatttacccggagacagggagag…3 ' (SEQ IDNO. 12)
CMV(Not I, Sfi I)CMVl F :5'…tagcggccgcttcgagctcgcccgacattg... 3' (SEQ ID NO. 13)CMVl R 5 '…taggcctacaaggccgatctgacggttcactaaac gagctc…3' (SEQ IDNO. 14)EF-I a (Not I, Sfi I)EF-Ia Notl :5'…tatagcggccgcggctccggtgcccgtcagtg... 3' (SEQ ID NO. 15)EF-Ia SfilA2 5 '…gcggcctacaaggcctcacgacacctgaaatggaag…3 ' (SEQ IDNO. 16)hPGK(Not I, Sfi I)h PGK Notl :5'…tatagcggccgcggggttggggttgcgccttttc…3' (SEQ ID NO. 17)h PGK SfilA 5;…atggcctacaaggccctggggagagaggtcggtgattc…3 ' (SEQ IDNO. 18)(6)通過(guò)酶切位點(diǎn)EcoR I和Not I將2G12的L和LA插入載體pSNAV/linker39構(gòu)建為 2G12-pSNAV/L、2G12-pSNAV/LA。(J)通過(guò)酶切位點(diǎn) Not I 和 Sfi I 將 IRES、CMV、hPGK、EF-Ia 和 2G12 的 H 分別共同連接到 2G12-pSNAV/L，構(gòu)建為 pSNAV/cLIH、pSNAV/cLcH、pSNAV/cLeH、pSNAV/cLhH ;通過(guò)酶切位點(diǎn)Not I和Sfi I將CMV、hPGK、EF-la和2G12的H分別共同連接到2G12_pSNAV/LA，構(gòu)建為 pSNAV/cLAcH、pSNAV/cLAeH、pSNAV/cLAhH。2. 2G12輕、重鏈互換位置方案的構(gòu)建步驟(l)PCI^；^|2G12-H(EcoR I, Not I)、2G12_L(Sfi I, Sfi I)為便于使用載體上引入的多克隆位點(diǎn)EcoR I,Not I和Sfi I，必須重新?lián)Q合適的酶切位點(diǎn)，即 2G12-H(EcoR I, Not I)、2G12_L(Sfi I，Sfi I)，PCR 擴(kuò)增引物如下:2G12-H(EcoR I. Not I)2G12_H_EcoRI :5'…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 19)2G12-H_Not 1:5'…aatgcggccgctcatttacccggagacagg...3' (SEQ ID NO. 20)2G12-L(Sfi I, Sfi I)2G12-L~Sfi I A :5'…attggccttgtaggccttccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ IDNO. 21)2G12-L~Sfi IB :5'…atggcctagttggccctaacactctcccctgttgaag…3' (SEQ IDNO. 22)(2)通過(guò)酶切位點(diǎn)EcoR I和Not I將2G12的H載體pSNAV/linker39構(gòu)建為2G12-pSNAV/H(3)通過(guò)酶切位點(diǎn)Not I和Sfi I將CMV、hPGK、EF_la和2G12的L分別共同連接到 2G12-pSNAV/H，構(gòu)建為 pSNAV/cHhL、pSNAV/cHcL pSNAV/cHeL。3. pSNAV載體換啟動(dòng)子方案的構(gòu)建步驟(I) linker23的設(shè)計(jì)和連接為便于將載體pSNAV的CMV啟動(dòng)子替換為EF-Ia啟動(dòng)子，需要設(shè)計(jì)一段linker，插入linker的酶切位點(diǎn)包括Xho I、Xbal I和EcoR I。設(shè)計(jì)含有這三個(gè)酶切位點(diǎn)的linker23，其兩端擁有Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)的粘末端，與載體pSNAV相連接為pSNAV/linker23。Linker23設(shè)計(jì)的引物如下:Linker23F 5;…tcgaggctctagagcggtaccgg…3' (SEQ ID NO. 23)Linker 23R:5'…aattccggtaccgctctagagcc…3' (SEQ ID NO. 24)(2)PCR擴(kuò)增EF-I a，在其兩端引入酶切位點(diǎn)Xba I和EcoRI，設(shè)計(jì)的引物如下EFla Xbal 1:5'…attctagaggctccggtgcccgtcagtg…3' (SEQ ID NO. 25)EFla EcoRI 1:5 ' ... gccgaattctattagtaccaagctaattcctcacg…3 ' (SEQ IDNO. 26)(3)通過(guò)酶切位點(diǎn)Xba I和EcoRI將EF-1 a插入載體pSNAV/linker23構(gòu)建為pSNAV/EF-1a 。(4)通過(guò)酶切位點(diǎn) Xba I 和 RsrI 將 pSNAV/cLcH、pSNAV/cLAcH、pSNAV/cLeH 和pSNAV/cLAeH 酶切后分別連接 pSNAV/linker23 構(gòu)建為 pSNAV/eLcH、pSNAV/eLAcH、pSNAV/eLeH、pSNAV/eLAeH。實(shí)施例2 :雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人IgG含量的方法(I)包被包被 Goat anti human kappa, UNLB (公司Southern Biotech,貨號(hào)2070-01)，50ng/孔，4°C包被過(guò)夜，PBST洗三遍，不包被右下角2x2空白對(duì)照孔。(2)封閉用5%的脫脂奶粉封閉，100 U I/孔，37°C封閉I小時(shí)，PBST洗三遍。(3)加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品在同一酶標(biāo)板上加入IgG 標(biāo)準(zhǔn)品(Invitrogen，lot 1069920A, TEF 027102)和待測(cè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)品從第一孔以0. I u g/ml開始連續(xù)8個(gè)稀釋度進(jìn)行倍比稀釋，做兩個(gè)復(fù)孔；待測(cè)樣品(包括細(xì)胞表達(dá)上清、小鼠血清等)以一定稀釋度連續(xù)8個(gè)稀釋孔進(jìn)行倍比稀釋，做兩個(gè)復(fù)孔，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗三遍。(4)加酶標(biāo)抗體將 I : 75OO 稀釋的 Peroxidase-Conjugated Goat Anti-HumanIgG(H+L)(生產(chǎn)廠家北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)加入每個(gè)反應(yīng)孔中，IOOiU/孔，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗五遍。(5)顯色每孔加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司)100 ill，室溫避光反應(yīng)10分鐘左右。(6)終止反應(yīng)每孔中加入2M硫酸50 U I終止反應(yīng)。(7)結(jié)果檢測(cè)用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定吸收值。(8)人IgG定量以標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)應(yīng)的OD值做散點(diǎn)圖，據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的IgG含量。實(shí)施例3 2G12采用14種雙基因構(gòu)建方案在細(xì)胞水平上的表達(dá)將提取的高純度的14種構(gòu)建方案的質(zhì)粒(pSNAV/cLIH、pSNAV/cLcH、pSNAV/cLeH、pSNAV/cLhH、pSNAV/cLAcH、pSNAV/cLAeH、pSNAV/cLAhH、pSNAV/cHhL、pSNAV/cHcLpSNAV/、cHeL、pSNAV/eLcH、pSNAV/eLeH、pSNAV/eLAcH、pSNAV/eLAeH)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，用 FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑(羅氏，Cat. No. 04709705001)轉(zhuǎn)染，具體操作按FuGENE HD說(shuō)明書進(jìn)行，通過(guò)雙抗體夾心ELISA法測(cè)定人IgG含量方法(方法見實(shí)施例2)檢測(cè)轉(zhuǎn)染72小時(shí)細(xì)胞上清的人IgG含量。結(jié)果如表I中所示，通過(guò)比較這14種構(gòu)建方案的表達(dá)，獲得pSNAV/eLcH是高效表達(dá)人抗體全基因的最佳方案。表I
構(gòu)建方案~PTeLcH~~P/cLcH ~P/cLeH P/eLeH ~P/cLAcH ~P/eLAcH ~P/eLAeH 表達(dá)量(U g/ml) 39. 28 38. 78 25. 19 22. 21 21. 37 21. 08 19. 51構(gòu)建方案P/cLAeH P/cLhH P/cHcL P/cLAeH p/LIH P/cHhL P/cHeL~
表達(dá)量(y g/ml) 15.02 10. 19 O TlL3L3I實(shí)施例4 :穩(wěn)定表達(dá)2G12細(xì)胞株BHK21的篩選篩選采用G418壓力選擇和有限稀釋法克隆化，具體方法如下a.將瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)的BHK細(xì)胞用胰酶消化，做細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照每孔細(xì)胞數(shù)為32、16、8、4、2、1個(gè)細(xì)胞方式鋪4個(gè)96孔板，每孔IOOii I 10% Iow-IgG FBS，用加入抗生素G418(800 u g/ml)進(jìn)行篩選。b.生長(zhǎng)8-10天，ELISA檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞孔中上清IgG含量，選擇高表達(dá)孔細(xì)胞繼續(xù)傳代，G418保持濃度是100 u g/ml。c.傳至6孔板繼續(xù)檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)上清IgG含量。d.傳至T25瓶中檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)上清IgG含量，選擇幾株持續(xù)高表達(dá)細(xì)胞凍存。實(shí)施例5 AAV-2G12在SCID小鼠體內(nèi)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)I.疫苗免疫和分組12只8周齡SCID雌性小鼠隨機(jī)分成2組，第I組PBS對(duì)照組，3只，與實(shí)驗(yàn)組相同的免疫時(shí)間點(diǎn)，肌肉注射200 u I無(wú)菌PBS ;第2組rAAV2/l空病毒對(duì)照組，3只，與實(shí)驗(yàn)組相同的免疫時(shí)間點(diǎn)，肌肉注射200 ill rAAV2/l空病毒；第3組:AAV_2G12病毒免疫組，6只，于實(shí)驗(yàn)開始的0周肌肉注射200 u I純化的AAV-2G12病毒載體，所用AAV劑量為2 X IO1Vg/只。2.雙抗體ELISA法測(cè)定SCID小鼠血清中人IgG量及其中和活性方法見實(shí)施例2 :雙抗體ELISA法定量測(cè)定人IgG含量的方法。AAV-2G12注射2周就可以檢測(cè)到抗體2G12的表達(dá)，2G12在體內(nèi)的表達(dá)一直在增力口，到48周時(shí)仍在高效的表達(dá)，而且表達(dá)越來(lái)越高。(結(jié)果參見表二、圖5)將SCID小鼠血清中的IgG進(jìn)行純化，純化后IgG對(duì)HIV-I假病毒有較好的中和活性，SCID小鼠血清的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明2G12-AAV/eLcH在動(dòng)物體內(nèi)不僅能夠高效長(zhǎng)期的表達(dá)2G12，而且表達(dá)的2G12具有中和活性，說(shuō)明本發(fā)明建立了 AAV表達(dá)人抗體全基因的技術(shù)
Tno表二
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)人抗體全基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，其特征在于，利用AAV2/1穿梭表達(dá)載體PSNAV構(gòu)建而成。
2.如權(quán)利要求I所述的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，其特征在于該載體的ITR之間的序列為5 ‘-ITR-promoterl-murine IgGl signal peptide-L chain-promoter2_murineIgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR。
3.如權(quán)利要求1、2所述的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，其特征在于在pSNAV的基礎(chǔ)上具有 5 ‘-ITR-promoterl -murine IgGl signal peptide-L chain-promoter2_murineIgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR-Ampicillin resistance-ColE ori_SV40啟動(dòng)子-neo-SV40 Ploy A的基因結(jié)構(gòu)單元。
4.如權(quán)利要求2或3所述的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，其特征在于所述的promoter I 為hEF_l a promoter ;所述的 promoter2 為 hCMV IE promoter。
5.如權(quán)利要求1-4所述的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，其特征在于，該載體為pSNAV/eLcH，所表達(dá)的抗體為HIV人中和抗體2G12全基因。
6.—種構(gòu)建表達(dá)人抗體全基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體的方法，其具體構(gòu)建方法為 1)通過(guò)PCR的方法改造pSNAV載體，并在載體pSNAV的多克隆位點(diǎn)插入linker； 2)利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增出 hEF-1 a promoter、murine IgGl signal peptide、目的抗體的輕鏈、hCMV IE promoter、murine IgGl signal peptide、目的蛋白的重鏈、SV40 polyA等基因結(jié)構(gòu)單兀； 3)利用酶切位點(diǎn)將步驟2)中各結(jié)構(gòu)單元順次連接，克隆到改造好的pSNAV 載體的多克隆位點(diǎn)中，形成 5 ‘-ITR-promoterl-murine IgGl signalpeptide-Lchain-promoter2-murine IgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR 的基因結(jié)構(gòu)單元； 4)即得到重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟4)中所述的載體為權(quán)利要求5所述的pSNAV/eLcHo
全文摘要
本發(fā)明涉及分子藥物和基因治療領(lǐng)域，具體而言，利用AAV2/1穿梭表達(dá)載體pSNAV構(gòu)建高效表達(dá)人抗體全基因的AAV載體表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)不僅在細(xì)胞水平有很好表達(dá)抗體的效果，同時(shí)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)也能夠長(zhǎng)期高效的表達(dá)，本發(fā)明為AAV載體表達(dá)抗體全基因在抗體治療、高產(chǎn)細(xì)胞株等方面提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12N15/864GK102634542SQ20121010694
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者余雙慶, 馮霞, 周玉柏, 曾毅, 管永軍, 賈潤(rùn)清 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué), 曾毅, 管永軍, 賈潤(rùn)清